专利名称：编码骨形态形成蛋白受体的脱氧核糖核酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及骨形成和发育领域，更具体地，本发明涉及骨形态形成蛋白(BMP)受体及编码该受体的DNA序列。
背景技术：
人和其他温血动物会受到许多骨相关疾病的困扰。这些疾病包括从骨折到衰弱性疾病如骨质疏松症等许多种类。尽管在健康的个体中，骨生长一般是正常地进行而且骨折的愈合也不需要药物介入，但是在某些情况下骨会衰弱或者不能正常愈合。例如，在老年人和用皮质类固醇治疗的病人(如移植病人)中，骨愈合进行得很缓慢。骨质疏松症是一种与新骨硬组织的发育相比，病人骨硬组织不成比例地丧失所导致的病症。骨质疏松症可定义为骨数量的减少、或骨骼组织髓的萎缩和骨间隙变大、纤维性结合减少和密质骨变脆。另一种骨相关疾病是骨关节炎，这是活动关节的一种病症，其特征是关节软骨的退化和磨损以及在关节表面形成新骨。
尽管对于这些骨相关疾病有各种治疗方法，但是没有一种治疗能提供最佳的效果。治疗骨相关疾病的人们所遇到的困难之一是没有完全了解骨代谢和没有完全了解骨相关疾病。这种了解的一个关键问题是确定并定性骨生长所涉及的各种因子。已表明，骨形态形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在骨形成和发育中起重要作用(Wozney，J.M.，Molec Reproduct.and Develop.32160-167(1992))。
此外，BMP的作用可能并不局限于在骨中作用。已发现BMP在其他组织如脑和肾中的浓度较高(Wall，N.A.，Blessing.M.，Wright.C.V.E.，and Hogan.B.L.M.，J.Cell Biol.，120 493-502(1993).Ozkaynak.E.，Schnegelsberg，P.N.J.，Jin.D.F.，Clifford.G.M.，Warren.F.D.，Drier，E.A.，and Oppermann，H.，J.Biol Chem.，26725220-25227(1992)。Lyons.K.M.，Jones，C.M.，and Hogan，B.L.M.，Trends in Genetics.7408-412(1991))，该发现暗示它们可能在发育和分化中也起作用。支持该观点的证据有，最近发现BMP能促进神经细胞的分化(Basler.K.，Edlund，T.，Jessell.T.M.，and Yamada.T.，Cell 73687-702(1993)；Paralkar，V.M.，Weeks.B.S.，Yu.Y.M.Klein-man.H.K.，and Reddi.A.H.，J.Cell Biol.，1191721-1728(1992))。
BMP是通过结合于BMP应答细胞膜上表达的特异BMP受体而发挥其生物效应。受体是一种蛋白质，通常横跨细胞膜，它与细胞外的配体结合，结合后将一个信号传入细胞内部，从而改变细胞功能。在这种情况下，配体是蛋白质BMP，而信号则诱导细胞分化产生软骨和骨。
因为BMP受体能特异地结合BMP，所以纯化的BMP受体组合物可用于BMP的诊断分析，以及产生可用于诊断和治疗的、针对BMP受体的抗体。此外，纯化的BMP受体组合物可直接用于治疗以结合或清除BMP，从而提供一种调节BMP的骨形成和发育活性的手段。为了研究BMP受体的结构和生物特性以及在骨生长/形成刺激过程的各种细胞群对BMP的应答中BMP所起的作用、或者为了在治疗、诊断或分析中有效地使用BMP受体，都需要纯化的BMP受体组合物。然而，在实践中这种组合物只有用重组DNA技术，通过克隆和表达编码该受体的基因才能获得。为了用于生物化学分析或为了克隆和表达编码BMP受体的哺乳动物基因而进行的纯化BMP受体的努力，都因为缺乏合适的受体蛋白质或mRNA而受阻碍。在本发明之前，已知没有细胞系可以组成型地和持续地高水平表达BMP受体，从而不可能纯化BMP受体用于蛋白质测序或构建基因文库用于直接表达克隆。得到BMP受体的序列，便能够产生高表达水平重组BMP受体的细胞系，从而可以用于生物化学分析和筛选试验。
综上所述，迫切需要获得BMP受体的DNA序列以及分离的、由该序列编码的BMP受体蛋白。
发明目的本发明的一个目的是提供分离的BMP受体激酶蛋白。
本发明的另一个目的是提供编码BMP受体激酶蛋白的DNA序列。
本发明的另一个目的是提供编码BMP受体激酶蛋白的重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供含有编码BMP受体激酶蛋白的重组表达载体的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供产生BMP受体激酶蛋白的方法。
本发明的另一个目的是提供鉴别能结合BMP受体激酶蛋白的化合物的方法。
本发明的另一个目的是提供测定样品中能结合BMP受体激酶蛋白的化合物的数量的方法。
本发明的另一个目的是提供对BMP受体蛋白特异的抗体以及产生该抗体的方法。发明概述本发明涉及分离的BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段、编码该BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段的DNA序列、含有该DNA序列的重组表达载体、含有该重组表达载体的宿主细胞、表达该BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段的方法、鉴别能结合该受体激酶蛋白的化合物的方法、测定该化合物在样品中的数量的方法、以及针对该BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段的抗体。
附图简述
图1是在BRK-1的PCR扩增中所用的简并寡核苷酸引物的DNA序列。核苷酸碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤和次黄苷分别用单字符A、T、C、G和I表示。ACT1A和ACT1B是一套简并3′PCR引物。ACT2A和ACT2B是一套简并5′PCR引物。
图2是蛋白质序列的排列图，比较了激酶结构域t-BRK-1和BRK-1与TGF-β受体家族的其他成员DAF1，来自C.elegans(Georgi.，L.L.，Albert，P.S.，and Riddle.D.L.Cell 61635-645(1990))；MACT，II型鼠活化素(activin)受体(Mathews.，L.S.and Vale W.W.，Cell 65973-982(1991))；RTGFBR2，II型鼠TGF-β受体(Tsuchida.K.，Lewis，K.A.，Mathew，L.S.，and Vale W.W.Biochem.Biophys.Res Commun.，191790-795(1993))；MACTR1，I型鼠活化素受体(Ebner，R.，Chen，R.H.，Shum，L.，Lawler，S.，Zioncheck，T.F.，Lee.A.，Lopez，A.R.，and Derynck，R.，Science 2601344-1348(1993))；R3、R2和R4，来自大鼠未知配体的I型受体(He，W.W.，Gustafson，M.L.，Hirobe，S.，and Donahoe，P.K.，Develop.Dynamics.196133-142(1993))。括号表示带有完整激酶结构域的预计的激酶终止区域。
图3显示了用于在哺乳动物细胞中表达BRK-1的构建物pJT4-J159F。CMV，巨细胞病毒早期启动子/增强子；R，来自人T-细胞白血病病毒-1长末端重复序列的“R”元件；SP，SV40病毒的内含子拼接位点；T3，来自T3噬菌体的启动子；T7，来自T7噬菌体的启动子区域；poly A，来自SV40病毒指导信使RNA聚腺苷酸化的区域；SV40 ORI，SV40病毒的复制起点；Amp，用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性基因。
图4显示了用于在哺乳动物细胞中表达t-BRK-1的构建物pJT6-J159T。缩写字母同图3。
图5显示了[125I]-BMP-4与通过构建物pJT4-J159F用BRK-1 cDNA转染的COS-7细胞的结合情况。[125I]-BMP-4的浓度为100pM。
