突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其基因，和氨基酸的生产方法

专利名称：突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其基因，和氨基酸的生产方法
技术领域：
本发明涉及突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，编码它的基因，及氨基酸的生产方法，更详细地说它涉及一种具有使天冬氨酸的反馈抑制失敏的突变的基因及其应用。
背景技术：
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是一种见于大部分细菌和所有植物的酶。本酶的作用在于天冬氨酸和谷氨酸的生物合成，并为柠檬酸循环提供C4二羧酸以维持其流动。然而，在使用衍生物发酵生产氨基酸的过程中，对该酶的效果报导很少，其重要性尚不明确(Atsushi Yokotaand Isamu Shiio，Agric.Biol.Chem.，52，455-463(1988)，Josef Cremer et al.，Appl.Environ.Microbiol.，57，1746-1752(1991)，Petra，G.Peters-Weintisch，FEMS Microbiol.Letters，112，269-274(1993))。
另外，氨基酸是一种作为蛋白质成分广泛存在于细胞内的化合物，然而，为了经济的能量代谢和物质代谢，其生产被严格控制。该控制主要是反馈控制；其中代谢途径的最终产物抑制催化该途径前面步骤的一种酶的活性。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶在其活性表达方面亦受各种调节。
例如，就属于棒状杆菌属和埃希氏杆菌属的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来说，其活性被天冬氨酸抑制。因此，前面提及的，有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶参予的氨基酸生物合成，也被天冬氨酸抑制。
在先有技术中，开发了多种技术以在氨基酸发酵中进行有效生产，通过使用转化为对反馈控制失敏的突变株已实施亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等的发酵生产。然而，迄今为止，既没有转化为对天冬氨酸抑制失敏的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，也没有试图使用它进行天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸的发酵生产。
另一方面，ppc基因，即一种编码大肠埃希杆菌(EscherichiaColi)的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因已被克隆，并已测定其碱基顺序(Fujita，N.Miwa，T.Ishijima，S.，Izui，K.和Katsuki，H.，J.Biochem.，95，909-916(1984))，然而，即或在同种酶中，也还无对天冬氨酸的抑制失敏的变异型的报导。
本发明基于前面提及的观点，其目的是提供一种对天冬氨酸的反馈抑制基本失敏的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，编码它的基因，和它的应用。
发明的公开为完成前面提及的目的，本发明者进行了勤奋研究，结果发现，通过用其他氨基酸置换大肠埃希杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的特殊位点上的氨基酸，可以使天冬氨酸的抑制基本失敏，成功地得到了编码该突变型敏的基因，从而完成了本发明。
也就是说，本发明在于一种突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，它来源于一种属于埃希杆菌属的衍生物，其特征在于其中具有使天冬氨酸的反馈抑制失敏的突变，以及编码该突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA序列。
本发明进一步提供包含该DNA片段的属于埃希杆菌属或棒状杆菌的微生物，以及生产氨基酸的方法，其特征在于在适宜的培养基中培养这些微生物的任何一种，并将选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸的氨基酸从培养基中分离出来。
另外，在本说明书中，编码该变异体磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA序列或除此之外还包含启动子的DNA序列有时仅称为“本发明的DNA序列”，“突变型基因”或“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因”。
本发明在下文中将被详细说明。<1>突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶本发明的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下简称为“变异型酶”)为属于埃希杆菌属的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，它具有使天冬氨酸的反馈抑制失敏的突变。
该突变可为任一使前面提及的反馈抑制基本失敏而不丢失磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的酶活性者。例如，当具有突变的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶存在于埃希杆菌属微生物的细胞中时，这样的突变可使细胞对具有下述特性的化合物具有抗性对产生野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的属于埃希杆菌属的微生物表现生长抑制作用；在L-谷氨酸或者L-天冬氨酸存在下前述生长抑制作用恢复；并且抑制野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。
更具体地说，从磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端计算，可有列举(1)用赖氨酸置换625位谷氨酸的突变；(2)分别用组氨酸置换222位精氨酸并用赖氨酸置换223位谷氨酸的突变；(3)分别用苯丙氨酸置换288位丝氨酸，用赖氨酸置换289位谷氨酸，用异亮氨酸置换551位蛋氨酸并用赖氨酸置换804位谷氨酸的突变；(4)用苏氨酸置换867位丙氨酸的突变；(5)用半胱氨酸置换438位精氨酸的突变；和(6)用丝氨酸置换620位赖氨酸的突变。
此外，作为属于埃希杆菌属的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，从大肠埃希杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因推定的氨基酸序列(Fujita，N.Miwa，T.Ishijima，S.，Izui，K.和Katsuki，H.，J.Biochem.，95，909-916(1984))，示于序列表2中。另外，包含大肠埃希杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的质粒pT2的完整核苷酸序列，与氨基酸序列一同示于序列表1中。
前述突变型酶被下述本发明的DNA序列编码，通过在大肠埃希杆菌等中表达该DNA序列而生产该酶。<2>本发明的DNA序列和包含它的微生物本发明的DNA序列是编码前述突变型酶的DNA序列，并且在编码属于埃希杆菌属的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA片段中，在编码区具有使磷酸烯醇丙酮酸羧化酶对天冬氨酸的反馈抑制失敏的突变。
具体地说，可列举编码具有前述(1)至(6)突变的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA序列，例如，在碱基顺序表1中，可列举具有如下之一的DNA序列i)将碱基2109-2111的GAA转变为AAA或AAG的突变；ii)将碱基900-902的CGC转变为CAT或CAC，并将903-905的GAA转变为AAA或AAG的突变；iii)分别将碱基1098-1100的TCT转变为TTT或TTC，1101-1103的GAA转变为AAA或AAG，1887-1889的ATG转变为ATT、ATC或ATA，并将2646-2648的GAA转变为AAA或AAG的突变；iv)将碱基2835-2837的GCG转变为ACT、ACC、ACA和ACG中任何一个的突变；v)将碱基1548-1550的CGT转变为TGT或TGC的突变；和vi)将碱基2094-2096的AAA转变为TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC中任何一种的突变。
·将野生型的酶基因或具有其他突变的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因与宿主可接受的载体DNA连接取得的重组DNA进行突变处理，用重组DNA从转化体实施筛选，这样得到这样的突变型基因。也可将产生野生型酶的微生物进行突变处理，产生一个产生突变型酶的突变型株，然后从突变株中筛选突变型基因。可使用羟胺等对重组DNA进行突变处理。另外，当对微生物本身进行突变处理时，可使用通常用于人工突变的药物或方法。
此外，按照重叠延伸法(overlapping Extension)(Ho，S.N.，Hunt，H.D.Horton，R.M.，Pullen，J.K.和Pease，L.R.，Gene.77，51-59(1989))，位点特异突变法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth，in Enzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.et al.，Meth，in Enzymol.，154，367(1987))等方法，还可通过向野生型酶基因或具有其他突变的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因中引入例如氨基酸置换、插入及缺失等突变而取得前述突变型基因。这些方法基于一个原则，即非突变的基因DNA被用作一条模板，而在突变位点包含一个失配的合成DNA被用作引物之一，用以合成前述基因DNA的互补链，从而引入突变。通过使用这些方法，可在目标位点引起所需的突变。
此外，合成在两个末端都有限制性酶切端，并包含突变点的两侧的序列，并替换非突变基因的相对应部分，从而引入突变(盒突变方法)。
用于引入突变的，野生型酶基因或具有另一突变的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因，可为编码属于埃希杆菌属的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的任一种。该基因优选地测定碱基序列及克隆。如未被克隆，可用PCR等方法将含该基因的DNA片段扩增并分离，然后使用适当的载体进行克隆。
作为如上所述的基因，例如，可例举已被克隆并被测定碱基序列的大肠埃希杆菌的基因。(Fujita，N.Miwa，T.Ishijima，S.，Izui，K.和Katsuki，H.，J.Biochem.，95，909-916(1984))。该基因的编码区的序列如SEQ ID NO1(碱基号237-2888)中所示。
可通过使用天冬氨酸的类似物化合物进行载有含突变基因的宿主的筛选。该类似物化合物优选具有下列特性。即，它对产野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的属于埃希杆菌属的微生物表现生长抑制作用，前述生长抑制作用在存在L-谷氨酸或L-天冬氨酸下恢复，并且它抑制野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
如果使用微生物的生长抑制作为一项指标，从属于埃希杆菌属的微生物例如产野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的大肠埃希杆菌HB101中选择上述类似物化合物抗性的突变株，则更易得到对天冬氨酸的反馈抑制失敏的产磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的宿主微生物。
推荐必须提供一个C4二羧酸结构作为磷酸烯醇丙酮酸羧化酶抑制剂的基本结构。基于这一观点，本发明者筛查了多种化合物。在LB培养基中培养大肠埃希杆菌HB101，然后转至含有DL-2-氨基-4-膦酰基酪酸、溴琥珀酸、内消旋-2，3-二溴琥珀酸、2，2-二氟琥珀酸、3-溴丙酮酸、α-酮酪酸、α-酮己二酸、DL-苏-β-羟天冬氨酸、L-天冬氨酸-β-甲酯、α-甲基-DL-天冬氨酸、2，3-二氨基琥珀酸或天冬氨酸-β-肼中任何一种的M 9培养基(含硫胺素20μg/ml及亮氨酸和脯氨酸各3μg/ml)，然后随时间推移而测定在660nm处培养基的吸光率从而监测生长情况。
更进一步，研究了当这些化合物以它们的生长抑制浓度存在时是否可通过加入核酸(尿苷，腺苷各10mg/dl)、谷氨酸或天冬氨酸族氨基酸(天冬氨酸0.025％，蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸各0.1％)使其抑制作用恢复。
作为结果，三种化合物3-溴丙酮酸盐(3BP)(1)，天冬氨酸盐-β-肼(AHY)(2)，和D L-苏-β-羟天冬氨酸盐(βHA)(3)被选择。

这些类似物化合物对大肠埃希杆菌的生长抑制作用显示于

图1-3。更进一步，在单独加入前述抑制恢复物质或2或3种前述抑制恢复物质的混合物情况下，大肠埃希杆菌的生长恢复显示于图4-6。另外，作为对照，在加入抑制恢复物质而缺乏抑制物质情况下的生长显示于图7。顺便提及在图4-7中，添加剂1、2和3分别表示核酸，谷氨酸或天冬氨酸族的氨基酸。
更进一步，研究了类似物化合物对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性的抑制。按照The Journal of Biochemistry，Vol，67，No.4(1970)中所述方法从大肠埃希杆菌HB101株制备粗制的酶，并按照Eur.J.Biochem.，202，797-803(1991)中所述的方法测定酶的活性。
使在LB培养基中培养的大肠埃希杆菌破碎，并将悬液离心取得上清液，该上清液被用作粗制的酶溶液。通过测量在340nm处吸光率的下降进行酶活性的测定，测定系统中含2mM磷酸烯醇丙酮酸钾，0.1mM NADH，0.1M Tris-乙酸(pH8.5)，1.5U苹果酸脱氢酶和粗制酶，允许已知能影响该酶活性的乙酰辅酶A以0.1mM的浓度存在。结果显示于图8。
