专利名称：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，编码该酶的基因以及该基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，编码该酶的基因以及该基因的应用。
背景技术：
根据光合途径的特点，绿色植物可以分为C3、C4和景天酸代谢(CAM)途径等三种不同的类型。C3循环是在单细胞中完成的，大气中的CO2直接通过核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)催化的羧化反应进入Calvin循环。而C4循环是在叶肉细胞和维管束鞘细胞中协同完成的(叶肉细胞和维管束鞘细胞排列成花环式结构)。在叶肉细胞中，CO2以HCO3-的形式被磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)催化固定，形成C4酸草酰乙酸(OAA)，OAA被还原为苹果酸(Mal)，通过胞间连丝转移到维管束鞘细胞中，再迅速地在脱羧酶催化下重新释放出CO2，参与卡尔文循环，生成糖类。释放CO2后产生的丙酮酸转移到叶肉细胞的叶绿体中，在丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)催化下生成无机碳的受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)(参考Hatch M.D.，1987，Biochim.Biophys.Acta.89581-106)。
C4植物起源于热带或亚热带，因此C4途径的产生必然与环境有关，有其积极的生物学意义。在高温和强光条件下，C4植物的C4循环机制及维管束鞘细胞的低透气性，使CO2在Rubisco周围被高度浓缩，高浓度的CO2不仅使Rubisco保持了最大的羧化活性，而且抑制了其加氧酶活性。在C4植物中几乎测不出光呼吸，CO2补偿点接近于零或极低(参考H_usler R.E.等，2002，Journal of Experimental Botany 53591-607)。
由于C4植物利用CO2的能力高，在CO2浓度很低时，还可以固定CO2。因此与C3植物相比，C4植物在高光强、高温及低CO2浓度的条件下，具有高光效的能力。所以这类植物累积干物质速度快，为高产型植物。由此可见，对四碳二羧酸代谢途径的研究，具有相当重要的农业增产价值。然而令人遗憾的是，许多重要的粮食作物(例如水稻)都是光合效率较低的C3植物。从生理上分析，我国现有的高产水稻品种的光能利用率仅为1％～1.5％，与理想的光能利用率3％～5％(参考邱国雄，1992，见余叔文主编植物生理学与分子生物学236-243)相比，尚有很大的潜力可挖。人们受到C4光合途径的启发，希望通过转基因技术改造水稻等C3植物，提高叶片的光合能力，进一步提高C3植物的光合效率和产量。
虽然C4和C3途径的酶学基础已经研究得比较清楚，但由于C4与C3植物在形态结构上存在着明显的差异，而且有关C4植物的花环式结构发育所需要的基因以及控制C3和C4途径的基因，在细胞特异性表达机理方面目前也还不甚了解，所以长期以来人们无法肯定将C4途径的少数几个关键基因转化给C3植物之后，是否就可以提高后者的光合效率。
然而最近研究发现，C4水生被子植物黑藻(Hydrilla verticillata)并不具有花环式结构，但它的叶肉细胞却明显地含有C3和C4途径的两种羧化酶PEPCase和Rubisco(参考Magnin N.C.等，1997，Plant Physiol，1151681-1689)，而且C4植物玉米的两个关键的C4型光合酶基因Ppc和Pdk的启动子，能够带动报告基因GUS在水稻叶肉细胞中高水平表达，并以与玉米同样的方式受到光的诱导(参考Matsuoka M.等，1994，Plant J，6311-319；Matsuoka M.等，1998，J Plant Res，111333-337)。这些结果表明，有可能通过转基因技术，在C3植物水稻的叶肉细胞中建立起C4光合途径。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)由Ppc基因编码，是C4循环途径固定CO2的关键酶，存在于叶肉细胞的胞质中，催化如下不可逆的反应
有研究将C4植物玉米的C4型Ppc基因转入了C3植物水稻中(参考Ku M.S.B.等，1999，Nat Biotech，1776-80)，获得了明显的效果。在转基因水稻的叶片中，PEPCase的活性提高了20倍。生理指标检测表明，与原种株相比，转Ppc基因的水稻植株的光饱和速率提高55％，CO2补偿点下降27％，表现出在高光强或CO2受到限制的条件下，具有较强的CO2同化能力和较高的转能效率，耐光抑制和耐光氧化的能力增强(参考焦德茂等，2002，科学通报，46414-417)。
C4植物高粱的Ppc基因家族共有三个成员，其中有两个基因为C3型基因，它们的表达不受光的诱导，在根、黄化叶和绿叶中都有表达，另一个基因为C4型，仅在绿色叶片的叶肉细胞中受光诱导表达，其产物参与C4循环中CO2的固定(参考Lepiniec L.等，1993，Plant Mol Boil，21487-502)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的酶的基因。