图6显示了放射性标记的BMP与用BRK-1 cDNA转染的COS-7细胞的交联情况。图6A，[125I]-BMP-4与BRK-1的交联情况。左侧的电泳道通过构建物pJT4-J159F用BRK-1 cDNA转染的COS-7细胞；不存在(-)或存在(+)10nM未标记BMP-2时的交联情况。右侧的电泳道假转染(模拟转染)的COS-7细胞；不存在(-)或存在(+)10nM未标记BMP-2时的交联情况。图6B，[125I]-DR-BMP-2与BRK-1的交联情况。左侧的电泳道通过构建物pJT4-J159F用BRK-1 cDNA转染的COS-7细胞；不存在(-)或存在(+)10nM未标记BMP-2时的交联情况。
图7显示了在COS-7细胞中表达的BRK-1的免疫沉淀及与[125I]-BMP-4的交联情况。带“+”标记的电泳道通过构建物pJT4-J159F用BRK-1 cDNA转染的COS-7细胞。带“-”标记的电泳道，假转染的COS-7细胞。转染后，细胞与[125I]-BMP-4交联，然后用所示的抗血清进行免疫沉淀。左侧的电泳道对胞外结构域(extracellular domain，ECD)特异的抗血清1351；右侧的电泳道对激酶结构域特异的抗血清1378、1379和1380。
发明详述本发明通过提供分离的BMP受体激酶蛋白、编码该蛋白质的DNA序列、含有该DNA序列的重组表达载体、含有该重组表达载体的宿主细胞、表达该BMP受体激酶蛋白的方法以及针对该BMP受体激酶蛋白的抗体，满足了对分离的BMP受体蛋白的需求。
如本文所用，“BMP受体激酶蛋白-1”或“BRK-1”指具有SEQ ID No.4氨基酸序列的蛋白质，以及基本类似SEQ ID No.4氨基酸序列的蛋白质，它们的生物活性在于能与BMP-2和/或BMP-4结合、或者将由BMP-2或BMP-4分子结合而引发的生物信号转换给细胞、或者与针对BRK-1的抗BRK-1抗体发生交叉反应。
如本文所用，“截短的BMP受体激酶蛋白”或“t-BRK-1”指具有SEQ ID No.2氨基酸序列的蛋白质。
如本文所用，当用“基本类似”描述氨基酸或核酸序列时，是指一个特定序列(例如通过诱变而改变的序列)与对照序列相比相差一个或多个取代、缺失或插入，但净效应是保留BRK-1蛋白的生物活性。另外，如果因遗传密码的简并性而使DNA序列编码基本类似于对照氨基酸序列的氨基酸序列，那么核酸亚基和类似物与此处公开的特定DNA序列是“基本类似”的。
如本文所用，“生物活性”是指特定的分子与本发明例子具有足够氨基酸序列相似性，从而能够结合可检测数量的BMP-2或BMP-4，或者将BMP-2或BMP-4的刺激传给细胞(例如作为杂合受体构建物的组份)。较佳地，具有本发明范围内生物活性的BRK-1或t-BRK-1能够以纳摩尔或亚纳摩尔亲和力与[125I]-BMP-4结合(Kd约等于10-9M)。较佳地，按下面实施例10所述的饱和结合测试法测得亲和力从约1×10-10M至约1×10-9M，更佳地，为约5×10-10M。
如本文所用，“可溶性片段”指对应于BRK-1或t-BRK-1的胞外区域的氨基酸序列。可溶性片段包括截短的蛋白质，其中BMP结合所不需要的受体分子区域被删去。本发明的这种可溶性片段的例子包括(但并不限于)氨基酸序列基本类似于SEQ ID No.6、SEQ ID No.2中氨基酸残基1-152、或SEQ ID No.4中氨基酸残基1-152的多肽，或者由基本类似于SEQ ID No.5、SEQ ID No.1中核苷酸291-746、或SEQ ID No.3中核苷酸11-466的核酸残基所编码的多肽。
如本文所用，“部分去除的BMP-2”和“DR-BMP-2”指成熟BMP-2的氨基末端通过适度的胰蛋白酶消化而去除后得到的BMP-2片段。
如本文所用，用“分离的”描述本发明的受体蛋白或编码该蛋白质的DNA序列时，指蛋白质或DNA序列从其天然存在的复杂细胞环境中取出，而且当其可操作地连于合适的调控序列时，该蛋白质可在本来不天然表达的细胞中由该DNA序列表达。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，信号肽(分泌引导物)DNA是可操作地连于多肽DNA，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌引导物则意味着在阅读框中相邻。
如本文所用，“ATCC”指美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Rockville，Maryland)。
如本文所用，“骨形态形成蛋白2”或“BMP-2”指ATCC No.40345中所含的DNA序列编码的肽(参见ATCC/NIH REPOSI-TORY CATALOGUE OF HUMAN AND MOUSE DNAPROBES AND LIBRARIES，sixth Edition，1992，p.57，以下简称“ATCC/NIH REPOSITORY CATALOGUE”)。BMP的分离过程公开于下列专利中，其中每一篇专利都在此引用作为参考美国专利No.5,013,649(Wang，Wozney and Rosen，1991年5月7日授权)；美国专利No.5,166,058(Wang，Wozney and Rosen，1992年11月24日授权)；和美国专利No.5,168,050(Hammonds and Ma-son，1992年12月1日授权)。
如本文所用，“骨形态形成蛋白4”或“BMP-4”指ATCC No.40342中所含的DNA序列编码的肽(参见ATCC/NIH REPOSI-TORY CATALOGUE)。BMP-4的分离过程公开美国专利No.5,013,649(Wang，Wozney and Rosen，1991年5月7日授权)中，该专利在此引用作为参考。
如本文所用，“DNA序列”指DNA聚合物，它处于单独的片段形式或者是较大的DNA构建物的一部分，它衍生自分离过至少一次的DNA并处于基本纯净形式(即基本上不含污染性的外源物质)而且其数量或浓度足以通过标准生物化学方法(例如通过克隆载体)鉴别、操作和回收该序列及其组分核苷酸序列。这种序列较佳地是以开放阅读框架形式提供，不含有通常存在于真核生物基因中的内部不翻译序列(内含子)。也可以使用含有相关序列的基因组DNA。非翻译DNA序列可以位于开放阅读框的5′或3′，不干扰编码区域的操作或表达。本发明提供的编码蛋白质的DNA序列可用cDNA片段和短寡核苷酸接头或用一系列寡核苷酸装配而成，以提供能在重组转译单元中表达的合成基因。
如本文所用，“重组”意味蛋白质衍生自一个在体外操作过并引入宿主生物体的DNA。
如本文所用，“微生物的”指重组蛋白是在细菌或真菌(如酵母)表达系统中生产的。
如本文所用，“重组表达载体”指用于表达编码BRK-1或t-BRK-1的DNA构建物，它含有一个包括下列组成的转译亚单元1)在基因表达中具有调控作用的遗传因子，如启动子和增强子；2)被转录成mRNA和翻译成蛋白质的结构或编码DNA；和3)合适的转录和翻译起始及终止序列。用于真核表达系统(如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)的结构元件最好在蛋白质的N末端含有信号序列，从而能使宿主细胞将翻译的蛋白质转运至细胞膜或进行胞外分泌。或者，当重组蛋白在无信号序列下表达以便表达在细胞内时，可以含有N末端的甲硫氨酸残基。该残基随后被任选地从表达的重组蛋白上切除，获得最终产物。用本领域中公知的方法，可构建本发明的重组表达载体。可用于本发明的载体包括(但并不限于)对于哺乳动物细胞，pJT4(下面进一步描述)，pcDNA-1(Invitrogen，San Diego，Ca)和pSV-SPORT 1(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)；对于昆虫细胞，pBlueBac III或pBlueBacHis杆状病毒载体(Invitrogen，San Diego，CA)；以及对于细菌细胞，pET-3(Novagen，Madi-son，WI)。编码BRK-1或t-BRK-1的DNA序列可位于载体中并可操作地连于调控元件。在本发明的一个例子中，哺乳动物宿主细胞较佳地是用质粒构建物pJT4-J159F转染的，从而导致表达BRK-1。在本发明的另一个例子中，哺乳动物宿主细胞较佳地是用质粒构建物pJT6-J159T转染的，从而导致表达t-BRK-1。可用本领域中公知的方法实现重组分子的转染。
