本发明属于植物提取领域，具体而言，涉及一种预防和治疗Ⅱ型糖尿病及其并发症的猴果树叶与树皮乙醇提取物的制备及其应用。
背景技术：
：糖尿病是由于胰岛素分泌不足或胰岛素功能不足导致的碳水化合物、脂肪与蛋白质代谢紊乱引起的血糖值高的疾病。糖尿病是常见的代谢紊乱疾病，全世界有2.8%的人患有此类疾病，到2025年这一比值将会达到5.4%。糖尿病患者当中有90-95%的病人为II型糖尿病。II型糖尿病的流行是与肥胖紧密相关，根据世界健康组织（WHO）统计，在2009年患病人数多于2.2亿，经预测，到2030年患病人数会升至3.5亿。I型糖尿病是由于胰脏的β-细胞不能产生胰岛素导致的，而Ⅱ型糖尿病则是由于胰岛素抵抗或β-细胞功能障碍引起的。I型糖尿病患者治疗方法只能用胰岛素，而Ⅱ型糖尿病患者治疗方法除利用胰岛素外还有主要的四种药物：用于刺激胰脏分泌胰岛素的药物如磺酰脲类药、快速促胰岛素分泌的药物格列本脲、格列甲嗪、瑞格列奈，用于降低肝葡萄糖合成的药物双胍类如甲福明二甲双胍，用于延缓碳水化合物在肠内消化吸收的药物α-葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖，用于提高胰岛素活性的药物噻唑烷二酮类如匹格列酮、罗西格列酮。上述药物都有不同程度的副反应。由于这些药物的副反应限制了降糖药物的应用，因此急需找到糖尿病治疗的其他合适的方法，最近几十年，草药领域越来越被重视，利用天然产物治疗糖尿病的需求越来越大，研究表明世界上已有超过400种植物具有抗糖尿病活性。猴果（AnisophyllealaurinaR.Br.exSabine），Anisophylleaceae科，在西非广泛种植，树高5-16米，通常被称为猴果。在西非当地被用来作为传统药物，但是，猴果作为抗糖尿病的药物的研究还没有报道，因此需要做体内与体外抗糖尿病试验为猴果降血糖功能提供理论依据，对研发廉价质优的天然产物药物代替价格高、副作用多的合成抗糖尿病药物具有重要意义。技术实现要素：鉴于现有研究不足，本发明的目的在于通过对猴果树叶与树皮提取物的体外试验与动物试验研究，提供一种预防和治疗Ⅱ型糖尿病及并发症的猴果树叶与树皮提取物及其应用。本发明的目的是这样实现的：一种抗Ⅱ型糖尿病及并发症的猴果树叶与树皮乙醇提取物，在制备抗高血糖药物中的应用。一种抗Ⅱ型糖尿病及并发症的猴果树叶与树皮乙醇提取物，在制备抗高血糖并发症药物中的应用。所述的猴果树叶乙醇提取物由如下方法制备得到的：收集猴果新鲜的树叶与树皮，晒干、研磨后，取20g干粉放入100ml80%的乙醇中，于搅拌速度280rpm，提取温度为28℃，避光条件下提取3天，提取液过滤，60℃蒸发浓缩后冻干，4℃保存备用。所述的猴果树皮乙醇提取物由如下方法制备得到的：收集猴果新鲜的树叶与树皮，晒干、研磨后，取20g干粉放入100ml80%的乙醇中，于搅拌速度280rpm，提取温度为28℃，避光条件下提取3天，提取液过滤，60℃蒸发浓缩后冻干，4℃保存备用。所述的抗Ⅱ型糖尿病的药物包括上述提取物和药学上可以接受的载体或常规副食。所述的抗Ⅱ型糖尿病并发症的药物包括上述提取物和药学上可以接受的载体或常规副食。有益效果]与现有技术相比，本发明有以下有益的技术效果：猴果树叶与树皮乙醇提取物对于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有明显的抑制效果，能够控制Ⅱ型糖尿病病人的餐后血糖升高速度，对糖尿病代谢相关信号通路靶点PTP-1B、TCPTP、SHP-1、SHP-2有显著的抑制作用，减少糖尿病人高糖产生的脑血管损伤，并且可以控制糖尿病病人体重减轻程度、减少血浆中血脂胆固醇水平和甘油三酯水平，防止动脉硬化、冠心病等疾病的发生，并且可以减少糖尿病对肝功能、肾功能的损伤，因此猴果树叶与树皮乙醇提取物对开发治疗Ⅱ型糖尿病及其并发症的药物具有潜在价值。