本发明的在一个目的是提供本发明的基因的应用。
本发明提供了一种编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因，该基因具有选自下组的核苷酸序列(1)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(2)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；(3)在严谨杂交条件下仍能够与上述(1)或(2)中的序列杂交，但同时编码具有活性的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的核苷酸序列。
严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。
本发明还提供了一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它具有上述的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或者SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高植物的光合效率中的应用。
附图简要说明
图1.高粱C4型Ppc基因的PCR扩增。M.λ DNA/EcoRI+HindIII双酶切分子量标准；1.Ppc基因左侧区段pepcL(3.6Kb)；2.Ppc基因右侧区段PepcR(3.4Kb)。
图2.高粱C4型Ppc基因结构简图。□示5’-和3’-侧翼序列，■示外显子， 示内含子，pL5和pL3为扩增此基因左侧区段的引物对，pR5和pR3为扩增此基因右侧区段的引物对，p1和p2为PCR检测转基因植株所用的引物对，掺入α-32P-dCTP的扩增产物作为探针，用于Southern和northern杂交。
图3.高粱C4型Ppc基因的克隆及表达质粒p1301-PEPC的构建流程图。
图4.转基因植株的PCR鉴定。M.λDNA/EcoRI+HindIII双酶切分子量标准；1-14.转基因植株；P.阳性对照质粒p1301-PEPC；N.阴性对照非转基因植株。
图5转基因水稻植株的PEPCase活性。□示农垦58， 示中花10。
图6转基因水稻植株PEPCase的western杂交。S.为高粱，PEPCase活性为26.05μmol/mg chl/hr；C.为水稻对照植株；1-5.为水稻转基因植株。a.为农垦58样品，其中对照植株PEPCase活性为4.57μmol/mg chl/hr，转基因植株为19.8-101.48μmol/mg chl/hr；每泳道上样量0.18μg叶绿素。b.为中花10样品，其中对照植株PEPCase活性为3.72μmol/mg chl/hr，转基因植株为17.47-54.55μmol/mg chl/hr，每泳道上样量0.70μg叶绿素。
图7转基因水稻植株的northern杂交。S.为高粱，PEPCase活性为26.05μmol/mg chl/hr；C.为水稻对照植株；1-5.为水稻转基因植株。a.为农垦58样品，其中对照植株PEPCase活性为4.57μmol/mg chl/hr，转基因植株为19.8-101.48μmol/mg chl/hr；b.为中花10样品，其中对照植株PEPCase活性为3.72μmol/mg chl/hr，转基因植株为17.47-54.55μmol/mgchl/hr。
图8转基因水稻的Southern杂交。P.阳性对照质粒p1301-PEPC；C1.农垦58对照植株；1-4.农垦58转基因植株，PEPCase活性为19.8-101.48μmol/mg chl/hr；C2.中花10对照植株；5-8.中花10转基因植株，PEPCase活性为17.47-54.55μmol/mg chl/hr。
图9转基因植株的光合CO2同化特性。10-C中花10对照植株；10-1、10-2中花10转基因植株1、2，PEPCase活性分别为对照的10倍和7.5倍；58-C农垦58对照植株；58-1、58-2农垦58转基因植株1、2，PEPCase活性分别为对照的26倍和11倍。A.CO2补偿点；B.光呼吸速率；C.羧化效率。
实施例1.高粱C4型Ppc基因的隆序列分析根据Lepiniec等1992年发表的高粱C4型Ppc基因序列[5](GenBankX63756)，在5’-末端、3’-末端和基因的中部设计两对引物，以CTAB法提取的高粱(Sorghum vulgare)品种晋中405(购自山西省榆次市种子公司)叶片的基因组DNA为模板，分左侧和右侧两段扩增C4型Ppc基因全长。引物pL5和pL3扩增长度约为3.6kb的左侧区段(pepcL)，其中pL5位于Ppc基因启动子上游，其5’-端外加有BglII酶切位点；引物pR5和pR3扩增长度约为3.4kb的右侧区段(pepcR)，其中pR3位于Ppc基因转译终止子下游约500bp的位置，其3’-末端外加有HindIII酶切位点；pL3和pR5位于外显子5内部，彼此互补，其内部含有一个XbaI切点。由这两对引物分别扩增得到的pepcL和pepcR片段(图1)通过这一限制性酶切位点可以连接成完整的Ppc基因。为了保证PCR产物的准确性，在PCR反应中采用了适于扩增长片段、且保真性比Taq DNA聚合酶高6倍的高保真的PLATINUM_Taq DNA聚合酶。