如本文所用，“宿主细胞”指含有本发明的重组表达载体的细胞。宿主细胞可用重组表达质粒稳定地转染或瞬时转染，或者用重组病毒载体感染。宿主细胞包括原核细胞如大肠杆菌，真菌系统如酿酒酵母、无限增殖的昆虫细胞系如SF-9和SF-21，以及无限增殖的哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和SV40转化的非洲绿猴肾细胞(COS)。
在一个例子中，本发明涉及BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段。较佳地，BRK-1蛋白具有SEQ ID No.4氨基酸序列。较佳地，可溶性片段具有SEQ ID No.6氨基酸序列，较佳地，可溶性片段由SEQ ID No.5核酸序列编码。
在另一例子中，本发明涉及编码BRK-1蛋白的DNA序列。该DNA序列可以是基因组DNA或cDNA。较佳地，该DNA序列是SEQ ID No.3。
在另一例子中，本发明涉及含有编码BRK-1蛋白的DNA序列的重组表达载体。较佳地，该重组表达载体是质粒，它具有ATCCNo.69457所含的pJT4-J159F质粒构建物所有确定的特性。
在另一例子中，本发明涉及含有上述重组表达载体的宿主细胞。较佳地，该宿主细胞是哺乳动物细胞，更佳地是CHO细胞或COS细胞。
在另一例子中，本发明涉及截短的BMP受体激酶蛋白，或其可溶性片段。较佳地，t-BRK-1具有SEQ ID No.2氨基酸序列。较佳地，t-BRK-1的可溶性片段具有SEQ ID No.6氨基酸序列；较佳地，t-BRK-1的可溶性片段由SEQ ID No.5核酸序列编码。
在另一例子中，本发明涉及编码t-BRK-1蛋白的DNA序列。编码t-BRK-1的DNA序列具有SEQ ID No.1。
在另一例子中，本发明涉及含有编码t-BRK-1的DNA序列的重组表达载体。较佳地，该重组表达载体是质粒，它具有ATCCNo.69474所含的pJT6-J159T质粒构建物所有确定的特性。
在另一例子中，本发明涉及含有t-BRK-1的重组表达载体的宿主细胞。较佳地，该宿主细胞是哺乳动物细胞，更佳地是CHO细胞或COS细胞。
在另一例子中，本发明涉及产生BRK-1或t-BRK-1的方法，它包括从上述的宿主细胞中分离BRK-1或t-BRK-1。
在另一例子中，本发明涉及鉴别能结合BMP受体激酶蛋白的化合物(例如BMP(较佳地为BMP-2或BMP-4)以及其他未发现的化合物)的方法，该方法包括将含有该化合物的样品与BMP受体激酶蛋白接触，让化合物与受体激酶蛋白结合。较佳地，受体激酶蛋白具有SEQ ID No.4(t-BRK-1)或其可溶性片段的氨基酸序列，或者具有SEQ ID No.2(BRK-1)或其可溶性片段的氨基酸序列。这种方法也可用于测定样品中存在的BMP或其他受体结合化合物的数量。
例如，样品中BMP的浓度可通过放射性受体测定(radiorecep-tor assay)而确定，其中样品中的未标记BMP与标记的示踪物BMP竞争与BRK-1或t-BRK-1受体的结合。当样品中的BMP数量上升时，能够与BRK-1或t-BRK-1结合的标记BMP的数量就下降。用已知浓度的未标记BMP制作标准曲线，通过与标准曲线的比较可以准确地确定样品中BMP的浓度。示踪物BMP的标记较佳地是用[125I]NaI的碘化反应完成。BRK-1或t-BRK-1可以在稳定的细胞系的外膜表达，或者以可溶性片段形式提供，或者作为共价连于固相载体的可溶性片段。为了进行测试，样品中未标记BMP和标记的示踪物BMP应一直竞争着与受体结合，直至得到平衡。然后从游离配体中分离出受体-BMP复合物，例如通过洗涤(在附着细胞系情况下)、快速过滤或离心(在非附着细胞系或受体结合于固相载体的情况下)、或用抗体、聚乙二醇或其他沉淀剂在过滤或离心后沉淀受体—配体复合物(在可溶性受体的情况下)。然后通常通过伽马计数法并与已知对照标准进行比较而确定复合物中标记BMP的数量。使用其他受体的方法已经在文献中有描述(Williams，M.，Med.Res.Rev.，11147-184(1991)；Higuchi，M.and Aggar-wal，B.B.，Anal.Biochem.，20453-58(1992)；Cain，M.J.，R.K，Garlick and P.M.Sweetman，J.Cardiovasc.Pharm.，17S150-S151(1991)；每一篇文献都在此引用作为参考)，而且可以方便地用于BRK-1受体/BMP系统。
同样的技术也可用于高流通量(high-throughput)筛选，以确定能与BRK-1或t-BRK-1结合的化合物。在这种方法中，化合物与BRK-1或t-BRK-1(或其可溶性片段)的亲和性越高，它就能越有效地与示踪物竞争与受体的结合，因而受体—配体复合物的计数就越低。在这种情况下，人们可以比较相同浓度范围内的一系列化合物，以确定哪个化合物与受体结合的亲和性最高。
在另一例子中，本发明涉及对BRK-1或t-BRK-1特异的抗体，以及产生这些抗体的方法。
较佳地，对于BRK-1或t-BRK-1在分泌蛋白质产物的系统中例如在哺乳动物细胞中的表达，SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6的前23个氨基酸构成了信号序列，该信号序列将蛋白质产物引导给细胞的分泌结构。随后，如果存在跨膜结构域，蛋白质产物将被掺入细胞膜(以t-BRK-1(SEQ ID No.2)或BRK-1(SEQ ID No.4)形式)；或者如果不存在跨膜结构域，则将被分泌出来(作为t-BRK-1或BRK-1(SEQ ID No.6)的可溶性形式)。然而，构成信号序列的氨基酸通常在翻译后的加工过程中通过蛋白水解而去除，因此预计成熟的、加工过的蛋白质从氨基酸Gln24开始。
对于产物在细胞内积累的表达系统，例如在细菌(如大肠杆菌)中，构成信号序列的氨基酸优选被删去，并且将一个额外甲硫氨酸加于N末端作为起始密码子。
本发明可用于确定配体例如已知的或假定的药物是否能够结合和/或激活本发明的DNA分子所编码的BRK-1受体。此处描述的通过该DNA序列转染入细胞系统，可提供一种用于确定配体是否能够结合和/或激活分离的DNA分子所编码的受体的测试系统。重组细胞系(例如此处所述的细胞系)可用作竞争性结合测试的活细胞培养物，该竞争性测试是在已知或候选药物与结合受体并用放射性、光谱的或其他试剂标记的配体之间进行的。含有受体的、从转染细胞中分离出的膜制剂也可用于竞争性结合测试。衍生自受体的含有配体结合结构域的可溶性受体也可以用于候选药物的高流通量筛选。细胞内信号传递的功能测试可作为结合亲和性及受体功能性激活功效的测试手段。此外，可以修饰重组细胞系使其含有可操作地连于效应元件的报道基因(reporter gene)，使受体发出的信号能够开启报道基因。这种系统特别适合针对确定受体拮抗剂的高流通量筛选。这些重组细胞系构成了可用于鉴别具有潜在药物开发价值的天然或合成化合物的“药物发现系统”。这种鉴别出的化合物可进一步修饰或者直接用作治疗化合物以激活或抑制分离的DNA分子编码的受体的天然功能。
大量表达BRK-1或其可溶性片段的稳定细胞系也可用作纯化受体的蛋白质来源。然后可将纯化的受体或其可溶性形式用于高流通量筛选测试以实现上述目的。纯化的受体或其可溶性形式也可通过X射线晶体衍射法或NMR(核磁共振)技术，用于确定BMPBRK-1复合物的结构，从而设计合理的BMP促效剂或拮抗剂。
此处公开的核苷酸序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.3，分别表示从鼠NIH3T3细胞中分离出的t-BRK-1和BRK-1序列。用这些序列可方便地获得其他物种如人类BRK-1的cDNA。这些cDNA序列还可方便地用于分离BRK-1的基因组DNA。这样便可以分析控制受体基因表达的调控元件，从而提供新的治疗机会。核苷酸序列还可用于确定BRK-1在正常组织及发病状态下的分布情况，从而确定其在体内的生理作用。