【具体实施方式】以下结合实例，对本发明提供的具体实施方式详述如下：实施例1:猴果树叶与树皮乙醇提取物抗糖尿病体外试验猴果树叶与树皮乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果试验猴果树叶与树皮乙醇提取物处理：称取猴果树叶与树皮乙醇提取物溶解于二甲基亚砜（DMSO(v/v1:1)）中制成0-4mg/ml浓度的溶液备用。取上述各浓度溶液50μl于96孔酶标板中，向试管中加入含有1.0U/mlα-葡萄糖苷酶（溶解于0.1M，pH为6.9磷酸缓冲液）溶液100μl，于25℃孵育10min，再次加入5mM的硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（溶解于0.1M，pH为6.9磷酸缓冲液）溶液50μl于25℃孵育10min，在504nm测定吸光度。三次平行，空白对照组为缓冲溶液代替α-淀粉酶溶液，其他条件不变。质控组为缓冲溶液代替猴果树叶与树皮乙醇提取物溶液，其他条件不变。抑制率计算公式：抑制率（%）={(Ac–Ae)/Ac}100其中Ac为质控组吸光度，Ae为猴果树叶与树皮乙醇提取物吸光度猴果树叶与树皮乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制结果：猴果树叶与树皮乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶具有抑制，具有抗糖尿病活性，其结果如表1、表2所示：表1猴果树叶乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果猴果树树叶提取物浓度（mg/ml）葡萄糖苷酶抑制率（%）阿卡波糖抑制率（%）0.812.3331.91.632.3648.42.457.6360.13.268.1774.25478.284.3表2猴果树皮乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果猴果树树皮提取物浓度（mg/ml）葡萄糖苷酶抑制率（%）阿卡波糖抑制率（%）0.822.1331.91.623.3648.42.447.6360.13.260.1774.25468.2184.3猴果树叶与树皮乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制效果试验猴果树叶与树皮乙醇提取物处理：称取猴果树叶与树皮乙醇提取物溶解于二甲基亚砜（DMSO(v/v1:1)）中制成0-4mg/ml浓度的溶液备用。取上述各浓度溶液500μl于试管中，向试管中加入含有0.5mg/mlα-淀粉酶（溶解于0.02M，pH为6.9磷酸缓冲液）溶液500μl，于25℃孵育10min，再次加入1%（溶解于0.02M，pH为6.9磷酸缓冲液）淀粉溶液500μl，于25℃孵育10min，加入显色剂终止反应。将试管置于沸水中加热5min后冷却至室温，向试管中加入15ml蒸馏水稀释后于540nm测定吸光度。三次平行，空白对照组为缓冲溶液代替α-淀粉酶溶液，其他条件不变。质控组为缓冲溶液代替猴果树叶与树皮乙醇提取物溶液，其他条件不变。