根据上述结果，显然前述3种化合物抑制大肠埃希杆菌的生长，该抑制作用不能单被核酸恢复，但该抑制作用可通过加入谷氨酸或天冬氨酸族的氨基酸被恢复。因此，这些类似物化合物被假定为磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的选择性抑制剂。
如下述实施例中所述，通过应用这些化合物，本发明成功地选择了产突变型磷酸烯醇丙酮酸盐的大肠埃希杆菌。
当使用前述化合物筛选具有目标突变型酶基因的转化子并且取得重组DNA时，则得到了该突变型酶基因。另一种方案是，在对微生物本身的突变处理情况下，当使用前述化合物筛选具有目标突变型酶基因的突变株时，含该目标突变型酶基因的DNA片段被从该株分离，并与适当的载体连接，从而取得该突变型酶基因。
另一方面，作为本发明者注意到精氨酸残基在大肠埃希杆菌的天冬氨酸盐结合蛋白中的重要性(Krikos，A.，Mouth，N.，Boyd，A，and Simon，M.I.Cell，33，615-622(1983)，Mowbray，S.Land Koshlan，D.E.J.Biol.Chem.，264，15638-15643(1990)，Milburn，M.V.，Prive，G.G.，Milligan，D.L.，Scott，W.G.，Yeh，J.Jancarik，J.，Koshland，D.E.and Kim，S.H.，Science，254，1342-1347(1991))勤奋研究的结果，发现通过将磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的438位的精氨酸转变为半胱氨酸，天冬氨酸的抑制作用基本失敏。为将438位精氨酸转化为半胱氨酸，可将编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的438位精氨酸的密码子转变为半胱氨酸的密码子。例如，在SEQ ID NO1中，1548-1550序号核苷酸的CGT可被转变为TGT或TGC。
更进一步，本发明者应用2，4，6-三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid)(TNBS)对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的赖氨酸残基进行化学修饰，该TNBS是一种用于化学修饰蛋白质的赖氨酸残基的化合物。在修饰反应中，允许能被用作磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的抑制剂的苹果酸一起存在。即，可假定在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的结合位点附近的赖氨酸残基可被结合的苹果酸保护而不被化学修饰。作为结果，假定620位赖氨酸残基对于苹果酸结合于磷酸烯醇丙酮酸盐是重要的，并发现通过将620位赖氨酸残基转变为丝氨酸残基使天冬氨酸的反馈抑制失敏而维持磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。为将620位赖氨酸残基转变为丝氨酸残基，可将编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的620位赖氨酸的密码子转变为丝氨酸的密码子。例如，在SEQ ID NO1中，具有核苷酸序列2094-2996的AAA或被TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC置换。
按照诸如重叠延伸方法(Ho，S.N.，Hunt，H.D.，Horton，R.M.，Pullen，J.K.and Pease，L.R.，Gene，77，51-59(1989))，位点特异突变方法(Kramer，W.and Frits，H.J.，Meth.inEnzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.et al.，Meth inEnzymol.，154，367(1987))等方法，密码子的转变可通过向作为野生型酶基因或具有另一突变的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因中引入诸如氨基酸置换、插入、缺失等突变而达到。这些方法基于这样一个原则，即将非突变的基因DNA用作模板，而在突变点包含一处失配的合成DNA用作引物之一以合成前述基因DNA的互补链，从而引入突变。使用这些方法，有可能在目标位点引起所希望的突变。
另一种方案是，即合成在两末端均有限制性酶末端并包含突变点两侧的一段序列，并替换非突变基因的对应部分，从而可引入突变(盒突变方法)。
该编码带按上述引入的突变的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA片段使用适当的宿主-载体系统表达，因而能够产生突变型酶。另一种方案是，甚至通过将本发明的DNA片段整合入宿主染色体DNA，可产生目标突变型酶。
作为宿主，可例举属于埃希杆菌属的微生物，例如，大肠埃希杆菌、棒状杆菌等。棒状杆菌包括属于棒杆菌属的杆菌，迄今一直分类于短杆菌属，但现在已统一入属于棒杆菌属的杆菌的属于短杆菌属的杆菌，和与属于棒杆菌属的杆菌紧密相关的属于短杆菌属的杆菌。顺便提及，优选地用于氨基酸生产的宿主将叙述如下。
另一方面，作为载体DNA，优选质粒载体，并且优选那些在宿主细胞中能自我复制的。当宿主是大肠埃希杆菌时，例如，pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等被例举。另外，也可应用噬菌体DNA载体。
进一步，当宿主为棒状杆菌时，可用的载体及包含它们的宿主例举如下。顺便提及，国际保藏中心的保藏号显示于括号中。
pAJ655大肠埃希杆菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒杆菌SR8201(ATCC 39135)pAJ844大肠埃希杆菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒杆菌SR8202(ATCC 39136)pAJ611大肠埃希杆菌AJ11884(FERMBP-138)pAJ3148谷氨酸棒杆菌SR8203(ATCC 39137)pAJ440枯草杆菌AJ11901(FERM BP-140)可按下述方法从保藏的微生物取得这些载体。使用溶菌酶和SDS使在对数生长期收集的细胞被溶菌，在30000g离心以从溶解产物取得上清液，向其中加入聚乙二醇以分离和提纯载体，使用氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心法。
为了用将本发明的DNA序列插入前述载体得到的重组载体转化大肠埃希杆菌，可以使用通常用于大肠杆菌的转化的方法，例如一种将细胞用氯化钙处理以增加DNA的通透性的方法(Mandel，M.and HigaA.，J.Mol.Biol.，53，159(1977))或类似方法。
更进一步，作为转化棒状杆菌的方法，还有前述的将细胞用氯化钙处理的方法，或者一种在特定的，可以参入DNA的生长期实现参入的方法。(Duncan，C.H.et al与枯草杆菌相关的报告)。更进一步，参入细菌细胞可通过形成易于参入质粒DNA的DNA接受体的原生质体或原生质球来完成。这些对枯草杆菌，放线菌和酵母是公知的(Chang，S et al.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)，Bibb et al.，Natuer，274，398(1978)，Hinnen，A et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 1929(1978))。另外，一种转化棒状杆菌的方法公布在日本公开专利2-207791号。
为表达前述宿主中本发明的DNA序列，可使用在微生物中有效地起作用的启动子例如lac，trp，PL等，或者当本发明的DNA序列包含一个磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的启动子时，可将它用作启动子。换言之，将棒状杆菌用作宿主时，也可能使用来源于属于短杆菌属的公知的trp启动子(日本公开专利62-244382号)及其同类物。
更进一步，如上所述，将本发明的DNA序列插入能自我复制的载体DNA并引入宿主，以使宿主将其作为质粒包含是可接受的，也可接受通过使用转座子(transposon)方法(Berg，D.E and Berg，C.M.，Bi o/Technol.，1，41 7(1 983))，Mu噬菌体(日本公开专利2-109985号)或同源重组(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.(1972))将本发明的DNA序列整合一种微生物的染色体。另外，为将本发明的DNA整合入棒状杆菌，使用公开在日本公开专利5-7491号的温度敏感质粒是可能的。
当如上所述用本发明的DNA序列转化的微生物被培养，并且DNA序列被表达时，即得到突变型酶。通过在酶反应系统中加入天冬氨酸测定活性，可明确是否该突变型酶得到了对天冬氨酸的失敏的反馈抑制。有可能使用分光光度测定法(Yoshinage，T.，Izui，K.and katsuki，H.，J.Biochem.，68，747-750(1970))和类似方法测定酶活性。
更进一步，本发明的DNA序列编码对天冬氨酸的反馈抑制失敏的突变型酶，因而包含该DNA序列的微生物可用于发酵生产如下所述的天冬氨酸族和谷氨酸族的氨基酸。
在如下的实施例中描述的包含该突变型酶基因的大肠埃希杆菌AJ12907、AJ12908、AJ12909和AJ12910于1993年8月3日以保藏号FERM P-13774、FERM P-13775、FERM P-13776、FERM P-13777保藏于工业科学与技术院全国生物科学和人类技术研究所(National Institute of Bioscience and HumanTechnology of Agency of Industrial Science andTechnology(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibaraki-Ken，日本；邮编305)，于1994年7月11日从初始保藏中心转移至基于布达佩斯条约的国际保藏中心，并按这一顺序分别以保藏号FERM BP-4734、FERM BP-47345、FERM BP-4736、FERM BP-4737入藏。<3>氨基酸的生产方法可通过在适当的培养基中培养包含本发明的DNA序列的微生物生产氨基酸，并分离所产生的氨基酸。作为这样的氨基酸，可例举L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸。
被引入本发明的DNA序列以用于生产各种氨基酸的优选宿主，及培养方法将例举如下。(1)本发明的氨基酸生产方法优选的宿主(i)L-赖氨酸生产优选的宿主作为用于按照本发明的L-赖氨酸生产的宿主，可例举属于埃希杆菌属的杆菌，优选产L-赖氨酸的大肠埃希杆菌。具体地，可例举一种对赖氨酸类似物具有抗性的突变株。这样的赖氨酸类似物是那些抑制属于埃希杆菌属的微生物生长，但在培养基中有L-赖氨酸共存时该抑制作用全部或部分失敏者。例如，有草酸赖氨酸，赖氨酸氧肟酸盐，S(2-氨基乙基)-半胱氨酸(下文简称为“AEC”)，γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺和类似物质。可通过对属于埃希杆菌属的微生物施予常规的人工突变处理取得对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变株。具体地，作为用于L-赖氨酸生产的细菌株，可例举大肠埃希杆菌AJ11442(入藏号为FERM P-5084，见日本公开专利56-18596号第471页左下栏)。
另一方面，已被用作产L-赖氨酸菌的各种棒状杆菌的人工突变株也可用于本发明。这些人工突变株如下AEC抗性的突变株；其生长需要氨基酸如L-高丝氨酸的突变株(日本专利出版物第48-28078和56-6499号)；表现AEC抗性并需要氨基酸如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸等的突变株(美国专利第3708395和3825472号)；表现对DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-十二烷内酰胺、醌式和N十二烷亮氨酸抗性的产L-赖氨酸突变株；表现对草酰乙酸盐脱羧酶或呼吸系统酶的抑制剂抵抗的产L-赖氨酸突变株(日本公开专利第50-53588、50-31093、52-102498、53-86089、55-9783、55-9759、56-32995、56-39778号，及日本专利出版物第53-43591和53-1833号)；需要环己六醇或乙酸的产L-赖氨酸突变株(日本公开专利第55-9784和56-8692号)；表现对氟丙酮酸盐或不低于34℃的温度敏感的产L-赖氨酸突变株(日本公开专利第55-9783和53-86090号)；表示对乙二醇抗性并产L-赖氨酸的短杆菌属或棒杆菌属的突变株(见美国专利申请编号333455)。
下面列举的是用于赖氨酸生产的具体的棒状杆菌乳酸发酵短杆菌AJ12031(FERM-BP277)，见日本公开专利60-62994号第525页；
乳酸发酵短杆菌ATCC39134，见日本公开专利60-62994号第473页右下栏；乳酸发酵短杆菌AJ3463(FERM-P 1987)，见日本专利出版物第51-34477号。
另外，下述棒状杆菌的野生株也可以同样方式用于本发明。
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870乙酰谷氨酸棒杆菌ATCC15806帚石南棒杆菌ATCC15991谷氨酸棒杆菌ATCC13032ATCC13060(分枝短杆菌)ATCC14020(乳酸发酵短杆菌)ATCC13869(百合棒杆菌)ATCC15990栖糖蜜棒杆菌ATCC17965解糖短杆菌 ATCC14066immariophilum短杆菌 ATCC14068玫瑰色(roseum)短杆菌ATCC13825暗黄短杆菌 ATCC13826thiogenitalis短杆菌 ATCC19240嗜氨细杆菌 ATCC15354(ii)L-苏氨酸生产优选的宿主大肠埃希杆菌B-3996(RIA 1867)，见日本公开专利第3-501682(PCT)；大肠埃希杆菌AJ12349(FERM-P 9574)，见日本公开专利第2-458号第887页左上栏；
大肠埃希杆菌AJ12351(FERM P-9576)，见日本公开专利第2-458号第887页右下栏；大肠埃希杆菌AJ12352(FERM P-9577)，见日本公开专利第2-458号第888页左上栏；大肠埃希杆菌AJ11332(FERM P-4898)，见日本公开专利第2-458号第889页左上栏；大肠埃希杆菌AJ12350(FERM P-9575)，见日本公开专利第2-458号第889页左上栏；大肠埃希杆菌AJ12353(FERM P-9578)，见日本公开专利第2-458号第889页右上栏；大肠埃希杆菌AJ12358(FERM P-9764)，见日本公开专利第2-458号第890页左上栏；大肠埃希杆菌AJ12359(FERM P-9765)，见日本公开专利第2-458号第890页左上栏；大肠埃希杆菌AJ11334(FERM P-4900)，见日本公开专利出版物第1-29559号第201页第6栏；大肠埃希杆菌AJ11333(FERM P-4899)，见日本公开专利出版物第1-29559号第201页第6栏；大肠埃希杆菌AJ11335(FERM P-4901)，见日本公开专利出版物第1-29559号第202页第7栏。