为了阐述本发明的优选例子，下面详细讨论实施例。这些实施例不起限制作用。实施例1BRK-1 PCR片段的分离根据活化素(Mathews，L.S.and Vale，W.W.，Cell 65973-982(1991))和Daf-1(Georgi，L.L.，Albert，P.S.，and Rid-dle，D.L.，Cell 61635-645(1990))受体激酶的蛋白质序列的排列，并与高度相关的胞质raf蛋白质激酶(Nishida，Y.，Hata，M.，Toshikazu，A.，Ryo，H.，Yamagata，M.，Shimizu，K.；andNishizuka，EMBO J.7775-781(1988)；Bonner，T.L.，Opper-mann，H.，Seeburg，P.，Kerby，S.B.，Gunnell，M.A.，Young，A.C.，and Rapp，U.R.，Nucleic Acids Res.141009-1015(1986))的激酶结构域序列相比较，从而设计出PCR引物。序列的排列表明，活化素和Daf-1受体激酶在激酶结构域VI中含有一个独特的插入片段，而该插入片段不存在于raf激酶。因此，引物被设计成可产生含有该插入片段从而增加克隆与活化素和Daf-1受体高相关的受体激酶可能性的片段。有义引物被设计为简并寡核苷酸引物，它编码在活化素和Daf-1受体激酶结构域II中发现的蛋白质序列EA/YVAVKV/IF。ACT2A和ACT2B分别指这一套简并5′PCR引物，见图1。反义引物被设计成简并寡核苷酸引物混合物(pool)，它编码对应于在活化素和Daf-1受体激酶结构域VIB中发现的蛋白质序列KPAM/IA/SHRDIK的反义链。ACT1A和ACT1B分别指这一套简并3′PCR引物，见图1。
用“RNAZOL”(Tel-Test，Friendswood，TX；一种快速分离RNA的溶液，含有硫氰酸胍、苯酚和β-巯基乙醇)从鼠NIH3T3细胞(ATCC CRL 1648)中分离出总RNA。接着通过寡(dT)纤维素色谱(Pharmacia LKB，Piscataway，NJ)柱用色谱法制备Poly A+RNA。用反转录酶从200ng聚腺苷酸化的mRNA中产生单链DNA(第一条链合成试剂盒来自Stratagene，La Jolla，CA；该试剂盒含有从RNA产生cDNA所需的组份，包括来自Maloney鼠白血病病毒的反转录酶、引物、寡核苷酸和缓冲液)。一部分产物(20％)再通过聚合酶链反应(PCR)，用50pmol 5′引物ACT2A和ACT2B(示于图1)和250pmol每种3′引物ACT1A和ACT1B(示于图1)进行扩增。反应以100μ终体积，用“GENE-AMP”试剂盒(Perkin-Elmer，Norwalk，CT；试剂盒含有用聚合酶链反应扩增DNA所需的组份，包括“AMPLITAQ”，来自栖热水生菌(Thermus aquati-cus)的重组DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)，核苷酸和缓冲液)，在Perkin-Elmer热循环仪上进行。使用标准PCR反应条件在94℃解链2分钟，然后进行35个循环，每个循环包括解链(94℃，30秒)、退火(55℃，30秒)和延伸(72℃，30秒)。第一次PCR反应结束之后，将10μl反应产物取出，用新鲜试剂再进行35个循环的扩增。接着，第二次PCR产物被连入载体pCR1000(Invitrogen，San Diego，CA)以便进行克隆选择和序列分析。
用这种方法，分离出约300bp的PCR片段，其DNA序列与Daf-1受体基因(Georgi，.L.L.，Albert，P.S.，and Riddle，D.L.，Cell，61635-645(1990))和鼠II型活化素受体cDNAs(Math-ews，L.S.and Vale，W.W.，Cell，65973-982(1991))高度同源。实施例2t-BRK-1 DNA的分离有了PCR片段之后，接着就必须用该片段来筛选cDNA文库以分离出全长受体克隆。
切下PCR片段，用凝胶电泳纯化，然后用″PRIME-IT″随机引物标记试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA；试剂盒含有随机引物标记cDNA所需的组份，包括无外切核酸酶活性的Klenow聚合酶、随机9聚物引物和缓冲液)通过随机标记法用(α-32P)-dCTP标记。用标记的探针筛选cDNA文库，该文库用鼠NIH3T3细胞制备，置于载体(“λZAP II”中(Stratagene，La Jolla，CA；一种λ克隆载体，它可接受10kb之内的插入片段而且可在“pBLUESCRIPT SK(-)”质粒中允许自动切下)。杂交是在5x SSPE(1x SSPE＝0.15M NaCl，10mM Na2HPO4和1mM EDTA(乙二胺四乙酸))、1xDenhardt′s(0.02％牛血清白蛋白，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％ Ficoll)、100μg/ml鲑鱼睾丸DNA、50％甲酰胺中，于42℃进行24-48小时。膜先在42℃、然后在55℃用0.1x SSPE和0.2％十二烷基磺酸钠(SDS)洗涤，阳性噬菌斑通过于-70℃在带增感屏的“KODAK X-OMAT AR”胶片(Kodak，Rochester，NY；科学成像胶片)上的放射自显影而确定。对阳性噬菌斑的稀释和筛选获得了一个分离的纯化噬菌体，它被称为J159#7。
“λZAP II″载体的克隆位点含有质粒“pBLUESCRIPT SK(-)”(Stratagene，La Jolla，CA；衍生自pUC19的2.96kb用于产生菌落的噬菌粒(phagemid))的序列。用R408辅助噬菌体(Stratagene，La Jolla，CA)从纯化的λ噬菌体J159#7中切下含有克隆插入片段的质粒序列。这样产生了亚克隆入“pBLUESCRIPTSK(-)”的t-BRK-1 cDNA。得到的质粒被我们称为pBLUE-SCRIPT-J159T，它适合用于序列分析。实施例3t-BRK-1的序列分析接着，含有t-BRK-1 cDNA的分离质粒pBLUESCRIPT-J159T用“SEQ UENASE”Ver.2.0试剂盒(U.S.Biochemicals，Cleveland，OH；试剂盒含有用双脱氧终止法手工操作DNA测序的各种组份，包括“SEQ UENASE”(T7 DNA聚合酶的修饰形式，无外切酶活性。U.S.Biochemicals，Cleveland，OH)、用于标记和延伸的核苷酸混合物、双脱氧核苷酸终止物、焦磷酸酶和缓冲液)或“TAQ DYE DEOXY”Terminator Cycle测序试剂盒(AppliedBiosystems，Foster City CA；试剂盒含有用双脱氧终止法自动DNA测序的各种组份，包括“AMPLITAQ”、核苷酸混合物、染料标记的双脱氧核苷酸终止物和缓冲液)和373A型DNA测序仪(Ap-plied Biosystems，Foster City，CA)对两条链进行测序。完整的DNA序列(SEQ ID NO1)显示，在起始密码子ATG后是1500碱基对的开放阅读框。
该序列与已知的TGF-β家族受体激酶序列的比较显示有高度同源性，但是又表明t-BRK-1的激酶结构域比相关受体激酶短得多(图2)。src激酶的突变研究所获得的信息已确定了为使激酶能作为活性酶起作用，在激酶结构域C末端所需的最少氨基酸残基数。该区域上游氨基酸的缺失可导致无活性的激酶，这可能是因为激酶结构是不稳定的(Yaciuk，P.and Shalloway，D.，Molec.andCell.Biol.，62807-2819(1986))。因此，本领域的熟练技术人员普遍认为，激酶结构域末端应位于酪氨酸激酶的激酶结构域XI中恒定精氨酸下游10个残基处的疏水性残基处，或者位于丝氨酸/苏氨酸激酶中恒定精氨酸下游12-18个氨基酸处。(Hanks，S.K.and Quinn，A.M.，Meth.Enzymol.，20038-62(1991))。该区域在图2中用方括号表示。t-BRK-1中的终止密码子位于确定激酶结构域末端的区域起始处之前的20个氨基酸处，因此据信t-BRK-1是截短的受体克隆。该序列的进一步分析揭示在1763位有假定的完整内含子—外显子拼接，表明作为该cDNA模板的信使RNA经历了不完全的RNA转录后拼接，从而使一部分内含子被包含在序列中。