抑制率计算公式：抑制率（%）={(Ac–Ae)/Ac}100其中Ac为质控组吸光度，Ae为猴果树叶与树皮乙醇提取物吸光度猴果树叶与树皮乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制结果：猴果树叶与树皮乙醇提取物对α-淀粉酶具有抑制效果，具有抗Ⅱ型糖尿病活性，其结果如表3、表4所示：猴果树树叶提取物浓度（mg/ml）淀粉酶抑制率（%）阿卡波糖抑制率（%）0.823.324.51.629.6738.72.440.4954.13.248.8763.5452.6278.3表3猴果树叶乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制效果表4猴果树皮乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制效果猴果树树皮提取物浓度（mg/ml）淀粉酶抑制率（%）阿卡波糖抑制率（%）0.83.524.51.619.8338.72.423.4854.13.238.3963.5458.378.3猴果树叶与树皮乙醇提取物对糖尿病代谢相关信号通路中酶的抑制活性试验肝脏胰岛素抵抗主要是指胰岛素抑制肝脏葡萄糖输出的能力下降，肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官，维持空腹状态下的内生性糖的产生和输出及进食后糖的吸收、利用和存储。PTP-1B是胰岛素信号转导通路中的关键的负调节蛋白，PTP-1B抑制剂通过阻断胰岛素刺激的胰岛素受体（IR）的酪氨酸磷酸化，进而影响胰岛素受体（IRS-1）的磷酸化，使类胰岛素和胰岛素增敏，降低血糖。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)能广泛影响细胞增殖、分化、迁移、凋亡及免疫应答等过程。许多疾病诸如糖尿病、癌症、肥胖、类风湿和免疫功能紊乱等都与PTPs的异常表达有关。有效抑制PTPs的活性能够提高细胞磷酸化水平，调节细胞信号转导。T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶（TCPTP）是一种胞内非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，TCPTP与PTP1B高度同源，尤其是活性位点同源性更高达94%。SHP-1(SH2ContainingTyrosinePhosphatase1)，是含有SH2结构域的具有高度保守序列的蛋白质酪氨酸磷酸酶的亚家族中的重要成员。SHP-1与Ⅱ型糖尿病的发生有关，SHP-1活力的下降或丢失会提高胰岛素灵敏性及葡萄糖耐受性，即SHP-1在调节血糖代谢方面有重要作用，通过抑制体内SHP-1的活性，能增强免疫力并且降低糖尿病患者的血糖。糖尿病的慢性并发症常见的有糖尿病心脑血管病变，脑血管病变是老年患者极易出现的一种并发症。神经细胞对葡萄糖的摄取主要依赖外界葡萄糖的浓度，不受胰岛素调控，血脑屏障是脑内组织获取葡萄糖的唯一调控因素。持续高糖能降低血液携氧能力、损伤血脑屏障、增加线粒体的氧化应激产生氧自由基。缺氧与氧化应激导致蛋白激酶C(PKC)信号通路激活，从而激活SHP-2磷酸化，激活的SHP-2参与调控血脑屏障蛋白的表达、改变血脑屏障通透性，导致糖尿病人脑血管病并发症的发生。由此SHP-2抑制剂可以有效降低糖尿病患者的脑血管并发症的发生。猴果树叶和树皮乙醇提取物对糖尿病代谢相关信号通路靶点PTP-1B、TCPTP、SHP-1、SHP-2有显著的抑制作用，并与用于纠正蛋白代谢障碍的药物齐墩果酸、Na3VO4相比，具有更好的作用效果，其结果如表5所示：表5：猴果树叶与树皮乙醇提取物对PTP-1B、TCPTP、SHP-1、SHP-2的抑制作用实施例2:猴果树叶与树皮乙醇提取物抗糖尿病体内试验实验动物为4-6周成年的老鼠，雌雄各半，体重为150g-200g，饲养条件为12h灯光照射、12h避光，饲养温度为25±3°C、湿度为35%-60%控制饮食，饲养一周内记录血糖和体重。