下面的细菌株系作为棒状杆菌而例举乳酸发酵短杆菌AJ11188(FERM P-4190)，见日本公开专利第60-87788号第473页右上栏；谷氨酸棒杆菌AJ11682(FERM BP-118)，见日本公开专利出版物第2-31956号第230页第8栏；
暗黄短杆菌AJ11683(FERM BP-119)，见日本公开专利出版物第2-31956号第231页第10栏；(iii)L-蛋氨酸生产优选的宿主用于L-蛋氨酸生产的菌株例举如下大肠埃希杆菌AJ11457(FERM P-5175)，见日本公开专利第56-35992号第552页右上栏；大肠埃希杆菌AJ11458(FERM P-5176)，见日本公开专利第56-35992号第552页右上栏；大肠埃希杆菌AJ11459(FERMP-5177)，见日本公开专利第56-35992号第552页右上栏；大肠埃希杆菌AJ11539(FERM P-5479)，见日本公开专利第56-144092号第435页左下栏；大肠埃希杆菌AJ11540(FERM P-5480)，见日本公开专利第56-144092号第435页左下栏；大肠埃希杆菌AJ11541(FERM P-5481)，见日本公开专利第56-144092号第435页左下栏；大肠埃希杆菌AJ11542(FERM P-5482)，见日本公开专利第56-144092号第435页左下栏。(iv)L-天冬氨酸生产优选的宿主用于L-天冬氨酸生产的菌株例举如下暗黄短杆菌AJ3859(FERM P-2799)，见日本公开专利第51-61689号第524页左上栏；乳酸发酵短杆菌AJ3860(FERMP-2800)，见日本公开专利第51-61689号第524页左上栏；嗜乙酸乙酸棒杆菌AJ3877(FERM P-2803)，
见日本公开专利第51-61689号第524页左上栏；谷氨酸棒杆菌AJ3876(FERM P-2802)，见日本公开专利第51-61689号第524页左上栏；(v)L-异亮氨酸优选的宿主大肠埃希杆菌KX141(VKPM-B 4781)(见日本公开专利第4-33027号第45段)被作为属于埃希杆菌属的杆菌例举，而乳酸发酵短杆菌AJ12404(FERM P-10141)(见日本公开专利第2-42988号第603页左下栏)和暗黄短杆菌AJ12405(FERM P-10142)(见日本公开专利第2-42988号第524页左下栏)则被作为棒状杆菌例举。(vi)L-谷氨酸生产优选的宿主下列菌株被作为属于埃希杆菌属的菌株例举大肠埃希杆菌AJ12628(FERMP-12380)，见法国专利出版物第2 680 178号(1993)；大肠埃希杆菌AJ12624(FERM P-12379)，见法国专利出版物第2 680 178号(1993)；下列菌株被作为棒状杆菌例举乳酸发酵短杆菌AJ12745(FERM BP-2922)，见日本公开专利第3-49690号第561页右下栏；乳酸发酵短杆菌AJ12746(FERM BP-2923)，见日本公开专利第3-49690号第561页左上栏；乳酸发酵短杆菌AJ12747(FERM BP-2924)，见日本公开专利第3-49690号第562页左上栏；乳酸发酵短杆菌AJ12748(FERM BP-2925)，见日本公开专利第3-49690号第562页左上栏；
暗黄短杆菌ATCC14067，见日本公开专利第5-3793号第3页表1；谷氨酸棒杆菌ATCC21492，见日本公开专利第5-3793号第3页表1。(vii)L-精氨酸生产优选的宿主下列菌株被作为属于埃希杆菌属的细菌例举大肠埃希杆菌AJ11593(FERM P-5616)，见日本公开专利第57-5693号第468页左上栏；大肠埃希杆菌AJ11594(FERM P-5617)，见日本公开专利第57-5693号第468页右上栏；下列菌株被作为棒状杆菌例举暗黄短杆菌AJ12144(FERM P-7642)，见日本公开专利出版物第5-27388号第174页第4栏；谷氨酸棒杆菌AJ12145(FERM P-7643)，见日本公开专利出版物第5-27388号第174页第4栏；暗黄短杆菌ATCC21493，见日本公开专利第5-3793号第3页表1；谷氨酸棒杆菌ATCC21659，见日本公开专利第5-3793号第3页表1。(viii)L-脯氨酸生产优选的宿主下列菌株被作为属于埃希杆菌属的细菌例举大肠埃希杆菌AJ11543(FERM P-5483)，见日本公开专利第56-144093号第425页左下栏；大肠埃希杆菌AJ11544(FERM P-5484)，见日本公开专利第56-144093号第435页左下栏。
下列菌株被作为棒状杆菌例举乳酸发酵短杆菌AJ11225(FERM P-4370)，见日本公开专利第60-87788号第473页左上栏；暗黄短杆菌AJ11512(FERM P-5332)，见日本公开专利出版物第62-36679号第185页第2栏；暗黄短杆菌AJ11513(FERMP-5333)，见日本公开专利出版物第62-36679号第185页第2栏；暗黄短杆菌AJ11514(FERM P-5334)，见日本公开专利出版物第62-36679号第185页第2栏；谷氨酸短杆菌AJ11522(FERM P-5342)，见日本公开专利出版物第62-36679号第185页第2栏；谷氨酸短杆菌AJ11523(FERM P-5343)，见日本公开专利出版物第62-36679号第185页第2栏。(2)培养方法培养前述宿主的方法与在先技术中产氨基酸微生物的培养方法无特殊区别。即，使用含碳源，氮源和无机离子的普通培养基，可任选有机的微量营养素例如氨基酸、维生素等。
作为碳源、葡萄糖、蔗糖、乳糖及其同类物质，以及淀粉水解酶、乳清、糖蜜和含有它们的同类物质可被应用。作为氮源、氨气、铵盐水溶液、铵盐和类似物质可被应用，顺便提及，当对氨基酸或类似物质营养需求的突变株被用作宿主时，需要向培养基中适当添加该菌株需要的营养素如氨基酸或类似物质。赖氨酸生产用的培养基的一个实例显示于下面表1作为用于氨基酸生产的一种培养基。顺便提及，碳酸钙是在另外消毒后加至其它成分的。
表1培养基成分 混合量葡萄糖 5g/dl硫酸铵 2.5g/dl磷酸二氢钾 0.2g/dl7水硫酸镁 0.1g/dl酵母提取物 0.05g/dl盐酸硫胺 1μg/l生物素 300μg/l7水硫酸亚铁1mg/dl4水硫酸锰 1mg/dl碳酸钙 2.5g/dl(pH7.0)培养在有氧条件下进行，适当地控制培养基的pH值和温度，直至氨基酸的产生和积累基本停止。为收集培养基中这样积累的氨基酸，可使用常规的方法。
图的简要描述图1显示3-溴丙酮酸盐的生长抑制作用。
图2显示天冬氨酸盐-β-肼的生长抑制作用。
图3显示DL-苏-β-羟天冬氨酸盐的生长抑制作用。
图4显示抑制恢复物质对3-溴丙酮酸盐的作用。
图5显示抑制恢复物质对天冬氨酸盐-β-肼的作用。
图6显示抑制恢复物质对DL-苏-β-羟天冬氨酸盐的作用。
图7显示生长恢复因子对生长的影响。
图8显示生长抑制物质对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的抑制。
图9显示天冬氨酸对本发明的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的抑制。
图10显示天冬氨酸对本发明磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的抑制。
图11显示向磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因引入突变的一种方法。
图12显示天冬氨酸对野生型和从N-末端计算第438位精氨酸被半胱氨酸替换的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性的影响。
图13显示天冬氨酸对野生型和从N-末端计算第620位赖氨酸被丝氨酸替换的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性的影响。
实现本发明的最佳方法参照实施例本发明将在下面被更具体地阐述。
实施例1突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的获得使用通过将已被克隆并测定碱基序列的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因插入载体质粒pBR322的SalI位点获得的质粒pS2制备突变型基因。pS2有一个氨苄青霉素抗药基因做为一个抗药标记基因(Sabe，H.etal.，Gene，31，279-283(1984))。pS2所含的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列与前述质粒pT2中所含的相同。
pS2 DNA用羟胺处理溶液(20μg pS2 DNA 0.05M磷酸钠(pH6.0)，1mM EDTA，0.4M羟胺)在75℃处理2小时。由于羟胺处理受pH的影响，将用氢氧化钠调pH值至6.0的80μl 1M盐酸羟胺和1mM EDTA溶液，100μl 0.1M磷酸钠(pH6.0)和1mMEDTA溶液，和含2μg pS2 DNA的TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA)缓冲液混合，最后加水至200μl。
上述条件是当用处理后的pS2转化大肠埃希杆菌HB101时，转化子在含氨苄青霉素的培养基中在处理前状态下具有0.2％生存率的条件。
用经羟胺处理的pS2转化大肠埃希杆菌HB101，将大肠埃希杆菌铺在含氨苄青霉素的固体平板培养基上以获得约10000克隆的转化子。将它们悬溶于液体培养基中，并铺在含有作为天冬氨酸类似物化合物的3-溴丙酮酸盐(3BP)、天冬氨酸盐-β-氧肟酸盐(AHX)、天冬氨酸盐-β-肼(AHY)和D L-苏-β-羟天冬氨酸盐(βHA)中任意一种的固体板状培养基上，浓度接近最小抑制浓度，以使每个平板具有103-105个细胞，然后筛选生长的克隆。
从这样得到的100株类似物化合物抗性株，它们中的每一株产生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶均按照The Journal of Biochemistry，Vol 67，No.4(1970)中所述方法被部分提纯，并研究类似物化合物对酶活性的抑制作用。酶活性的测定按照上述同样的方法进行。
更进一步，从产具有不被类似物化合物抑制的活性的突变型酶的菌株中分离出质粒，并将其引入作为磷酸烯醇丙酮酸羧化酶缺乏株的大肠埃希杆菌pCR1(Sabe，H.et al.，Gene，31，279-283(1984))，以证实突变型酶的产生。
这样得到了5个含有突变型酶基因的转化子。作为测定这些基因的碱基序列的结果，2株具有同样的突变，得到4种突变基因。含有它们的转化子被称为AJ12907、AJ12908、AJ12909和AJ12910，于1993年8月3日被保藏于工业科技院全国生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本；邮编305)，入藏号FERM P-13774、FERM P-13775、FERM P-13776和FERM P-13777，于1 994年7月11日从初始保藏中心转移至基于布达佩斯条约的国际保藏中心，并按这一顺序分别以保藏号FERM BP-4734、FERM BP-4735、FERM BP-4736、FERM BP-4737入藏。更进一步，含有它们的质粒按此顺序分别被称为pBP5、pHA19、pBP122和pR6。每一质粒中包含的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因所含有的突变显示于表2。表中的数值代表SEQ ID NO1中的核苷酸序号或氨基酸序号。
表2转化子 质粒突变 与突变相关的氨基酸置换AJ12907 pBP52109G→A625Glu→LysAJ12908 pHA19901G→A222Arg→His903G→A223Glu→LysAJ12909 pBP1221099C→T288Ser→Phe1101G→A289Glu→Lys1889G→A551Met→Ile2646G→A804Glu→LysAJ12910 pR62835G→A867Ala→Thr附带说明对AJ12907和AJ12909在含有500μg/ml 3BP的培养基中进行选择，对AJ12908在含1000μg/ml βHA的培养基中而对AJ12910在含500μg/ml AHY的培养基中进行选择。
实施例2突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶研究了前述4种转化子产生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶对天冬氨酸的敏感性。这些菌株缺乏来源于宿主的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因，因而所产生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于质粒。
按照公知的方法研究对天冬氨酸的敏感性(Yoshinaga，T.，Izui，K.and Katsuki，H.，J.Biochem.，68，747-750(1970))。即，作为每一种转化子或含有pS2的大肠埃希杆菌在乙酰辅酶A存在下产生的酶活性的测定结果，对天冬氨酸的敏感性测定的结果如图9和10中。其中乙酰辅酶A公知在0.1mM或1mM浓度下在活性测定系统中可影响该活性。
按照该结果，显然当天冬氨酸以高浓度存在时野生型酶失去其活性，而本发明的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶则基本继续维持其活性。
实施例3用引入突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的大肠埃希杆菌发酵生产L-苏氨酸作为大肠埃希杆菌的产苏氨酸菌，B-3996株(日本公开专利第3-501682号(PCT))在迄今已知者中具有最高的生产能力。因此在评价突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶时，B-3996被用作宿主。该B-3996株被保藏在遗传学和工业微生物培养研究所(ResearchInstitute for Genetics and Industrial MicroorganismBreeding)，登记号为RIA1867。进一步，选择pBP5作为被评价的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，对其进行一项实验。