在蛋白质的N末端，通过预计的氨基酸23和24之间的切除位点确定了真核细胞的信号序列(见SEQ ID No.2)。因此，在翻译后加工之后，预计成熟蛋白质从氨基酸Gln24开始。氨基酸153-176的高疏水性区域表明存在一个跨膜区域，它将蛋白质分成胞外配体结合结构域和胞内激酶结构域。实施例4BRK-1的分离为了分离在激酶结构域中无提前终止的BRK-1 cDNA，从NIH3T3 poly A+RNA(Stratagene，La Jolla，CA)制备另一个更广地代表mRNA的cDNA文库。这个构建在“UNI-ZAP XR”(Stratagene，La Jolla，CA；一种λ克隆载体，它允许构建单向cD-NA文库)的文库是用聚dT序列和随机引物来合成cDNA文库。然后用通过随机标记法(“PRIME-IT”随机标记试剂盒)以32P标记的J159 PCR片段筛选文库。如上(实施例2)进行克隆的筛选和分离。又获得几个克隆，将其用于序列分析。实施例5BRK-1的序列分析克隆的序列分析是用“TAQ DYE DEOXY”终止物循环测序试剂盒和Applied Biosystems的373A型DNA测序仪(AppliedBioSystems，Foster City，CA)进行。将克隆与t-BRK-1以及其他受体激酶的序列进行比较，结果表明一个克隆(SEQ ID No.3)含有全长编码序列(没有内含子)和完整的激酶结构域。来自该克隆的质粒被称为pBLUESCRIPT-J159F。开放阅读框是编码532个氨基酸的1596个碱基对，预计分子量约60,059。该cDNA被称为BRK-1。
BRK-1的DNA序列与t-BRK-1的序列在SEQ ID No.3中核苷酸1-1483(SEQ ID No.1中核苷酸281-1763)是相同的，所以SEQ ID No.4和SEQ ID No.2中氨基酸1-491处的氨基酸序列是相同的。因此，在t-BRK-1中观察到的并在实施例3中描述过的N末端信号序列和跨膜结构域也同样存在于全长BRK-1中。整个配体结合结构域也是相同的。t-BRK-1的核苷酸序列(SEQ ID No.1)含有90碱基对的插入片段(核苷酸1764-1853)，但在BRK-1的核苷酸序列(SEQ ID No.3)中并不存在。该插入片段是不完全拼接的内含子的一部分。在该位置之后，t-BRK-1的核苷酸1854-2035与BRK-1序列的核苷酸1484-1665是相同的。因此，将t-BRK-1中90碱基对的插入片段去除便可得到与BRK-1相同的编码序列。实施例6产生针对BRK-1的抗体为了显示BRK-1受体的表达，为了显示配体结合以及为了鉴别其他能与BRK-1复合的蛋白质，获得对受体特异的抗体是很有用的。因此，为了该目的，用两种抗原在兔中产生多克隆抗血清。
首先，在大肠杆菌中用“QIA EXPRESS”细菌表达系统(Qia-gen，Chatsworth，CA；一种在大肠杆菌中高水平表达蛋白质的试剂盒，它在蛋白质中掺入一个由6个组氨酸构成的亲和标记，从而可以通过金属螯合物色谱而快速地纯化重组蛋白，该试剂盒含有pQE-12表达载体、编码lac阻抑物(repressor)、大肠杆菌宿主菌株和金属螯合物树脂)表达成熟的胞外配体结合结构域，该结构域包含SEQ ID No.2氨基酸24-1529(或SEQ ID No.4氨基酸24-154)。含有SEQ ID No.1核苷酸360-746(或SEQ ID No.3中核苷酸80-466)的一部分核苷酸序列通过PCR，用在5′和3′端掺入Bgl II位点的引物扩增。具体地，5′端引物为CCATAGATCTCA-GAATCTAGATAGT，而3′端引物为GGTAA-GATCTTCGGATCCTGCCATC。将扩增的插入片段插入PQE12载体(Qiagen，Chatsworth，CA)，该载体指导在蛋白质的C末端带有6个组氨酸的插入片段的表达。用该构建物转化大肠杆菌菌株JM101后，转化的菌株在LB培养液中生长，并在对数中期添加异丙基巯基-β-半乳糖苷(IPTG)，诱导lac启动子驱动的蛋白质表达。在添加IPTG后3小时，离心收集细胞，在“FRENCH”压碎器(SLM-Aminco，Urbana，IL；一种用于在高液压下使细菌解体的分散单元)中于16,000psi下通过2次而裂解。根据制造商的说明，在镍金属螯合剂柱上通过色谱法而纯化胞外结构域。进一步的纯化是在制备性C4反向柱(Waters DeltaPak C4 column，300，7.8mm×30cm，Millipore，Milford，MA)上进行，使用0.05％ TFA(三氟乙酸)水溶液至0.05％ TFA于80％乙腈溶液的线性梯度，流速为2.8ml/分钟，时间为90分钟。混合在38％乙腈洗脱时的峰组份，真空干燥，然后用来免疫3只新西兰白兔(Hazleton Washing-ton，Vienna，VA)。用Western印迹法评估抗血清检测纯化的大肠杆菌抗原的能力。效价最高的抗血清被命名为1353。
第二种用于识别胞内激酶结构域的抗原是从具有与SEQ IDNo.4氨基酸398-420(或SEQ ID No.2中氨基酸398-420)相同氨基酸序列的肽制备，在C末端添加了半胱氨酸以便与肽偶联；用单字符缩写表示即为LNTRVGTKRYMAPEVLDESLNKNC。BRK-1激酶结构域的氨基酸序列与Raf蛋白质激酶结构域的比较揭示，BRK-1的该区域对应于Raf激酶中用于产生高特异性抗体的区域(Kolch，W.，Weissinger，E.，Mischak，H.，Troppmair，J.，Showalter，S.D.，Lloyd，P.，Heidecker，G.，and Rapp，U.R.Oncogene 5713-720(1990))。用标准方法将该肽偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)，然后免疫3只新西兰白兔(Hazleton Washing-ton，Vienna，VA)。用抗体捕获ELISA(酶联免疫吸附测定)评估得到的抗血清识别涂在塑料上的原初肽的能力。抗血清被命名为1378、1379和1380。实施例7BRK-1的表达为了确定BRK-1的功能，有必要表达蛋白质并测试其能否与特异配体结合。这种工作最好在哺乳动物细胞系中进行，因为这会最大限度地增加在细胞膜中表达正确加工的蛋白质的机会。为了该目的，将BRK-1 cDNA亚克隆入表达载体pJT4以产生质粒pJT4-J159F。来自pBLUESCRIPT-J159F的BRK-1插入片段用限制性内切核酸酶Alf III消化，产生带有单链突出的线性化质粒。突出的末端用DNA聚合酶I Klenow片段填平，产生平末端。线性化质粒再用Not I消化，从而从质粒中释放出插入片段。用Not I和EcoRV消化pJT4表达载体，并与插入片段相连。Klenow反应所产生的平末端与同样是平末端的EcoRV位点相容，连接后消除了EcoRV位点。形成的构建物示于图3。
为了在COS细胞中进行瞬时表达而优化的pJT4载体含有巨细胞病毒早期启动子和增强子，它能非常有效地转录信使、来自人T-细胞白血病病毒-1长末端重复序列的“R”元件，已表明它能进一步提高表达水平(Takebe，Y.，M.Seiki，J.-I.Fujisawa，P.Hoy，K.Yokota，M.Yoshida and N.Arai，Mol.Cell.Biol.，8466-472(1988))、来自SV40病毒的内含子拼接位点，据信它能增加信使的稳定性、多克隆位点、衍生自SV40病毒的聚腺苷酸化信号，它指导在信使RNA尾部添加聚腺苷酸，这是大多数真核mRNA所必需的、SV40病毒的复制起点，它允许在含有SV40大T抗原的细胞如COS细胞中复制出极高拷贝数的质粒。此外，为了在细菌中进行操作和扩增载体，载体含有大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
用pJT4-J159F瞬时表达BRK-1是在COS-7细胞(ATCCCRL 1651)中，用电穿孔法进行。细胞在添加有5％小牛血清(Hy-clone，Logan，Utah)、非必需氨基酸(GIBCO，Gaithersburg，MD)和谷氨酰胺的DME(Dulbecco′s Modified Eagle)高葡萄糖培养基中生长至汇合，然后用胰蛋白酶处理将细胞从平板上释放出来。释放的细胞在桌面离心器中离心，然后在新培养基中以6.25×106细胞/ml的浓度重新悬浮。将细胞悬浮液(5×106细胞，0.8ml)转移至BioRad“GENE PULSER”电穿孔系统(BioRad，Hercules，CA)的样品池中。在样品池中加入纯化的DNA质粒(10μg)，然后细胞在4.0kV/cm、25μFd电容下进行电穿孔。接着将细胞铺平，让其复苏。24小时后添加新鲜培养基。48小时后，便可测试细胞与BRM-4的结合。实施例8t-BRK-1的表达对于t-BRK-1的表达，用限制性核酸内切酶Not I和Xho I将cDNA插入片段从pBLUESCRIPT-J159T中切下，然后亚克隆入表达载体pJT6的Not I和Sal位点，产生图4所示的构建物pJT6-J159T。载体pJT6与实施例6中描述的pJT4相同，除了多克隆位点的方向相反以及在多克隆区域的Pst I和Bam HI位点之间存在间隔DNA。