引物序列分别为
pL55’-ttaagatcTTAACAGCAGCAAAGCCAAGCC-3’BgIIIpL35’-GCAGCCATCATTCTAGACAGCAAG-3’；XbaIpR55’-CTTGCTGTCTAGAATGATGGCTGC-3’；XbaIpR35’-ttaaagtTCACTATAGCGCCGT TGGATCG-3’。
HindIII(其中小写字母代表外加酶切位点及保护碱基)；50μl PCR反应体系如下60mmol/L Tris-SO4(pH8.9)，18mmol/L(NH4)2SO4，2mmol/L MgSO4，200μmol/L dNTP，引物pL5和pL3(或pR5和pR3)各0.4μmol/L，～200ng高粱基因组DNA，1U PLATINUM_Taq DNAPolymerase High Fidelity(GIBCO BRL)。在PE2400热循环仪上进行如下PCR反应94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，68℃延伸4min，进行28个循环；72℃延伸7min。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上于1×TAE中作电泳分离。
PCR产物分别与pGEM-T easy载体(Promega公司)连接，转化E.coliXL1-blue菌株(Stratagene公司)，酶切鉴定后选取阳性克隆(分别命名为pPEPCL和pPEPCR)，送上海博亚生物工程公司测序，与GenBank X63756序列有差异的区段重复测定。
序列分析表明，该基因全长7117bp，含有转录本全长序列5989bp，由10个外显子和9个内含子组成(图2)。与GenBank中登录的高粱C4型Ppc基因序列(X63756)进行同源比较，核苷酸同源性达97.9％，氨基酸同源性达99.2％。核苷酸序列中启动区有个别碱基不同，但CAAT盒和TATA盒的序列和位置没有变化。外显子1-7的序列完全相同；外显子8内部存在5个碱基的差异，第5162、5258和5453位碱基的差异不影响氨基酸编码，第4818位的变化使编码的氨基酸由不带电荷的极性Thr变为非极性的Ala，第4871位的变化使编码的氨基酸由不带电荷的极性Gln变为带负电荷的碱性His；外显子9内第5882位的变化使碱性的Arg变为碱性的Lys；外显子10在第6530、6531和6544位比已知序列X63756多出3个碱基，导致多出一个氨基酸，并使相邻的4个氨基酸编码(Gly-Glu-Arg-Val)因发生移位而改变为(Pro-Ala-Ser-Glu-Tyr)。其余的差异均发生在内含子内部，个别碱基存在差异或缺失，其中最大的差异位于内含子6中，比X63756的相应序列多出一段39bp的片段，导致出现一段32bp序列的串联重复，这一32bp序列3’-端的17bp(黑体表示)在串联重复的上游还存在一个拷贝，而在X63756中仅存在两个拷贝的17bp序列。
2.高粱C4型Ppc基因表达载体的构建由于Ppc基因是通过PCR方法分两段获得的，所以表达载体的构建分为两步。第一步是将Ppc基因左侧区段pepcL克隆到质粒pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology to InternationalAgriculture，CAMBIA)上。首先对质粒pPEPCL(Ppc基因左侧区段pepcL克隆在pGEM-T easy载体上的重组质粒，见实施例1)进行BglII和XbaI双酶切消化，回收片段pepcL，与经过BamHI和XbaI双酶切的表达载体pCAMBIA1301连接(BglII与BamHI为同尾酶)，转化E.coli XL1-blue(Stratagene公司)。挑取转化子菌落扩增培养，提取质粒，用多种限制性内切酶进行酶切鉴定，将其中含有完整pepcL片段的一阳性克隆命名为p1301PEPCL。第二步是将Ppc基因右侧区段pepcR克隆到p1301PEPCL上，通过位于Ppc基因外显子5内部的XbaI切点(位于引物pL3和pR5上)连接为完整的Ppc基因。用HindIII和XbaI双酶切消化质粒pPEPCR，回收片段pepcR，与同样经过HindIII和XbaI双酶切的p1301PEPCL连接，转化E.coli XL1-blue。挑取转化子菌落扩增，提取质粒，酶切鉴定。选取一阳性克隆为我们下一步转化水稻愈伤组织所用的表达载体，命名为p1301-PEPC。图3为Ppc基因的克隆及表达载体p1301-PEPC的构建流程图。