按照Hanahan的方法(J.Mol.Biol.，Vol.106，p577(1983))，将具有突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的质粒pBP5引入大肠杆菌B-3996，并将转化子分离。作为对照，用同样的方法用作为表达野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的质粒的pS2转化大肠埃希杆菌B-3996将大肠埃希杆菌B-3996和从那里得到的转化子分别接种于装入20ml具有表3中的成分的培养基的500ml Sakaguchi烧瓶中，并在37℃培养40小时以研究L-苏氨酸的产量，即得到表4中所示的结果。顺便说明，前述培养基分为两部分葡萄糖和MgSO4·7H2O，和其它成分，并用KOH调节pH为7.0，随后在115℃压热灭菌10分钟，而后，在将它们混合后，加入30g/L另外灭菌的CaCO3。
表3成分 混合量(g/l)葡萄糖40硫酸铵16磷酸二氢钾17水硫酸镁 17水硫酸亚铁 0.015水硫酸锰 0.01酵母提取物(Difco) 2L-蛋氨酸 0.5碳酸钙30表4菌株 苏氨酸产量(g/l)大肠埃希杆菌B-3996 15.7大肠埃希杆菌B-3996/pS2 15.8大肠埃希杆菌B-3996/pBP516.8如从结果所阐明，包含具有本发明的DNA序列的突变型酶表达质粒的大肠埃希杆菌B-3996/pBP5与含有表达野生型酶的质粒的大肠埃希杆菌B-3996/pS2相比，具有提高的产苏氨酸能力。
实施例4使用引入突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的大肠埃希杆菌发酵生产L-谷氨酸作为大肠埃希杆菌的产谷氨酸菌，日本公开专利第4-11461号中所述的大肠埃希杆菌AJ-12628在迄今已知者中具有最高的生产能力。因此在评价突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶时，AJ-12628被用作宿主。
该AJ-12628株已以登记号FERM BP-385入藏工业科学与技术院全国生物科学和人类技术研究所。进一步，pBP5被选作被评价的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，并对其进行一项实验。
该具有突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的质粒pBP5按照Hanahan的方法(J.Mol.Biol.，Vol，106，p 577(1983))被引入大肠埃希杆菌AJ-12628，并分离出转化子。以同样方式，使用pS2的大肠埃希杆菌转化子被分离。
将大肠埃希杆菌AJ-12628和从那里得到的转化子分别接种于注入20ml具有表5中的成分培养基的500ml Sakaguchi烧瓶中，并在37℃培养36小时以研究L-谷氨酸的产量，即得到表6中显示的结果。附带要说明的是，前述培养基被分为两部分葡萄糖和MgSO4·7H2O，和其它成分，并用KOH调节pH为7.0，随后在115℃压热灭菌10分钟，而后，在将它们混合后，加入30g/L另外灭菌的CaCO3。
表5成分混合量(g/l)葡萄糖 40硫酸铵 16磷酸二氢钾 17水硫酸镁 17水硫酸亚铁 0.015水硫酸锰 0.01酵母提取物(Difco) 2碳酸钙 30
表6菌株 谷氨酸产量总量(g/l)大肠埃希杆菌AJ-12628 18.0大肠埃希杆菌AJ-12628/pS2 18.3大肠埃希杆菌AJ-12628/pBP519.6如该结果所阐示，含有具有本发明的DNA序列的突变型酶表达质粒的大肠埃希杆菌AJ-12628/pBP5与含有表达野生型酶的质粒的大肠埃希杆菌AJ-12628/pS2相比较，具有提高的产谷氨酸盐能力。
实施例5使用引入突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的棒状杆菌生产L-赖氨酸为在棒状杆菌中引入和表达该突变型基因，先取得一个来源于属于短杆菌属的杆菌的启动子，再将其与突变型基因连接以制备表达型质粒。更进一步，将它引入属于短杆菌属的杆菌以进行L-赖氨酸的生产。<1>来源于属于短杆菌属的杆菌的天冬氨酸激酶(AK)基因的获得。
按照常规方法从乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)野生株(ATCC13869)制备染色体DNA。通过PCR(多聚酶链反应polymerase Chainreaction；见White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))将A K基因从染色体DNA中扩增。对于用于扩增的DNA引物，一段23聚体的寡核苷酸(SEQ ID NO3)和一段21聚体的寡核苷酸(SEQ ID NO4)被合成，以扩增一个约1643bp的编码基于一段在谷氨酰棒杆菌中已知序列的AK基因的区域(见MolecularMicrobiology(1991)5(5)，1197-1204，Mol.Gen.Genet.(1990)224，317-324)。
按照常规的phosphoamidite方法(见Tetrahedron letters(1981)，22，1859)使用Biosystems Co.提供的DNA合成仪380B型进行DNA的合成。在PCR反应中，使用Takara Shuzo Co.Ltd.生产的PJ2000型DNA热循环仪(Thermal Cycler)，并按照厂家指定的方法使用Taq DNA多聚酶进行基因扩增。
被扩增的1643bp的基因片段用琼脂糖凝胶电泳法证实，然后用常规方法提纯从凝胶上切下的片段，并用限制性酶Nru I(由TakaraShuzo Co.Ltd.生产)和Eco RI(由Takara Shuzo CO.，Ltd.生产)剪切。为基因片段的克隆载体使用pHSG399(见Takeshita，S.等；Gene(1987)，61，63-74)。将pHSG399用限制性酶Sma I(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)和限制性酶Eco RI剪切，并与被扩增的AK基因片段连接。
使用DNA连接试剂盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)按指定的方法连接DNA。用这种方法，制造出一种pHSG399与从短杆菌染色体扩增的AK基因片段连接而成的质粒。具有来自作为野生株的ATCC13869的AK基因的该质粒被称为p399AKY。<2>确定乳酸发酵短杆菌的AK基因的碱基序列AK质粒p399AKY被制备，并且AK基因的碱基序列被测定。碱基序列的测定按照Sanger等人的方法(F.Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)等)进行。结果显示于SEQID NO5和SEQ ID NO7。该DNA片段具有两个开放阅读框(open reading frames)分别对应于A K的α-亚单位和β-亚单位。在SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中对应于每一个开放阅读框的氨基酸序列与核苷酸序列一同显示。进一步，只有对应于每一个开放阅读框的氨基酸序列显示于SEQ ID NO6和SEQ ID NO8。<3>磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达载体的制备从作为具有野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的质粒的pS2和从作为具有所得到的该突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的质粒pBP5提含磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的约4.4kb的Sal I片段，将该片段插入被广泛用于大肠埃希杆菌的质粒载体pHSG399的Sal I位点。制造的质粒对野生型称为pHS2而对突变型称为pHBP5。
为将pHS2和pHPB5转变为在短杆菌中表达的质粒，在短杆菌中起作用的质粒启动子和复制起点被引入。作为启动子，从p399AKY提取一段含有从Nru I位点第1位至Apa LI位点第207位的碱基序列的基因片段，该片段被推定是被克隆的AK基因的启动子区，将其插入位于pHS2和pHBP5的结构基因前约60bp的一个Ava I位点使转录按常规方向进行。
进一步，一段使短杆菌中质粒能自主复制的基因片段，即质粒的复制起点被引入位于载体上的一个位点。一个含有质粒的复制起点的基因片段被从用于短杆菌的载体pHC4中提取(见日本公开专利第5-7491号第10段，含同样质粒的大肠埃希杆菌AJ 12039被保藏在工业科学与技术院全国生物科学和人类技术研究所，保藏号为FERM P12215)，通过引入连接子(Linker)使两个末端的限制性酶位点被修饰为Pst I位点。
这个片段被引入已被加上来源于短杆菌的启动子的质粒的载体部分中的Pst I位点。所构建的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达质粒分别对于来源于pS2的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶质粒命名为pHS2B，和对来源于pBP5的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶质粒命名为pHBP5B。<4>通过使用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达型质粒生产L-赖氨酸已被制备的pHS2B和pHBP5B被分别引入作产L-赖氨酸菌的乳酸发酵短杆菌AJ3467(见日本专利出版物第51-34477号)。为引入该基因，使用一种采用电脉冲的转化方法(见日本公开专利第2-207791号)。宿主株和转化子在31.5℃在含具有表7中成分的赖氨酸生产培养基中摇动培养72小时。上述培养基如此制备将表中除CaCO3外所列成分加水至1升，并用KOH调至pH8.0，继以在115℃压热灭菌15分钟，然后再将已经过热灭菌的CaCO3加入。培养后在培养基中L-赖氨酸的积累量显示于表8。
表7成分1升中的混合量葡萄糖 100g硫酸铵 55g大豆浓缩物*35ml磷酸二氢钾 1g7水硫酸镁 1g维生素B120g生物素 5g尼克酰胺5mg7水硫酸亚铁 0.01g5水硫酸锰 0.01g碳酸钙 50g*Aj i nomoto Co.，Ltd，产品(商品名Mamenou)
表8菌株 赖氨酸产量总量(g/l)乳酸发酵短杆菌AJ3463 20.0乳酸发酵短杆菌AJ3463/pHS2B22.0乳酸发酵短杆菌AJ3463/pHBP5B 25.0如该结果所示，含有具有本发明的DNA序列突变型酶表面质粒的乳酸发酵短杆菌AJ3463/pHBP5B与含有表达野生型酶的质粒的乳酸发酵短杆菌AJ3463/pHS2B比较，具有提高的赖氨酸生产能力。
实施例6本发明的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及其基因的其它实例<1>突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的制备在制备编码突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA时，克隆在质粒pT2中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因被用作材料。
用于包含(harbor)质粒pT2的宿主优选缺乏磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的，以便只检出来自质粒的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。大肠埃希杆菌F1 5(Hfr，recAl，met，△(ppc-argECBH)，Tn10)被用作这种缺乏株。大肠埃希杆菌AJ-12873，即F15株中被允许包含pT2者，以FERM P-13752保藏于工业科学与技术院全国生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shiIbaraki-ken，日本；邮编305)入藏日1993年7月15日，于1994年7月11日从初始保藏处转移至基于布达佩斯条约的国际保藏中心，并以保藏号FERM BP-4732保藏。另外，pT2的完整碱基序列在SEQUENCE ID NO1中被显示。
为通过使用pT2将磷酸烯醇丙酮酸羧化酶438位精氨酸的密码子置换为半胱氨酸的密码子，使用PCR(多聚酶链反应)方法的重叠延伸法(Ho，S.N.，Hunt，H.D.，Horton，R.M.，Pullen，J.K.andPease，L.R.，Gene，77，51-59(1989))被采用。
顺便说明，PCR方法是一种方法，其中的扩增循环包括双链DNA热变性为单链DNA，将对应于被扩增位点双末端序列的寡核苷酸引物与前述热变性DNA退火，并且重复前述以寡核苷酸为引物的多聚酶反应，因而前述DNA序列以指数函数方式扩增。
通过PCR方法受到位点特异性突变的区显示于图11。用于本发明的4种引物是具有邻近438位精氨酸的密码子的序列的引物c(SEQUENCE ID NO11，对应于SEQUENCE ID NO1中第1535-1545位碱基)，具有与引物c互补的序列的引物b(SEQUENCE IDNO10)，具有从那里向上游的一段序列的引物a(SEQUENCE IDNO9，对应于SEQUENCE ID NO1中第1185-1200位碱基)，以及具有与一段下游序列互补的序列的引物d(SEQUENCE ID NO12，对应于SEQUENCE ID NO1中第2327-2342号碱基)。
在引物b和引物c中，第438位精氨酸的密码子(CGT)被半胱氨酸的密码子(TGT)置换。这一置换还可使用半胱氨酸的另一种密码子TGC。更进一步，第435位天冬氨酸的密码子的第3个字母C可被T置换，从而可在内部引入一个Eco RI位点而无氨基酸的置换，这样可用它作为一个指标选择一种突变型质粒。尽管如此，该突变对本发明来说不是主要的。
当使用pT2 DNA作为模板并且引物a和引物b作为引物进行PCR反应时，从突变位点上游至突变位点的一个片段(图11中的AB片段)被扩增。进一步，当使用引物c和引物d进行PCR反应时，位于突变位点下游的一个片段(图11中CD片段)被扩增。当扩增产物的每一种(AB、CD)在热变性后再次退火以进行PCR时，它们连接成为一个片段(图11中的AD片段)。顺便说明，该PCR反应是通过重复30次循环进行的，每一次包括在94℃加热1分钟继以变性(94℃，1.5分钟)，退火(50℃，2分钟)，和多聚酶的延长反应(72℃，3.5分钟)。另外，反应成分显示于表9。
表9成分 PCR片段(()终浓度 AB CD ADH2O 53.553.553.510倍反应缓冲液10 10 101.25mM dNTP的混合物 16 16 1620μM引物a(1μM) 5 - 520μM引物b(1μM) 5 - -20μM引物c(1μM) - 5 -20μM引物d(1μM) - 5 510μg/μl pT2(0.1μg) 10 10 -PCR片段AB*- - 5PCR片段CD*- - 52.5U/μl Taq多聚酶0.5 0.5 0.5总量 100μl 100μl 100μl*PCR片段AB和CD被如此制备在PCR反应后，通过将其从聚丙酰胺凝胶上回收10μl，并将其溶解于5μl的TE(10mMTris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0))。