用pJT6-J159T构建物在COS细胞中瞬时表达t-BRK-1完全按照上述对BRK-1(实施例7)的方法进行。实施例9放射性标记BMP配体的制备在这些研究中优选的放射性配体是BMP-4。BMP-4是通过氯胺T法(Frolik，C.A.，Wakefield，L.M.，Smith，D.M.，andSporn，M.B.J.Biol.Chem.25910995-11000(1984))，用125I标记的。将BMP-4(2μg)溶解在5μl 30％乙腈、0.1％三氟乙酸(TFA)并添加有5μl 1.5M硫酸钠(pH 7.4)中。加入无载体的[125I](1mCi，4-10μl)以及2μl氯胺T溶液(100μg/ml)。在2分钟和3.5分钟时再加入2μl氯胺T溶液。4.5分钟后，加入10μl 50mM N-乙酰酪氨酸、100μl 60mM碘化钾和100μl 11M尿素在1M乙酸中的溶液，使反应终止。在保温3.5分钟之后，未反应的碘通过PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)，在4mM HCl、75mM NaCl，1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)中上柱而去除。得到的标记蛋白质中95％以上可用三氟乙酸沉淀，这表明所有的[125I]都结合着蛋白质，而且典型的比活度为3000-8000 Ci/mmol。
BMP-2可用同样方式放射性标记，并且用作放射性配体。但是，使用BMP-2会导致非常高的非特异结合，这可能是因为BMP-2与胞外基质蛋白(matrix protein)结合。通过去除蛋白质的氨基端，可显著降低这种非特异结合，从而显著提高BMP-2作为放射性配体的用途，这可能是因为去除了担负与胞外基质结合的区域。去除BMP-2的氨基端可通过胰蛋白酶的部分蛋白水解而实现(Wozney，J.M.，Mol.Rep.Dev.，32160-167(1992))。这样产生了一个称为“部分去除的BMP-2”或DR-BMP-2的衍生物。DR-BMP-2的制备和纯化如下进行。
将BMP-2(100-250μg)溶解在500μl 4M urea、0.1MNa-Cl、0.05M Tris-HCl(pH 8.2)中。加入胰蛋白酶(测序级；Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，其中胰蛋白酶/BMP-2的比例为1/50(w/w)，消化混合物在37℃保温2小时。通过加入苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1mM而终止消化，冰冻混合物并储存在-20℃下直至用于纯化。
通过Waters Delta-Pak C4柱(5μm，300 A，3.9X150mm；Millipore Corp.，Milford，MA)上的反向HPLC(高效液相色谱)，从消化混合物中分离出DR-BMP-2。将全部消化混合物直接上柱，用0.05％ TFA至0.05％ TFA、60％乙腈线性梯度，在80分钟内和流速0.7ml/分钟下洗脱DR-BMP-2。通过214nm处的吸收进行监测和SDS-聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色后发现，大多数DR-BMP-2是在约36％乙腈浓度时洗脱下来的、界限分明的峰。在这些色谱条件下，PMSF、PMSF失活的胰蛋白酶和任何残留的完整BMP-2都与DR-BMP-2分开。将纯化的DR-BMP-2分成几份，真空干燥，并储存于-20℃。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测试表明，与非还原状态下的BMP-2相比，DR-BMP-2的分子量下降了约2000道尔顿，而与还原状态下的BMP-2相比，下降了约1000道尔顿。氨基端蛋白质测序表明，约70％的DR-BMP-2从Lys290开始，其余的30％从Leu292开始。氨基酸分析得到的结果与测序结果完全一致，暗示蛋白质的COOH-末端不受胰蛋白酶处理的影响。DR-BMP-2的放射性标记完全按BMP-4所述的方法进行。实施例10BMP与BRK-1的结合DR-BMP-2和BMP-4与BRK-1的结合可用3种不同方法显示整个细胞与放射性标记BMP的结合；放射性标记BMP与受体的共价交联和与标记配体交联的受体的免疫沉淀。下面详细描述这3种方法。
对于整个细胞结合试验，如实施例7用pJT4-J159F转染COS-7细胞。电穿孔后，将细胞按670,000细胞/孔接种于12孔培养板上。24小时后更换培养基，然后在48小时时进行结合试验。此时，用结合缓冲液(50mM Hepes缓冲液，pH 7.4，128mM NaCl，5mMKCl，5mM MgSO4，1.2mM CaCl2，2mg/ml BSA)洗涤细胞一次，然后用相同缓冲液于4℃在轻摇动中平衡30分钟。吸去缓冲液，向每个孔中加入500μl结合缓冲液(4℃)，它含有[125I]-BMP-4示踪物以及不同浓度的未标记BMP-2、BMP-4或其他未标记配体，这取决于具体测试情况。对于确定非特异结合，将BMP-2加入结合缓冲液中至终浓度为10nM。为了防止配体在保温过程中降解，还加入蛋白酶抑制剂混合物至终浓度为10μg/ml的亮抑酶肽(leu-peptin)、10μg/ml抗蛋白酶(antipain)、50μg/ml抑蛋白酶肽(apro-tinin)、100μg/ml苯甲脒、100μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、10μg/ml苯丁抑制素(bestatin)、10μg/ml胃酶抑制剂和300μM PMSF。细胞在4℃轻摇动中保温30分钟。保温期结束之后，吸去缓冲液，用1毫升洗涤缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，128mM NaCl，5mMKCl，5mM MgSO4，1.2mM CaCl2，0.5mg/ml BSA)漂洗细胞4次。在吸去最后一次的漂洗液后，向每个孔中加入750μl溶解缓冲液(10mM TrisCl，pH 7.4，1mM EDTA，1％(v/v)Triton X-100)并在室温下保温15分钟。溶解的细胞再转至新试管，用Packard Model 5005“COBRA”伽马计数器进行计数。(Packard In-strument Co.，Downers Grove，IL)。
该试验的结果示于图5。[125I]-BMP-4与用BRK-1 cDNA转染(通过构建物pJT4-J159F)的COS-7细胞的特异结合比与假转染的COS-7的结合高3倍。
为了更定量地确定与BRK-1的结合，在用BRK-1 cDNA转染(通过构建物pJT4-J159F)的COS-7细胞上进行饱和结合测试。在浓度范围10-1000pM内监测[125I]-BMP-4的结合，非特异结合用10nM未标记的BMP-4确定。结合数据用LIGAND软件分析(3.0版本；Elsevier-Biosoft，Cambridge，UK)，得到BRK-1的亲和性(Kd)为5×10-10M，恰好落于BMP受体预期的生理范围之内。