将p1301-PEPC以电击法转化农杆菌EHA105(参考Hood E.E.等，1993，Trans.Res.2208-218)菌株(使用BIO-RAD公司GENE PULSER II电融合仪)，从转化子和非转化子菌落中分别提取质粒DNA为模板，用扩增片段pepcR的引物pR5和pR3进行PCR扩增鉴定。从两个转化子菌落可扩增得到3.4kb的pepcR片段，而非转化子菌落没有扩增产物(图未示出)，证明表达载体p1301-PEPC已成功地转化到农杆菌EHA105中，可以用于转化水稻愈伤组织。
3.转高粱C4型Ppc基因的水稻植株的培育
(1)水稻愈伤的诱导本实验中选用的植物材料为两个粳稻品种农垦58(由华中农业大学牟同敏教授赠送)和中花10号(由中国农业科学院作物育种栽培研究所李梅芳教授赠送)，用成熟胚的盾片诱导愈伤组织。种子去除颖壳后经70％乙醇消毒2min，无菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl2表面灭菌15-20min，无菌水漂洗3次。于含有2mg/L 2，4-D的NB培养基上28℃暗培养，2-3周后选取致密的愈伤组织颗粒用于转化。农垦58愈伤组织生长状态良好，颗粒大而密实；中花10号的愈伤组织颗粒比农垦58的略小，且较松散。
(2)转化农杆菌的培养、愈伤组织侵染、共培养及筛选等步骤采用Hiei和Toki等人的方法(参考Hiei Y等，1994，Plant J，6271-282；Toki S.，1997，Plant Mol Biol Reporter，1516-21)。转化中以NB培养基代替N6为基础培养基。农垦58和中花10两个品种愈伤组织的平均转化频率分别可达35.7％和48.1％。将于筛选培养基上培养5-6周后筛选出的生长旺盛、致密的阳性愈伤组织转移至预分化培养基(NB培养基+5mg/L ABA，2mg/L BAP，2mg/L NAA，300mg/L羧苄青霉素，40mg/L潮霉素)上，于28℃暗培养10天，然后转移至分化培养基上28℃光照培养至分化出再生植株。比较了几种分化培养基，我们发现，在含有0.5mg/L TDZ或0.3mg/L TDZ加3.0mg/L BAP和0.5mg/L NAA的NB培养基上，比在无TDZ，仅含有BAP和NAA的NB培养基上，阳性愈伤组织分化出绿色芽点的频率高，但仍然有大部分芽点在继续分化的过程中大部分会逐渐褐化，最终长成再生苗的仅为阳性愈伤的10.0％和10.8％。所以农垦58和中花10愈伤组织的转化效率分别为3.6％和5.2％。当分化的小苗生根后，转移至含有300mg/L羧苄青霉素和40mg/L潮霉素的1/2 MS培养基上生长至10cm左右，移栽到土壤中于温室生长。
4.转高粱C4型Ppc基因的水稻植株的鉴定(1)PCR检测待愈伤分化出的小苗移栽至花盆中约一月后，分别取转基因和对照植株的叶片，用CTAB法小量提取总DNA，以位于高粱C4型Ppc基因外显子2和内含子3内的两段序列为引物进行PCR鉴定，引物序列如下PW2R5’-GGGCAAGAAAGACACGTCCA-3’PW3F5’-AACGGCGTACCAAACAGAGT-3’20μl反应体系中含有1x反应缓冲液，2mmol/L Mg2+，250μmol/LdNTP，引物PW2R和PW3F各为0.4μmol/L，50-100ng转基因植株基因组DNA，1U Taq DNA聚合酶(鼎国公司)。在PE2400热循环仪上进行如下PCR反应94℃预变性3min；94℃变性45sec，57℃退火45sec，72℃延伸1min 25sec，进行35个循环；72℃延伸7min。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上于1×TAE中作电泳分离。在被检测的101株转基因植株中，有93株及质粒阳性对照均可扩增出预期的1.1kb片段，而非转基因植株中没有出现相应的扩增条带(图4)。
(2)PEPCase酶活性的检测和western杂交PEPCase的提取参照Huang et al的方法(Huang X.Q.等，2002，ActaBot Sin，44405-412)进行。在晴天的上午9:00-10:00(光强在1,200μmol·m-2·s-1左右)，取0.15g成熟水稻叶片的中段，加入1.0ml提取缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.0，10mmol/L MgCl2，1mmol/L EDTA，5mmol/L DTT，5％不溶型PVP)，于预冷的研钵中充分研磨，每个样品取25μl用于测定叶绿素含量，其余样品于4℃，15,000g离心10min，取上清用于酶活性检测。PEPCase活性的检测参照Gonzalez et al.的方法(Gonzalez D.L.等，1984，J Plant Physiol，116425-429)，使用BIO-RADSmartSpecTM3000紫外分光光度计进行。每个反应的总体积为0.5ml，含有50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L NaHCO3，10mmol/L MgCl2，0.2mmol/L NADH，1unit NAD-苹果酸脱氢酶，0.1mmol/L EDTA，1mom/LDTT，25μl粗酶提取液，最后加入PEP至终浓度为2mmol/L，立即开始测定反应液OD340的变化值。