在按上面所述得到的AD片段中，在上游一侧存在一个Bss HII位点(SEQ ID NO1中1231-1236)并在下游一侧存在一个Sol I位点，因而使用这些酶进行完全的消化以置换质粒pT2的相应区(图11)。<2>抑制失敏的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的选择将大肠埃希杆菌用如上所述得到的质粒转化，并培养被转化株回收质粒以选择一种被Eco RI剪切的。至于被选择的DNA，用双脱氧法确定通过前述PCR方法扩增的区的碱基序列以证实目的碱基置换已被引入。这种质粒被称为pT2R438C。通过将该质粒引入前述大肠埃希杆菌F15得到的菌株(AJ12874)已以FERM P-13753保藏在工业科学和技术院全国生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本；邮编305)，入藏日为1993年7月15日，于1994年7月11日从初始保藏处转移至基于布达佩斯条约的国际保藏中心并以保藏号FERM BP-4733被保藏。
pT2R438C的碱基序列是SEQ ID NO1中的第1541位和第1550位核苷酸分别被从C置换为T的序列。<3>天冬氨酸对突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的抑制作用的失敏的证实研究了前述含有pT2R438C的大肠埃希杆菌AJ12874产生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶对天冬氨酸的敏感性。顺便提一句，如上所述，由于大肠埃希杆菌F15是缺乏磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的，因而AJ12874产生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于质粒。
按照公知的方法(Yoshinaga，T.，Izui，K.and Katsuki，H.，J.Biochem.，68，747-750(1970))研究对天冬氨酸的敏感性。即，作为在公知可在活性测定系统中影响活性的乙酰辅酶A以1mM或2mM浓度存在下酶活性的测定结果，测定的对天冬氨酸的敏感性显示于图12 。
显然在天冬氨酸为高浓度时，野生型酶基本失去其活性，而本发明的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶继续维持其活性。<4>制备突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(II)为将质粒pT2中携带的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因中620位赖氨酸的密码子用丝氨酸的密码子替代，应用PCR(多聚酶链反应)方法的重叠延伸法(Ho，S.N.，Hunt，H.D.，Horton，R.M.，Pullen，J.K.and Pease，L.R.，Gene，77，51-59(1989))被采用。具体步骤按照<1>中所述方法。携带由目标置换(aimed replacement)构建的突变型基因的质粒被称为pT2K620S。进一步，得到的突变型酶被称为K620S突变型酶。<5>关于突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶天冬氨酸的抑制失敏的证实关于由通过将质粒pT2K620S引入前述大肠埃希杆菌F15得到的转化子生产的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，对天冬氨酸的敏感性得到研究。顺便说明，如上所述，由于大肠埃希杆菌F15缺乏磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，任何由转化子产生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶均来源于该质粒。
按照公知的方法(Yoshinaga，T.，Izui，K.and Katsuki，H.，J.Biochem.，68，747-750(1970))研究对天冬氨酸的敏感性。即作为在公知在活性测定系统中能影响活性的乙酰辅酶A以1mM或2mM浓度存在下该酶活性的测定结果，对天冬氨酸的敏感性如图13所示被测定。
显然当天冬氨酸以高浓度存在时野生型酶基本丧失其活性，而本发明的该型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶继续维持其活性。
在图13中，还描绘出一种第650位赖氨酸被丝氨酸置换的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(K650A突变型酶)，和一种第491位赖氨酸被丝氨酸置换的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(K491突变型酶)对天冬氨酸的敏感性。对于这些酶，天冬氨酸抑制不失敏。
工业应用性本发明的DNA序列编码该突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，并且，含有该DNA序列的微生物产生前述这种酶。
本发明的这种突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性基本不受天冬氨酸的抑制，因此它可被用于发酵生产受天冬氨酸及类似物质生物合成调节的氨基酸。
序列表(1)一般信息(i)申请人Ajinomoto Co.Inc.(ii)发明名称突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其基因和氨基酸的方法(iii)序列数12(iv)通讯地址(A)地址(B)街道(C)城市(D)州(E)国家(F)邮编(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本申请资料(A)申请号(B)提交日(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号(B)提交日
(viii)代理人/事务所信息(A)名称(B)登记号(C)参考/摘要号(ix)电信信息(A)电话(B)电传(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度5186(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学环形的(ii)分子类型其它..基因组的DNA和载体DNA(iii)假设无(iv)反义无(vi)原始来源(A)生物大肠埃希杆菌(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置237..2888(xi)序列描述SEQ ID NO1
TCGACCGGCG ATTTTTTAAC ATTTCCATAA GTTACGCTTA TTTAAAGCGT CGTGAATTTA60ATGACGTAAA TTCCTGCTAT TTATTCGTTT GCTGAAGCGA TTTCGCAGCA TTTGACGTCA120CCGCTTTTAC GTGGCTTTAT AAAAGACGAC GAAAAGCAAA GCCCGAGCAT ATTCGCGCCA180ATGCGACGTG AAGGATACAG GGCTATCAAA CGATAAGATG GGGTGTCTGG GGTAAT236ATG AAC GAA CAA TAT TCC GCA TTG CGT AGT AAT GTC AGT ATG CTC GGC 284Met Asn Glu Gln Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly1 5 10 15AAA GTG CTG GGA GAA ACC ATC AAG GAT GCG TTG GGA GAA CAC ATT CTT 332Lys Val Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp Ala Leu Gly Glu His Ile Leu20 25 30GAA CGC GTA GAA ACT ATC CGT AAG TTG TCG AAA TCT TCA CGC GCT GGC 380Glu Arg Val Glu Thr Ile Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly35 40 45AAT GAT GCT AAC CGC CAG GAG TTG CTC ACC ACC TTA CAA AAT TTG TCG 428Asn Asp Ala Asn Arg Gln Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser50 55 60AAC GAC GAG CTG CTG CCC GTT GCG CGT GCG TTT AGT CAG TTC CTG AAC 476Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gln Phe Leu Asn65 70 75 80CTG GCC AAC ACC GCC GAG CAA TAC CAC AGC ATT TCG CCG AAA GGC GAA 524Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gln Tyr His Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu85 90 95GCT GCC AGC AAC CCG GAA GTG ATC GCC CGC ACC CTG CGT AAA CTG AAA 572Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val Ile Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys100 105 110AAC CAG CCG GAA CTG AGC GAA GAC ACC ATC AAA AAA GCA GTG GAA TCG 620Asn Gln Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr Ile Lys Lys Ala Val Glu Ser115 120 125CTG TCG CTG GAA CTG GTC CTC ACG GCT CAC CCA ACC GAA ATT ACC CGT 668Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Ile Thr Arg130 135 140CGT ACA CTG ATC CAC AAA ATG GTG GAA GTG AAC GCC TGT TTA AAA CAG 716Arg Thr Leu Ile His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gln145 150 155 160CTC GAT AAC AAA GAT ATC GCT GAC TAC GAA CAC AAC CAG CTG ATG CGT 764Leu Asp Asn Lys Asp Ile Ala Asp Tyr Glu His Asn Gln Leu Met Arg165 170 175CGC CTG CGC CAG TTG ATC GCC CAG TCA TGG CAT ACC GAT GAA ATC CGT 812Arg Leu Arg Gln Leu Ile Ala Gln Ser Trp His Thr Asp Glu Ile Arg180 185 190
AAG CTG CGT CCA AGC CCG GTA GAT GAA GCC AAA TGG GGC TTT GCC GTA 860Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val195 200 205GTG GAA AAC AGC CTG TGG CAA GGC GTA CCA AAT TAC CTG CGC GAA CTG 908Val Glu Asn Ser Leu Trp Gln Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu210 215 220AAC GAA CAA CTG GAA GAG AAC CTC GGC TAC AAA CTG CCC GTC GAA TTT 956Asn Glu Gln Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe225 230 235 240GTT CCG GTC CGT TTT ACT TCG TGG ATG GGC GGC GAC CGC GAC GGC AAC 1004Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn245 250 255CCG AAC GTC ACT GCC GAT ATC ACC CGC CAC GTC CTG CTA CTC AGC CGC 1052Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg260 265 270TGG AAA GCC ACC GAT TTG TTC CTG AAA GAT ATT CAG GTG CTG GTT TCT 1100Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gln Val Leu Val Ser275 280 285GAA CTG TCG ATG GTT GAA GCG ACC CCT GAA CTG CTG GCG CTG GTT GGC 1148Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly290 295 300GAA GAA GGT GCC GCA GAA CCG TAT CGC TAT CTG ATG AAA AAC CTG CGT 1196Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg305 310 315 320TCT CGC CTG ATG GCG ACA CAG GCA TGG CTG GAA GCG CGC CTG AAA GGC 1244Ser Arg Leu Met Ala Thr Gln Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly325 330 335GAA GAA CTG CCA AAA CCA GAA GGC CTG CTG ACA CAA AAC GAA GAA CTG 1292Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gln Asn Glu Glu Leu340 345 350TGG GAA CCG CTC TAC GCT TGC TAC CAG TCA CTT CAG GCG TGT GGC ATG 1340Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gln Ser Leu Gln Ala Cys Gly Met355 360 365GGT ATT ATC GCC AAC GGC GAT CTG CTC GAC ACC CTG CGC CGC GTG AAA 1388Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys370 375 380TGT TTC GGC GTA CCG CTG GTC CGT ATT GAT ATC CGT CAG GAG AGC ACG 1436Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg Ile Asp Ile Arg Gln Glu Ser Thr385 390 395 400CGT CAT ACC GAA GCG CTG GGC GAG CTG ACC CGC TACCTC GGT ATC GGC 1484Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ile Gly405 410 415