第二种显示BMP与BRK-1的结合是放射性标记BMP与BRK-1受体的共价交联。在该方法中，用双官能交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺(disuccinimidyl suberate，DSS)(Pierce Chemical，Rock-ford，IL)，通过与两个蛋白质的赖氨酸自由氨基的反应，将放射性配体共价交联至其受体。在交联之后，通过凝胶电泳分离细胞蛋白质，观察到放射性条带。标记条带表示受体选择性地“附着于”放射性标记的配体。在该程序中，如实施例7用pJT4-J159F转染COS-7细胞，然后将细胞按670,000细胞/孔接种于12孔培养板上。24小时后更换培养基，然后在电穿孔后48小时后，洗涤细胞，平衡，再与[125I]-BMP-4或[125I]-DR-BMP-2一起进行保温，然后按该完整细胞结合研究实施例中所述的方法与未标记配体进行竞争。与配体保温4小时后，细胞在4℃用2毫升结合缓冲液(其组成同上，除了不加入BSA)洗涤3次。向每个孔中加入1毫升不含BSA的新鲜结合缓冲液，然后加入新制备的DSS至终浓度为135μM。在轻轻旋荡以混合DSS后，培养板在4℃，于轻摇动下精确地保温15分钟。此时吸去培养基，用3毫升解离缓冲液(10mM Tris，0.25M蔗糖，1mM EDTA，0.3mM PMSF，pH 7.4)洗涤细胞。向每个孔中加入0.75ml解离缓冲液细胞被刮入缓冲液中并转至新的微离心管。每个孔接着再用0.5毫升解离缓冲液漂洗，并加入相应的管中。离心样品(13,0000xg，5分钟)，弃去上清液。将沉淀溶解在20μl还原样品缓冲液中(125mM TrisCl，pH 6.8，1％β-巯基乙醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，在4℃旋涡震荡30-45分钟，煮沸5分钟，然后离心(13,0000xg，5分钟)。将上清液上样于7.5％聚丙烯酰胺凝胶上，进行电泳。凝胶在0.12％考马斯亮蓝、5％甲醇、7.5％乙酸中染色，在5％甲醇、7.5％乙酸中脱色，然后在玻璃纸中干燥。可在PhosphorImager(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上观察和计量干凝胶的放射性，或者用“KODAK X-OMAT AR”底片(Kodak，Rochester，NY)进行放射性自显影。
该试验的结果示于图6。图6A显示了[125I]-BMP-4与用BRK-1 cDNA转染(通过构建物pJT4-J159F)的COS-7细胞的交联情况。道1中，注意在分子量76,800处有一标记条带，它对应于与BMP-4共价交联的BRK-1。该条带可通过在保温过程中向细胞添加10nM BMP-2而明显减弱，并且在假转染的COS细胞中不存在。这表明了BMP-4与BRK-1的特异结合。因为标记条带代表与BMP-4(单体分子量16,400)共价交联的受体，因此受体的分子量可估计为60,400，这与BRK-1的氨基酸序列一致。图6B显示了使用[125I]-DR-BMP-2作为配体的相同试验。观察到相似的标记条带。与[125I]-BMP-4相同，标记条带可通过向细胞添加10nM BMP-2而明显减弱，并且在假转染的细胞中不存在。综上所述，这些结果表明，BMP-2和BMP-4都与BRK-1特异结合。
在第三种显示BMP与BRK-1结合的试验中，用BRK-1 cD-NA转染的COS细胞先交联于[125I]-BMP-4，然后用对BRK-1特异的抗体进行免疫沉淀。在该程序中，如实施例7用pJT-J159F转染COS-7细胞，然后将细胞按1×107细胞/皿接种于100mm培养皿上。它们按该实施例中所述的相同方法与[125I]-BMP-4交联，不同点在于与[125I]-BMP-4和未标记配体的保温是在总体积4毫升而不是500μl中进行，因此所有的其他体积都相应增加。在交联之后，细胞用冰冷的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次，然后用4毫升RIP缓冲液(20mM TrisCl，pH 8.0，100mM NaCl，1mMNa2EDTA，0.5％ Nonidet P-40，0.5％脱氧胆酸钠，10mM碘化钠和1％牛血清白蛋白)进行裂解。裂解物在Beckman GPR桌面离心器中，于3500rpm(3000xg)离心10分钟。将上清液转入新的试管中，用SDS定溶浓度为0.1％。为了去除存在于裂解物中的抗体，加入200μl“PANSORBIN”(Calbiochem，La Jolla，CA；10％金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的溶液)。在4℃保温30分钟，如上进行离心，再将上清液转至新试管中，按需要分成若干份。
接着将针对胞外结构域的原初抗体1353；或针对激酶结构域的1378、1379或1380加入试管中至终稀释度为1∶100，然后在冰上保温2小时。为了沉淀出抗原原初抗体复合物，再加入50μl“PAN-SORBIN”，在冰上保温30分钟。复合物在Beckman GPR离心机(Beckman Instruments，Fullerton，CA)上以3500rpm(3000xg)离心10分钟，弃出上清液。用含0.1％SDS的RIP缓冲液洗涤沉淀物3次，再用TNEN缓冲液(20mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5％ NP-40)洗涤一次。将沉淀物重新悬浮于25μl还原样品缓冲液中。与上述交联试验相同，溶解的蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳和放射性自显影。
该试验的结果示于图7。针对胞外结构域(道1)和胞内结构域(道3-5)的抗体沉淀出分子量约81,000的条带。减去BMP-4的单体分子量(16,400)，受体的分子量估计为64,000。这与上述交联试验中获得的结果相似。所有3种针对细胞内结构域的抗血清都沉淀出相同的蛋白质。这个特征条带在假转染细胞中(道2和6)不存在。该试验表明，在交联试验中观察到的交联标记条带，例如在图6中所示的条带，是与BRK-1免疫相关的，因为它被4种不同的对BRK-1特异的抗体所沉淀。t-BRK-1和BRK-1的保藏用pJT6-J159T(亚克隆入表达载体pJT6的SEQ ID No.1)转化的大肠杆菌于1993年10月20日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。ATCC保藏号为No.69474。
用pBLUESCRIPT-J159T(亚克隆入表达载体“pBLUE-SCRIPT SK(-)”的SEQ ID No.1)转化的大肠杆菌于1993年10月7日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。ATCC保藏号为No.69458用pJT4-J159F(亚克隆入表达载体pJT4的SEQ ID No.3)转化的大肠杆菌于1993年10月7日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。ATCC保藏号为No.69457。
正如本领域所知晓的那样，在DNA和氨基酸测序方法中偶尔会有差错。因此，保藏材料所编码的序列在此结合作为参考，用于在本发明的书面描述中的任何序列存在差错时核对之用。还应注意，本领域中重复本申请人书面公开的工作的一般熟练技术人员，使用常规技术时可能会发现测序差错。保藏ATCC No.69457和ATCCNo.69474并不意味着承认所保藏的材料是实施本发明所必需的。
所有上述提及的出版物在此全部引用作为参考。
应理解，此处描述的例子和实施例仅用于阐述目的，因此本领域的熟练技术人员会想到各种改变和变动形式，这些形式也在本发明和所附权利要求书的精神和范围之内。
序列表(1)一般信息(i)申请人Cook，Jonathan S.
Correa，Paul E.
Koenig，Beth B.
Rosenbaum，Jan S.
Ting，Jerry(ii)发明名称生长因子受体cDNA pJ159的分离(iii)序列数目6(iv)通信地址(A)地址The Procter & Gamble Company(B)街道11810 East Miami River Road(C)城市Cincinnati(D)州Ohio(E)国家U.S.A.
(F)邮编45239-8707(v)计算机可读形式(A)记录介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容型(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，版本#1.25(vi)本申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息
(A)姓名Corstanje，Brahm J.