8株农垦58未转基因的对照样品PEPCase平均活性为3.76μmol/mgchl/hr，9株中花10对照样品PEPCase平均活性为3.62μmol/mg chl/hr。在同样条件下测定高粱叶片PEPCase的活性是26.05μmol/mg chl/hr，为水稻对照植株的7倍左右。在被测定的58株转基因的农垦58中，22％的植株PEPCase酶活性为对照样品的1-5倍；53％的植株为对照的5-10倍，与高粱叶片中PEPCase的活性相似(图5)；个别植株活性是对照样品的26倍，达到101.48μmol/mg chl/hr，为高粱的3.9倍。但当在植株抽穗时重复测定少数样品酶活性时，我们发现对照植株没有明显变化，而转基因植株活性普遍下降21-38％。65株中花10转基因植株结果与农垦58相似。
选择PEPCase活性不同的转基因植株进行western杂交。取PEPCase提取物离心后的上清进行SDS-PAGE分离，浓缩胶为3.9％，分离胶为8％。电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上进行western杂交。PEPCase的抗体由江苏农科院焦德茂教授赠送，第二抗体为碱性磷酸酶偶联的羊抗兔lgG(北京中山)，以BICP/NBT溶液显色。
杂交结果显示，杂交条带的强度与酶活性的高低是基本相吻合的，酶活性低的植株杂交条带弱，而活性高的植株杂交条带强(图6)。
(3)Southern和northern杂交CTAB法提取转基因和对照植株(取材与western杂交同)叶片的总DNA，每个样品取5μg进行EcoRI酶切，酶切产物于0.8％的琼脂糖凝胶上作电泳分离。使用Trizol(鼎国公司)快速提取转基因和对照植株叶片的总RNA，叶片的取材时间和光照条件同方法3(2)。甲醛电泳分离各样品的总RNA，每泳道上样5μg。按照Zeta-Probe GT Genomic TestedBlotting Membranes(BIO-RAD)说明书中的标准程序分别转膜、杂交，探针为PCR扩增的、掺入α-32P-dCTP标记的高粱C4型Ppc基因内部特异片段[见方法3(1)，图2]。使用Fuji X-光片进行放射自显影。
具体的严谨杂交条件如下将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的探针)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。
Northern和Southern杂交显示了与western杂交相同的趋势，酶活性越高的样品杂交条带越强(图7-8)，这表明Ppc基因的表达水平与其插入水稻基因组的拷贝数密切相关。
(4)光合CO2同化特性的测定选取PEPCase活性较高的转基因植株与相应的对照植株，使用开放气路的便携式CO2/H2O分析仪(Ciras-1，PP-systems，UK)测定光合作用气体交换参数。通过变化叶室内CO2浓度来测定叶片胞间CO2浓度(Ci)--光合速率(A)响应曲线(参照Wang Q.等，2002，Science in China(seriesC)，2002，45468-476)。其中光合速率在光强为900μmmol m-2s-1条件下测定，此光强下被证明所测定的水稻品种均已接近光饱和速率。
与Rubisco酶相比，PEPCase对CO2具有更高的亲和力，在C4碳同化途径中PEPCase起到“CO2泵”的作用，可使CO2在Rubisco酶周围有效地富集，并且提高其周围的CO2/O2比值，增强植物对CO2的利用能力，因而在气体交换特征上C4植物表现为具有更低的CO2补偿点和光呼吸速率。从图9结果可以看到PEPCase在C3植物水稻中高效表达后，与对照植株相比，其CO2补偿点和光呼吸速率显著下降。推测水稻这种光合特征的改变，是由于PEPCase的高水平表达提高了CO2利用能力引起的。这证明，高粱C4型PEPCase转入水稻后，可以行使与在C4光合途径中相同的功能，有效地改善C3植物的光合特性。
值得注意的是，PEPCase高效表达的植株与对照植株相比，羧化效率(CE)显著提高(图9，C)。CE是反映叶片中Rubisco酶被有效激活的重要指标。所以CE显著提高，可能是由于叶片中有更多的Rubisco酶被有效激活。因PEPCase高水平表达而提高了Rubisco酶活化水平的内在原因，值得进一步探讨。它可能是由于光呼吸的降低累积了更多的ATP分子，富余的ATP分子增强了Rubisco活化酶的活性，从而使更多的Rubisco酶分子处于激活状态。这些推测需要进一步的实验证据。
序列表<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，编码该酶的基因以及该基因的应用<130>I020533<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7117<212>DNA<213>Sorghum vulgare<220>
<221>CDS<222>(628)..(780)<223>
<220>
<221>CDS<222>(892)..(1284)<223>
<220>