GAC TAC GAA AGC TGG TCA GAG GCC GAC AAA CAG GCG TTC CTG ATC CGC 1532Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gln Ala Phe Leu Ile Arg420 425 430GAA CTG AAC TCC AAA CGT CCG CTT CTG CCG CGC AAC TGG CAA CCA AGC 1580Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gln Pro Ser435 440 445GCC GAA ACG CGC GAA GTG CTC GAT ACC TGC CAG GTG ATT GCC GAA GCA 1628Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gln Val Ile Ala Glu Ala450 455 460CCG CAA GGC TCC ATT GCC GCC TAC GTG ATC TCG ATG GCG AAA ACG CCG 1676Pro Gln Gly Ser Ile Ala Ala Tyr Val Ile Ser Met Ala Lys Thr Pro465 470 475 480TCC GAC GTA CTG GCT GTC CAC CTG CTG CTG AAA GAA GCG GGT ATC GGG 1724Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly Ile Gly485 490 495TTT GCG ATG CCG GTT GCT CCG CTG TTT GAA ACC CTC GAT GAT CTG AAC 1772Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn500 505 510AAC GCC AAC GAT GTC ATG ACC CAG CTG CTC AAT ATT GAC TGG TAT CGT 1820Asn Ala ASn Asp Val Met Thr Gln Leu Leu Asn Ile Asp Trp Tyr Arg515 520 525GGC CTG ATT CAG GGC AAA CAG ATG GTG ATG ATT GGC TAT TCC GAC TCA 1868Gly Leu Ile Gln Gly Lys Gln Met Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser530 535 540GCA AAA GAT GCG GGA GTG ATG GCA GCT TCC TGG GCG CAA TAT CAG GCA 1916Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gln Tyr Gln Ala545 550 555 560CAG GAT GCA TTA ATC AAA ACC TGC GAA AAA GCG GGT ATT GAG CTG ACG 1964Gln Asp Ala Leu Ile Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly Ile Glu Leu Thr565 570 575TTG TTC CAC GGT CGC GGC GGT TCC ATT GGT CGC GGC GGC GCA CCT GCT 2012Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Ile Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala580 585 590CAT GCG GCG CTG CTG TCA CAA CCG CCA GGA AGC CTG AAA GGC GGC CTG 2060His Ala Ala Leu Leu Ser Gln Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu595 600 605CGC GTA ACC GAA CAG GGC GAG ATG ATC CGC TTT AAA TAT GGT CTG CCA 2108Arg Val Thr Glu Gln Gly Glu Met Ile Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro610 615 620GAA ATC ACC GTC AGC AGC CTG TCG CTT TAT ACC GGG GCG ATT CTG GAA 2156Glu Ile Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Ile Leu Glu625 630 635 640GCC AAC CTG CTG CCA CCG CCG GAG CCG AAA GAG AGC TGG CGT CGC ATT 2204Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg Ile645 650 655
ATG GAT GAA CTG TCA GTC ATC TCC TGC GAT GTC TAC CGC GGC TAC GTA 2252Met Asp Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val660 665 670CGT GAA AAC AAA GAT TTT GTG CCT TAC TTC CGC TCC GCT ACG CCG GAA 2300Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu675 680 685CAA GAA CTG GGC AAA CTG CCG TTG GGT TCA CGT CCG GCG AAA CGT CGC 2348Gln Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg690 695 700CCA ACC GGC GGC GTC GAG TCA CTA CGC GCC ATT CCG TGG ATC TTC GCC 2396Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala705 710 715 720TGG ACG CAA AAC CGT CTG ATG CTC CCC GCC TGG CTG GGT GCA GGT ACG 2444Trp Thr Gln Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr725 730 735GCG CTG CAA AAA GTG GTC GAA GAC GGC AAA CAG AGC GAG CTG GAG GCT 2492Ala Leu Gln Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gln Ser Glu Leu Glu Ala740 745 750ATG TGC CGC GAT TGG CCA TTC TTC TCG ACG CGT CTC GGC ATG CTG GAG 2540Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu755 760 765ATG GTC TTC GCC AAA GCA GAC CTG TGG CTG GCG GAA TAC TAT GAC CAA 2588Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr ASp Gln770 775 780CGC CTG GTA GAC AAA GCA CTG TGG CCG TTA GGT AAA GAG TTA CGC AAC 2636Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn785 790 795 800CTG CAA GAA GAA GAC ATC AAA GTG GTG CTG GCG ATT GCC AAC GAT TCC 2684Leu Gln Glu Glu Asp Ile Lys Val Val Leu Ala Ile Ala ASn Asp Ser805 810 815CAT CTG ATG GCC GAT CTG CCG TGG ATT GCA GAG TCT ATT CAG CTA CGG 2732His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gln Leu Arg820 825 830AAT ATT TAC ACC GAC CCG CTG AAC GTA TTG CAG GCC GAG TTG CTG CAC 2780Asn Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gln Ala Glu Leu Leu His835 840 845CGC TCC CGC CAG GCA GAA AAA GAA GGC CAG GAA CCG GAT CCT CGC GTC 2828Arg Ser Arg Gln Ala Glu Lys Glu Gly Gln Glu Pro Asp Pro Arg Val850 855 860GAA CAA GCG TTA ATG GTC ACT ATT GCC GGG ATT GCG GCA GGT ATG CGT 2876Glu Gln Ala Leu Met Val Thr Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg865 870 875 880AAT ACC GGC TAATCTTTCCT CTTCTGCAAA CCCTCGTGCT TTTGCGCGAG 2925Asn Thr Gly
GGTTTTCTGA AATACTTCTG TTCTAACACC CTCGTTTTCA ATATATTTCT GTCTGCATTT 2985TATTCAAATT CTGAATATAC CTTCAGATAT CCTTAAGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT 3045ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGACGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA 3105TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT 3165GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA 3225ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 3285CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA 3345CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGTTT 3405TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC 3465CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC 3525ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC 3585CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA 3645GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA 3705ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC ACTCTAGCTT CTGTAGCAAT 3765GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA 3825ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC 3885GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT 3945TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG 4005TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA 4065GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA 4125TTTTTAATTT AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC 4185TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC 4245TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC 4305AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT 