[0055] 高频（Highfrequency,HF):为高频分量曲线（中心频率位于0· 15Ηζ_0· 4Hz)的 积分值，也就是高频分量曲线与横轴所夹面积，单位为ms2。
[0056] 低频/高频（LF/HF):低频与高频功率的比值，说明交感神经张力与迷走神经张力 的平衡。
[0057] 7.动脉血压压力反射敏感性（baroreflexsensitivity,BRS)。
[0058] 用Harverd输液栗静脉注射去氧肾上腺素（5mg/kg)，升高血压（刺激动脉压力感 受器），心率则反射性减慢。连续监测各组大鼠血压及心电图R-R间期（心动周期）变化， 以动脉收缩血压升高变化为横座标，跟随血压变化的反射性延长的R-R间期为纵座标，对 两者进行直线回归分析。一般两者之间呈直线关系，回归直线的斜率即为动脉压力感受性 反射敏感性。其意义为动脉血压每升高0. 13kPa(lmmHg)时，对应反射性R-R间期延长的毫 秒数，以ms/mmHg表示。斜率大，提示迷走神经反射性增强；斜率小，提示迷走神经反射性减 弱，反映交感神经活性增强。
[0059] 8.酶联免疫吸附剂测定（ELISA)法实验。
[0060] 1)样本准备：第5周末和第8周末，收集血清，-80°C保存；
[0061] 2)实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温（20-25Γ);
[0062] 3)取出所需数量的板条，其余密封放回4°C;
[0063] 4)建立标准曲线：标准孔8孔，设3复孔，每孔中各加入样品稀释液100μ1，第一 孔加标准品100μ1，混匀后用加样器吸出100μ1，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第 七孔，最后，从第七孔中吸出100μ1弃去，使之体积均为100μ1。第八孔为空白对照；
[0064] 5)加样：待测品孔中每孔各加入待测样品100μ1;
[0065] 6)将反应板置37°C120分钟；
[0066] 7)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4_6次，向滤纸上印干；
[0067] 8)每孔中加入第一抗体工作液50μ1;
[0068] 9)将反应板充分混匀后置37°C60分钟；
[0069] 10)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；
[0070] 11)每孔加酶标抗体工作液100μ1 ;
[0071] 12)将反应板置37°C60分钟；
[0072] 13)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；
[0073]14)每孔加入底物液100μ1，置37 °C暗处反应5分钟；
[0074] 15)每孔加入50μ1终止液混匀；
[0075] 16)在450nm处侧吸光值（应尽快，时间过长可能导致本底偏高）。
[0076] 9.氧化应激指标的测定。
[0077]1)丙二醛（MDA)测定：向有盖离心管（5ml)分别加入0· 05ml标准品（10nmol/ml)、 无水乙醇和样品，之后加等量试剂一，混匀；加试剂二1. 5ml、试剂三0. 5ml，旋涡混匀器混 匀，95°C水浴40分钟，取出后流水冷却，然后3500转/分，离心10分钟。取上清1ml，532nm 处，lcm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。计算公式：MDA含量（nmol/ml)=(测定管吸 光度-测定空白管吸光度V(标准管吸光度-标准空白管吸光度）X标准品浓度X样本 测试前稀释倍数。
[0078] 2)总一氧化氮合酶（T-N0S)活力测定：测定管加蒸馏水0. 1ml和样品0. 03ml，对 照管加蒸馏水0. 13ml，摇勾；测定管和对照管均加入试剂一 0. 2ml，试剂二0. 01ml，试剂三 0.lml，旋涡混匀器充分混匀，置37°C恒温水浴15分钟；每管加入试剂试剂四0.lml和试剂 五2ml，旋涡混匀器充分混匀，于波长530nm处，lcm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。计 算公式：T-N0S活力（U/ml)=(测定管吸光度-空白管吸光度）/呈色物纳摩尔消光系数X 反应体系总体积/取样量X1/比色光径X反应时间X1/1000,呈色物纳摩尔消光系数取 38. 3X10 6〇
[0079] 3)谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX)活性测定：测定管和对照管分别lmmol/L还原 型谷胱甘肽（GSH) 0. 2ml，试剂一 0.lml，37 °C预温5分钟；加入样品/蒸馏水0. 2ml，37 °C准 确反应5分钟；试剂二2ml，用旋涡混匀器充分混匀，4000转/分，离心10分钟，取上清lml 做显色反应。空白管加还原型谷胱甘肽标准品溶剂应用液lml、标准管加20ymol/L还原 型谷胱甘肽标准液lml、对照管和测定管均加上清液lml，以上四管均加入试剂三lml，试剂 四0. 25ml，试剂五0. 05ml，混匀，室温放置15分钟，于波长412nm处，lcm光径比色杯，蒸馏 水调零，测各管吸光度值。计算公式：GSH-PX活力（U/ml)=(对照管吸光度-测定管吸光 度V(标准管吸光度-空白管吸光度）X标准品浓度X稀释倍数X样本测试前稀释倍数。 标准管浓度取20μmol/L，稀释倍数为6。
[0080]10.免疫荧光双标法。
[0081] 1)取出大鼠颈上交感神经节的冰冻切片恢复室温后，用0.1MPBS洗3次，5min/ 次，4%多聚甲醛室温预固定15min;
[0082] 2) 0. 1MPBS洗3次，5min/次；山羊血清封闭液37°C孵育lh;