糖尿病小鼠处理：注射60mg/kg的链脲霉素诱导糖尿病的发生。实验动物分组：1组为正常小鼠：只注射生理盐水的正常小鼠为对照组，注射量为5ml/kg；2组为质控组：只注射生理盐水的经诱导获得糖尿病的小鼠，注射量为5ml/kg；3组为格列本脲组：用格列本脲治疗的糖尿病小鼠组，使用量为5mg/kg；4组为猴果树叶体内试验组：喂食猴果树叶乙醇提取物，使用量为300mg/kg；5组为猴果树皮体内试验组：喂食猴果树皮乙醇提取物，使用量为500mg/kg；每组均有6只小鼠，饲养21天后，取血和组织进行检测。血糖测定：采用ACCUCHECK血糖仪进行测定组织与血液采集：实验动物在乙醚麻醉条件下处死，迅速取下肝脏和胰脏与-20℃条件下保存，采集心脏血放于有EDTA(2mg/mL)的试管中，分析血浆中脂质与其他生化参数，所有的分析需在48h内完成。猴果树叶与树皮抗糖尿病体内试验结果：如表6所示为猴果树叶与树皮提取物对糖尿病小鼠体重的影响，猴果树叶与树皮提取物减少糖尿病小鼠体重减少的情况与健康对照组和格列本脲治疗组的小鼠体重相比均有减少，但是与糖尿病组相比体重减少的程度比较轻，说明猴果树叶与树皮乙醇提取物可以改善糖尿病小鼠的体重减少情况。表6：猴果树叶与树皮乙醇提取物对糖尿病小鼠体重影响结果如表7所示为猴果树叶与树皮提取物对糖尿病小鼠血糖的影响，猴果树叶与树皮乙醇提取物对糖尿病小鼠血糖降低有明显效果。其效果与格列本脲效果几乎相同，并且实验组小鼠血糖水平比糖尿病对照组低，由此可知猴果树叶与树皮乙醇提取物可以降低糖尿病的血糖升高水平。表7：猴果树叶与树皮乙醇提取物对糖尿病小鼠血糖影响结果糖尿病病人血浆胆固醇、甘油三酯值偏高和高密度脂蛋白胆固醇的减少是引发糖尿病并发症如血管病变动脉硬化和冠心病等的因素之一。糖尿病小鼠血浆脂类偏高是由于自由脂肪酸从外围脂肪组织流动性偏高，因为胰岛素能够抑制荷尔蒙以来的脂肪分解酶的活性，糖尿病病人胰岛素减少或胰岛素抵抗可能是引起血脂异常的原因。如表8所示猴果的树叶与树皮乙醇提取物可以有效地的控制糖尿病小鼠血脂水平。在糖尿病组小鼠中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、超低密度值蛋白水平增加，高密度脂蛋白胆固醇降低。标准对照组和猴果树叶与树皮乙醇提取物组血浆胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和超低密度脂蛋白明显降低而高密度脂蛋白胆固醇明显增加。这表明猴果树叶和树皮乙醇提取物不仅可以控制血糖，并且抑制胆固醇合成路径，肝脏低密度脂蛋白受体将低密度脂蛋白带入肝脏，减少其在血浆中的水平，增加高密度脂质蛋白与低密度脂质蛋白的比值，从而减少糖尿病心血管并发症的发生。表8：猴果树叶与树皮乙醇提取物对糖尿病小鼠血脂影响结果糖尿病中胆固醇和脂质代谢紊乱导致动脉硬化和冠心病等疾病，这些疾病导致血浆中转氨酶类增加，转氨酶是心脏和损伤的特异性指标。临床发现糖尿病病人出现肝坏死的并发症，因此，本发明中采用链脲霉素诱导糖尿病小鼠导致肝损伤而引起丙氨酸氨基转移酶（ALT），天门冬氨酸氨基转移酶（AST），和碱性磷酸酶（ALP）活性的升高。同时，肌氨酸酐、尿素、总蛋白含量为肾功能特异性指标。本发明通过测定上述指标，评价猴果树叶与树皮乙醇提取物对糖尿病人肝肾功能的影响。如表9所示，猴果树叶与树皮乙醇提取物喂养的糖尿病小鼠氨基转移酶水平明显降低，肌氨酸酐和尿素含量与糖尿病组相比降低，总蛋白含量与正常组无差别。由此可知猴果的树叶与树皮乙醇提取物对糖尿病人的肝肾并发症具有一定的疗效。表9：猴果树叶与树皮乙醇提取物对糖尿病小鼠肝肾功能的影响当前第1页1 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