4365CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT 4425CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC 4485TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA 4545GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC 4605CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCATTGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG 4665GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA 4725GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT 4785TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA 4845CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC 4905GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG 4965CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT 5025ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGAAGGG TTGGTTTGCG 5085CATTCACAGT TCTCCGCAAG AATTGATTGG CTCCAATTCT TGGAGTGGTG AATCCGTTAG 5145CGAGGTGCCG CCGGCTTCCA TTCAGGTCGA GGTGGCCCGG G5186(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度883个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形的(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Asn Glu Gln Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly1 5 10 15Lys Val Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp Ala Leu Gly Glu His Ile Leu20 25 30Glu Arg Val Glu Thr Ile Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly35 40 45Asn Asp Ala Asn Arg Gln Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser50 55 60Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gln Phe Leu Asn65 70 75 80Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gln Tyr His Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu85 90 95Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val Ile Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys100 105 110Asn Gln Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr Ile Lys Lys Ala Val Glu Ser115 120 125Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Ile Thr Arg130 135 140Arg Thr Leu Ile His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gln145 150 155 160Leu Asp Asn Lys Asp Ile Ala Asp Tyr Glu His Asn Gln Leu Met Arg165 170 175Arg Leu Arg Gln Leu Ile Ala Gln Ser Trp His Thr Asp Glu Ile Arg180 185 190Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val195 200 205Val Glu Asn Ser Leu Trp Gln Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu210 215 220Asn Glu Gln Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe225 230 235 240Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn245 250 255Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg260 265 270Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gln Val Leu Val Ser275 280 285
Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly290 295 300Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg305 310 315 320Ser Arg Leu Met Ala Thr Gln Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly325 330 335Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gln Asn Glu Glu Leu340 345 350Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gln Ser Leu Gln Ala Cys Gly Met355 360 365Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys370 375 380Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg Ile Asp Ile Arg Gln Glu Ser Thr385 390 395 400Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ile Gly405 410 415Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gln Ala Phe Leu Ile Arg420 425 430Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gln Pro Ser435 440 445Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gln Val Ile Ala Glu Ala450 455 460Pro Gln Gly Ser Ile Ala Ala Tyr Val Ile Ser Met Ala Lys Thr Pro465 470 475 480Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly Ile Gly485 490 495Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn500 505 510Asn Ala Asn Asp Val Met Thr Gln Leu Leu Asn Ile Asp Trp Tyr Arg515 520 525Gly Leu Ile Gln Gly Lys Gln Met Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser530 535 540Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gln Tyr Gln Ala545 550 555 560Gln Asp Ala Leu Ile Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly Ile Glu Leu Thr565 570 575Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Ile Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala580 585 590His Ala Ala Leu Leu Ser Gln Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu595 600 605Arg Val Thr Glu Gln Gly Glu Met Ile Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro610 615 620Glu Ile Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Ile Leu Glu625 630 635 640
Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg Ile645 650 655Met Asp Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val660 665 670Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu675 680 685Gln Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg690 695 700Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala705 710 715 720Trp Thr Gln Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr725 730 735Ala Leu Gln Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gln Ser Glu Leu Glu Ala740 745 750Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu755 760 765Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp Gln770 775 780Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn785 790 795 800Leu Gln Glu Glu Asp Ile Lys Val Val Leu Ala Ile Ala Asn Asp Ser805 810 815His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gln Leu Arg820 825 830Asn Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gln Ala Glu Leu Leu His835 840 845Arg Ser Arg Gln Ala Glu Lys Glu Gly Gln Glu Pro Asp Pro Arg Val850 855 860Glu Gln Ala Leu Met Val Thr Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg865 870 875 880Asn Thr Gly(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度23(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形的(ii)分子类型其它..合成的DNA
(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO3TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度21(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形的(ii)分子类型其它..合成的DNA(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO4ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度1643(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线形的(ii)分子类型基因组的DNA(iii)假设无(iv)反义无(vi)原始来源(A)生物谷氨酰棒杆菌(C)株ATCC13869