<221>CDS<222>(1379)..(1462)<223>
<220>
<221>CDS<222>(2607)..(2828)<223>
<220>
<221>CDS<222>(3610)..(3714)<223>
<220>
<221>CDS<222>(3829)..(3921)<223>
<220>
<221>CDS
<222>(4415)..(4570)<223>
<220>
<221>CDS<222>(4719)..(5717)<223>
<220>
<221>CDS<222>(5824)..(6210)<223>
<220>
<221>CDS<222>(6323)..(6613)<223>
<400>1ttaacagcag caaagccaag ccaaaaacga tccaggagca aggtgcggcc gcagctctcc 60cggtcccctt tgcggttacc actagctaag aatgaagatg gtactctaaa tggatacttg120cgcggttttt ctctagtcta acttaataaa ctaaataaac aatttctttc ttattttttt180aatttagttc gtttagttag actagagaag aaccacgagg agttatttga agcgtcgtcc240ccatccttac cactagctag cactagcaga cacccctctc cacgtcctgc aaacaggcaa300ttagccagcg gaataacaca agcaggcaag tgcgcagtga caaagtacgt ccacagcagc360gatcccagcc aaaagcagcg tagccacagc cgcgcgcagc tctcggctac ccttaccgcc420gatcacatgc atgcctttcc aatcccgcgt gcacacgccg accacacact cgccaactcc480ccatccctat ttgaagccac cggccggcgc cctgcattga tcaatcaact cgcagcagag540gagcagcacg agcaacacgc cgcgccgcgc tccaaccatc tccagcttcg ttcgcgcttc600ccggcccact ccccggccgc cgccgcc atg gcg tcc gag cgg cac cac tcc atc654Met Ala Ser Glu Arg His His Ser Ile1 5gac gcg cag ctc cgt gcc ctc gca ccc ggc aag gtc tcc gag gag ctc 702Asp Ala Gln Leu Arg Ala Leu Ala Pro Gly Lys Val Ser Glu Glu Leu10 15 20 25atc cag tat gac gcc ctg ctc gtc gac cgc ttc ctc gac atc ctc cag 750Ile Gln Tyr Asp Ala Leu Leu Val Asp Arg Phe Leu Asp Ile Leu Gln
30 35 40
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权利要求
1.一种编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因，该基因具有选自下组的核苷酸序列(1)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(2)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；(3)在严谨杂交条件下仍能够与上述(1)或(2)中的序列杂交，但同时编码具有活性的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的核苷酸序列。
2.一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它具有权利要求1所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或者SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.权利要求2所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高植物的光合效率中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，编码该酶的基因以及该基因的应用。所述的基因能显著地降低转基因植株的CO
文档编号C12N9/88GK1506462SQ0215459
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月10日 优先权日2002年12月10日
发明者吴乃虎, 张方 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所