[0083]3)加入兔来源1:100稀释的缝隙连接半通道蛋白1 (Pannexin-1)、胰岛素受体底 物1 (IRS1) -抗和小鼠来源1:100稀释的NeuN-抗，37°C水浴孵育2h;
[0084] 4) 0· 1MPBS洗 3 次，5min/ 次；
[0085] 5)加入羊抗兔来源的FITC标记1:200稀释的二抗和羊抗小鼠来源的TRITC标记 1:200稀释的二抗，避光37°C水浴孵育45min，避光；
[0086] 6) 0· 1MPBS洗3次，5min/次；
[0087] 7)荧光封片剂封片，避光。荧光显微镜下拍照，分析结果。
[0088] 11.实时定量聚合酶链式反应（Real-timePCR)技术。
[0089] 1)总RNA的提取。
[0090]a)第8周末实验结束时，取出颈上交感神经节放入用DEPC处理过的PBS中清洗；
[0091] b)再分别转移到用DEPC处理过的勾衆器，加入1ml的Trizol充分研磨；
[0092] c)将匀浆样品在室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
[0093] d)每管加入0. 2ml氯仿充分混匀后，冰浴15分钟；
[0094]e)4°C离心12000gX15min,可见管中的液体分为上（无色液相含总RNA)、中（白 色乳状含蛋白质）和下（红色含DNA)三相；
[0095] f)将上层液相移入另一经DEPC水处理的1. 5ml的EP管中，加等体积异丙醇，颠倒 混匀数次，置_20°C约20分钟，沉淀RNA;
[0096]g)4°C离心12000gX15min，弃上清，管底可见少许白色沉淀物（为RNA);
[0097]h)每管加75%乙醇1ml，充分洗涤RNA沉淀，4°C离心10000gX15min，弃上清X2 次；
[0098]i)弃上清液，静置10分钟，使之干燥，加50μ1无RNase水重悬沉淀，取20μ1RNA 用于定量和纯度检测，余下_20°C保存。
[0099] 2)总RNA的鉴定。
[0100]a)分光光度仪检测（RNA浓度、纯度测定）：用0. 1 %DEPC水给比色仪调零，取2μ1RNA样品，用98μ1 0· 1 %DEPC水稀释50倍后，测RNA样品的0D260nm和0D280nm，按以 下公式计算RNA浓度和纯度：
[0101] RNA浓度Ug/μ1) = 0D260nmX50X0. 04
[0102] RNA纯度=0D260nm/0D280nm
[0103] 比值接近或大于1. 8,说明RNA纯度较高，没有蛋白质的残余；比值小于1. 6,说明 RNA样品中有蛋白质、酚等污染；
[0104] b)甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量：配制1 %甲醛变性胶一取RNA样品5μ1与 RNA上样缓冲液1 :1混匀后，65°C水浴变性5min-在1XM0PS电泳缓冲液中电泳至满意为 止（50V)，紫外灯下观察，可见28S、18S、5S三条带。
[0105] 3)实时定量聚合酶链式反应（Real-timePCR)。
[0106]a)cDNA合成：建立 20μ1 逆转录反应体系：5XReactionmix4μ1，Maxima enzymemix2μ1，TemplateRNA1μ1 (5μg)，Nuclease-freewater13μ1，PCR仪逆车专录 30min；
[0107] b)引物序列：
[0108]
[0110]c)Real-timePCR检测，20μ1 体系：PowerSYBK:⑩GreenPCRMasterMix 10μ1，10μM上下游引物各 1μl，cDNAlμ1，Nuclease-freewater定容至 20μ1。混勾， 置于ΑΒΙ7500PCR仪，采用SYBR-green法进行测定。反应条件为95°C10min、95°C15sec、 60°Clmin、40循环。并通过分析产物的溶解曲线来确定扩增的特异性。
[0111] 12.蛋白印迹。
[0112] 1)蛋白样品制备。
[0113]a)取各组大鼠颈上交感神经节放入预冷的0. 1MPBS洗3次；
[0114]b)将组织加入400μ1含PMSF去污剂裂液的匀浆器中，冰上研磨，使组织尽量碾 碎，冰上裂解lh;
[0115]c)将裂解液移至L5mlEP管中，4°C，12000rpm，离心lOmin，取上清于(λ5mlEP 管中，加入5Xloadingbuffer，再加10%DTT，沸水煮5min，分装，并置于-20°C保存。
[0116] 2)SDS_PAGE凝胶。
[0117]a)5%或 10%分离胶 10ml:
[0121 ] 3)上样及进行SDS-PAGE蛋白分离电泳。
[0122] a)加入5X凝胶上样缓冲液，再加10%DTT，95°C煮5min，使蛋白变性，电泳前进 行上样；
[0123]b)进行SDS-PAGE蛋白分离电泳，浓缩胶90V，30min，分离胶120V，50min，待溴酸蓝 迀移至分离胶底部，停止电泳。
[0124] 4)转膜：稳流 300mA转膜 90min。
[0125] 5)免疫学检测。
[0126]a)转膜后，用TBST洗膜lOmin;
[0127]b)封闭：用5%脱脂奶粉封闭液（TBST配制），室温封闭，平摇lh;
[0128] c)加入兔来源的Pannexin-1、IRS1、p-IRSlser302 -抗（1:1000)或小鼠来源的 β-actin-抗（1:1000):用封闭液稀释抗体至工作浓度，总体积为3~5ml。4°C过夜；
[0129] d)TBST洗膜3次，lOmin/次，平摇；加入山羊抗兔来源的二抗或者山羊抗小鼠来源 的二抗：将二抗工作液（用封闭液以1:5000稀释），室温平摇孵育lh;
[0130]e)TBST洗膜4次，lOmin/次，平摇；免疫复合物的检测：膜在ECL中反应5min，暗 室曝光、显影和定影。
[0131] 6)光密度分析：通过Image-ProPlus图像分析系统分析目的条带在X光胶片测 得的光密度值，以各组β-actin条带的0D值标化其蛋白的表达量。
[0132] 13.