(ix)特征(A)名称/关键词mat肽(B)位置217..1482(xi)序列描述SEQ ID NO5TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234Met Ala Leu Val Val Gln1 5AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val10 15 20GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val25 30 35GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala40 45 50GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu55 60 65 70ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu75 80 85TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val90 95 100CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro105 110 115GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala120 125 130GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly135 140 145 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn155 160 165GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala170 175 180GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe185 190 195GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu200 205 210CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg215 220 225 230TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu235 240 245GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys250 255 260TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu265 270 275GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp280 285 290ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile295 300 305 310ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu315 320 325AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp330 335 340CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro345 350 355GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn360 365 370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg375 380 385 390GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln395 400 405CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg410 415 420AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度421个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形的(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg305 310 315 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度1643
(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线形的(ii)分子类型基因组的DNA(iii)假设无(iv)反义无(vi)原始来源(A)生物谷氨酸棒杆菌(C)株ATCC13869(ix)特征(A)名称/关键词mat肽(B)位置964..1482(xi)序列描述SEQ ID NO7TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC600AAGATCTGCA TTGTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC900GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu1 5 10 15GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala20 25 30
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val35 40 45CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe50 55 60ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys65 70 75CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val80 85 90 95GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val100 105 110ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu115 120 125TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp130 135 140GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly145 150 155GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg160 165 170 172AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG1550GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT1610TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度172个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形的(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO8
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala1 5 10 15Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys20 25 30Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu35 40 45Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr50 55 60Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu65 70 75 80Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly85 90 95Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr100 105 110Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu115 120 125Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp130 135 140Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly145 150 155 160Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg165 170(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度16(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形的(ii)分子类型其它..合成的DNA(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO9AAAAACCTGC GTTCTC16(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征
(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形的(ii)分子类型其它..合成的DNA(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO10TGACTTAAG GTTTACAGGCC 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形的(ii)分子类型其它..合成的DNA(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO11ACTGAATTCC AAATGTCCGC 20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度16(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形的(ii)分子类型其它..合成的DNA
(iii)假设无(xi)序列描述SEQ IDNO12AAGTGCAGG CCGTTT 1权利要求
1.一种来源于属于埃希杆菌属的微生物的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使磷酸烯醇丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制失敏的突变。
2.按照权利要求1的突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，在被允许存在于一种属于埃希杆菌属的微生物的情况下，它给予该细胞对于具有下述特性的一种化合物的抗性对于产野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的属于埃希杆菌属的微生物表现生长抑制作用。所述生长抑制作用在L-谷氨酸或L-天冬氨酸存在下恢复；并且抑制野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。
3.按照权利要求2的一种突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述化合物从3-溴丙酮酸天冬氨酸-β-肼和DL-苏-β-羟天冬氨酸中选择。
4.按照权利要求1的一种突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突变为按从该磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端计算用赖氨酸取代第625位谷氨酸的突变。
5.按照权利要求1的一种突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突变为按从该磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端计算第222位精氨酸被组氨酸取代并且第223位谷氨酸被赖氨酸取代的突变。
6.按照权利要求1的一种突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突变为按从该磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端计算相应地第228位丝氨酸被苯丙氨酸取代，289位谷氨酸被赖氨酸取代551位蛋氨酸被异亮氨酸取代并且804位谷氨酸被赖氨酸取代的突变。
7.按照权利要求1的一种突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突变为按从该磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端计算第867位丙氨酸被苏氨酸取代的突变。
8.按照权利要求1的一种突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突变为按从该磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端计算第438位精氨酸被半胱氨酸取代的突变。
9.按照权利要求1的一种突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突变为按从该磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端计算第620位赖氨酸被丝氨酸取代的突变。
10.一个DNA片段，它编码按照权利要求1至9的任意一个突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。
11.一种微生物，它属于埃希杆菌属或棒状杆菌，通过将按照权利要求10的DNA片段整合到染色体DNA上而被转化。
12.一种重组DNA，它通过将按照权利要求10的DNA片段与能在属于埃希杆菌属或棒状杆菌的细菌细胞内自主复制的载体DNA连接而形成。
13.一种微生物，它属于埃希杆菌属或棒状杆菌，被按照权利要求12的重组DNA转化。
14.一种生产氨基酸的方法，包含在适当的培养基中培养按照权利要求11或13的微生物；和从培养基中分离从包含L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸的组中选择的一种氨基酸。
全文摘要
一种磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因，它具有突变例如用赖氨酸置换从磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端第625位的谷氨酸的突变，用半胱氨酸置换从N-末端第438位精氨酸的突变和其它类似者，将该基因引入大肠埃希杆菌或棒状杆菌，以便产生基本不被天冬氨酸抑制的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，从而有效地生产氨基酸。
文档编号C12P13/14GK1133615SQ9419390
公开日1996年10月16日 申请日期1994年8月17日 优先权日1993年8月24日
发明者杉本雅一, 铃木智子, 松井裕, 泉井桂 申请人:味之素株式会社 被以下专利引用 (1),