(B)登记号34，804(C)卷宗/档案号5088(ix)通讯信息(A)电话(513)627-2858(B)传真(513)627-0260(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度2056碱基对(B)类型核酸(C)股性双链(D)拓扑结构线性(ix)特征(A)名称/分类符号CDS(B)位置291..1793(xi)序列描述SEQ ID NO1CGAATTCCTC GCGCCGTGGG AGGGGCGGCC CGGCCCACCC CCACGCCCCG CCCGGGAGGG60ACGGGGGGAG AGAGAGCGCG GCGACGGGTA TCTGGGTCAA AGCTGTTCGG AGAAATTGGA120ACTACAGTTT TATCTAGCCA CATCTCTGAG AATTCTGAAG AAAGCAGCAG GTGAAAGTCA180TTGCCAAGTG ATTTTGTTCT GTAAGGAAGC CTCCCTCATT CACTTACACC AGTGAGACAG240CAGGACCAGT CATTCAAAGG GCCGTGTACA GGACGCGTGC GAATCAGACA ATG ACT 296Met Thr1CAG CTA TAC ACT TAC ATC AGA TTA CTG GGA GCC TGT CTG TTC ATC ATT 344Gln Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Cys Leu Phe Ile Ile5 10 15TCT CAT GTT CAA GGG CAG AAT CTA GAT AGT ATG CTC CAT GGC ACT GGT 392Ser His Val Gln Gly Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly Thr Gly
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His Tyr Cys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Tyr Asn Arg Asp180 185 190Leu Glu Gln Asp Glu Ala Phe Ile Pro Val Gly Glu Ser Leu Lys Asp195 200 205Leu Ile Asp Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu210 215 220Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val Arg Gln Val225 230 235 240Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg Gly Glu245 250 255Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser Trp Phe260 265 270Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Thr Val Leu Met Arg His Glu Asn Ile275 280 285Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser Trp Thr Gln290 295 300Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Asp Phe305 310 315 320Leu Lys Cys Ala Thr Leu Asp Thr Arg Ala Leu Leu Lys Leu Ala Tyr325 330 335Ser Ala Ala Cys Gly Leu Cys His Leu His Thr Glu Ile Tyr Gly Thr340 345 350Gln Gly Lys Pro Ala IlE Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile355 360 365Leu Ile Lys Lys Asn Gly Ser Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala370 375 380Val Lys Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Leu Asn Thr385 390 395 400Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Glu Ser405 410 415Leu Asn Lys Asn His Phe Gln Pro Tyr Ile Met Ala Asp Ile Tyr Ser420 425 430Phe Gly Leu Ile Ile Trp Glu Met Ala Arg Arg Cys Ile Thr Gly Gly435 440 445Ile Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Met Val Pro Ser Asp450 455 460Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Val Val Cys Val Lys Arg Leu Arg465 470 475 480Pro Ile Val Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Cys Leu Arg Ala Val485 490 495Leu Lys Leu Met Ser Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser Arg Leu500 505 510Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Val Glu Ser Gln515 520 525Asp Val Lys Ile530(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度466碱基对(B)类型核酸(C)股性双链(D)拓扑结构线性(ix)特征(A)名称/分类符号CDS
(B)位置11..466(xi)序列描述SEQ ID NO5GAATCAGACA ATG ACT CAG CTA TAC ACT TAC ATC AGA TTA CTG GGA GCC 49Met Thr Gln Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala1 5 10TGT CTG TTC ATC ATT TCT CAT GTT CAA GGG CAG AAT CTA GAT AGT ATG 97Cys Leu Phe Ile Ile Ser His Val Gln Gly Gln Asn Leu Asp Ser Met15 20 25CTC CAT GGC ACT GGT ATG AAA TCA GAC TTG GAC CAG AAG AAG CCA GAA 145Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gln Lys Lys Pro Glu30 35 40 45AAT GGA GTG ACT TTA GCA CCA GAG GAT ACC TTG CCT TTC TTA AAG TGC 193Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys50 55 60TAT TGC TCA GGA CAC TGC CCA GAT GAT GCT ATT AAT AAC ACA TGC ATA 241Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile65 70 75ACT AAT GGC CAT TGC TTT GCC ATT ATA GAA GAA GAT GAT CAG GGA GAA 289Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu80 85 90ACC ACA TTA ACT TCT GGG TGT ATG AAG TAT GAA GGC TCT GAT TTT CAA 337Thr Thr Leu Thr Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln95 100 105TGC AAG GAT TCA CCG AAA GCC CAG CTA CGC AGG ACA ATA GAA TGT TGT 385Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys110 115 120 125CGG ACC AAT TTG TGC AAC CAG TAT TTG CAG CCT ACA CTG CCC CCT GTT 433Arg Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val130 135 140GTT ATA GGT CCG TTC TTT GAT GGC AGC ATC CGA 466Val Ile Gly Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg
145 150(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度152氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Thr Gln Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Cys Leu Phe1510 15Ile Ile Ser His Val Gln Gly Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly20 25 30Thr Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gln Lys Lys Pro Glu Asn Gly Val35 40 45Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser50 55 60Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn Gly65 70 75 80His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr Leu85 90 95Thr Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys Asp100 105 110Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asn115 120 125Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val Val Ile Gly130 135 140Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg145 150
权利要求
1.一种分离的、具有SEQ ID No.4氨基酸序列的BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段。
2.一种分离的DNA序列，其特征在于，它编码权利要求1所述的BMP受体激酶蛋白。
3.如权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，该DNA序列是SEQ ID No.3。
4.一种分离的截短的、具有SEQ ID No.2氨基酸序列的BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段。
5.一种分离的DNA序列，其特征在于，它编码权利要求4所述的BMP受体激酶蛋白。
6.如权利要求5所述的DNA序列，其特征在于，该DNA序列是SEQ ID No.1。
7.如权利要求4所述的可溶性片段，其特征在于，可溶性片段具有SEQ ID No.6氨基酸序列。
8.一种DNA序列，其特征在于，它编码权利要求7所述的可溶性片段。
9.如权利要求8所述的DNA序列，其特征在于，该DNA序列是SEQ ID No.5。
10.一种重组表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA序列。
11.一种重组表达载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的DNA序列。
12.如权利要求11所述的重组表达载体，其特征在于，该载体是具有ATCC No.69457所含的pJT4-J159F的所有确定特征的质粒。
13.一种重组表达载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的DNA序列。
14.一种重组表达载体，其特征在于，它含有权利要求6所述的DNA序列。
15.如权利要求14所述的重组表达载体，其特征在于，该载体是具有ATCC No.69474所含的pJT6-J159T的所有确定特征的质粒。
16.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求10所述的重组表达载体。
17.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求11所述的重组表达载体。
18.一种哺乳动物宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求12所述的重组表达载体。
19.如权利要求18所述的哺乳动物宿主细胞，其特征在于，该细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
20.如权利要求18所述的哺乳动物宿主细胞，其特征在于，该细胞是COS细胞。
21.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求13所述的重组表达载体。
22.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求14所述的重组表达载体。
23.一种哺乳动物宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求15所述的重组表达载体。
24.如权利要求22所述的哺乳动物宿主细胞，其特征在于，该细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
25.如权利要求22所述的哺乳动物宿主细胞，其特征在于，该细胞是COS细胞。
26.一种产生BMP受体激酶蛋白的方法，其特征在于，它包括将权利要求16所述的宿主细胞在允许表达BMP受体激酶蛋白的方式下进行培养，以及分离BMP受体激酶蛋白。
27.一种产生截短的BMP受体激酶蛋白的方法，其特征在于，它包括将权利要求17所述的宿主细胞在允许表达截短的BMP受体激酶蛋白的方式下进行培养，以及分离BMP受体激酶蛋白。
28.一种鉴别能结合BMP受体激酶蛋白的化合物的方法，其特征在于，该方法包括，将含有该化合物的样品与BMP受体激酶蛋白接触，让化合物与BMP受体激酶蛋白结合，其中BMP受体激酶蛋白具有SEQ ID No.4氨基酸序列或其可溶性片段，或者具有SEQID No.2氨基酸序列或其可溶性片段。
29.一种抗体，其特征在于，它针对权利要求1所述的BMP受体激酶蛋白。
全文摘要
本发明涉及分离的BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段、编码该BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段的DNA序列、含有该DNA序列的重组表达载体、含有该重组表达载体的宿主细胞、表达该BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段的方法、鉴别能结合该受体激酶蛋白的化合物的方法、测定该化合物在样品中的数量的方法、以及针对该BMP受体激酶蛋白的抗体。
文档编号C12R1/91GK1135771SQ94194218
公开日1996年11月13日 申请日期1994年11月23日 优先权日1993年11月24日
发明者J·S·库克, P·E·科雷亚, B·B·柯尼希, J·S·罗森鲍姆, J·廷格 申请人:普罗克特和甘保尔公司