一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法
【专利摘要】一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，包括以下步骤：(1)斑马鱼脑部组织蛋白样品的制备；(2)SDS凝胶电泳；(3)转膜；(4)封闭；(5)一抗、二抗孵育；(6)显色反应；(7)计算M3受体变化结果。本发明克服了传统斑马鱼M3受体检测受制于无针对性抗体而无法使用蛋白质免疫印迹技术之缺陷，首次提出使用p38MAPK磷酸化水平从而测定斑马鱼M3受体蛋白含量变化，该方法灵敏度高、稳定性好、不需要复杂设备；同时本发明操作简单快捷、特异性高、成本低，本发明从分子方面研究胆碱能系统的内在作用机制，再结合斑马鱼行为变化方面的研究，最终能够实现对水质的实时在线评估与监测。
【专利说明】
一种基于测定P38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法
技术领域
[0001]本发明属于生理生态学技术领域，具体涉及一种基于蛋白质免疫印迹技术检测斑马鱼M3受体蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着经济的快速发展，水污染问题日益突出，严重影响生态环境的平衡和稳定。斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，近年来，众多研究显示斑马鱼应用于环境毒理学研究中有其独特的优势，斑马鱼已逐渐成为环境毒理学家们的新宠，利用斑马鱼对水环境污染物进行快速监测已成为目前研究的热点。
[0003]目前，人们通常依据对斑马鱼死亡率、畸形率、体长、体重、躯体质量指数(BMI)等进行测定，然而斑马鱼的生物的病理损伤或死亡往往较为滞后，难以发挥快速监测的作用。近年来，有越来越多的研究指出鱼类对污染物的适应反应从神经内分泌活动变化开始，而M3受体(毒蕈碱型受体亚型之一)作为神经递质乙酰胆碱的受体，其蛋白含量变化必然受到污染物的影响。因此，对斑马鱼M3受体蛋白活性的测定可实现对水环境污染物的快速监测。
[0004]然而，目前对M3受体蛋白活性的测定主要集中在大鼠、小鼠、电鳐这些物种上，方法主要是放射结合分析法、蛋白质免疫印迹技术(Western Blotting)、ELISA等，其中，Western Blotting是检测蛋白质特性、表达和分布的一种最常用、成熟的方法，该方法不仅可以从蛋白质混合物中检出目标蛋白质，可以定性或半定量的确定细胞或组织中蛋白质的表达情况。由于该方法中必须使用与目的蛋白特异性结合的抗体，而目前尚未有用于检测斑马鱼M3受体的抗体，而且由于M3受体蛋白在组织和种属之间存在巨大差异性，市售的其他M3受体抗体如人M3受体抗体、小鼠M3受体抗体等与斑马鱼M3受体结合性极差，这使得蛋白质免疫印迹技术不能应用于斑马鱼M3受体的检测。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术的不足，发明人通过研究发现，p38MAPK信号转导通路主要参与细胞外应激引起的细胞内多种蛋白激酶的连锁反应，进而影响RNA转录和蛋白合成以及细胞表面受体表达等生物学功能，其中，磷酸化作为一个信号转导的分子开关，在不同通路，如代谢、神经信号转导、细胞分裂等方面控制着蛋白活性，而当受到污染物污染时，P38MAPK蛋白表达(磷酸化)发生变化以调节信号通路尤其是神经信号通路，以此可通过P38MAPK蛋白表达水平变化即可测定斑马鱼在不同污染物的不同浓度暴露下M3受体的变化。
[0006]具体的，本发明涉及以下技术方案:
[0007]p38MAPK蛋白表达在检测斑马鱼M3受体蛋白中的应用。
[0008]一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，包括以下步骤:
[0009](I)斑马鱼脑部组织蛋白样品的制备；(2)SDS凝胶电泳；(3)转膜；(4)封闭；(5) —抗、二抗孵育；(6)显色反应；(7)计算M3受体变化结果。
[0010]优选的，所述SDS凝胶电泳中分离胶的质量分数为10%，浓缩胶的质量分数为5%;
[0011]优选的，所述封闭的具体步骤为:将步骤(3)中转好的膜置于5%的脱脂奶粉中，封闭时间为Ih;
[0012]优选的，所述一抗为针对p38MAPK受体的兔抗P38/磷酸化P38抗体；
[0013]优选的，所述二抗为针对p38MAPK受体的HRP标记的羊抗兔IgG；
[0014]进一步优选的，所述一抗、二抗的稀释溶液均为5%的脱脂奶粉；
[0015]具体的，一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，包括以下步骤:
[0016](I)蛋白样品提取制备:取斑马鱼脑部组织，加入细胞裂解液取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀，用Bradford蛋白分析法测定蛋白浓度；
[0017](2)SDS凝胶电泳:制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE，所述SDS凝胶电泳中分离胶的质量分数为10%，浓缩胶的质量分数为5%，电泳过程处理温度为10°C ;
[0018](3)转膜:将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，转膜过程中保持温度为4°C;
[0019](4)封闭:放入5%的脱脂奶粉中封闭lh，封闭过程中保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态；
[0020](5)—抗、二抗孵育:用5%的脱脂奶粉稀释一抗，将已封闭的膜放入一抗稀释溶液中，4 °C孵育盒中过夜培养，次日从冰箱里拿出来室温孵育Ih;然后将膜再放入TBST中清洗3次，每次15min;期间用5%的脱脂奶粉稀释二抗，清洗好的膜放入二抗中孵育2h，然后用TBST洗膜3次，每次15min。
[0021](6)显色反应:化学发光剂(ECL)检测NC膜上目的蛋白，然后于暗室中用膜对X光片曝光，进行扫描，记录实验结果。
[0022](7)计算M3受体变化结果:通过步骤(6)得出的实验结果计算斑马鱼M3受体变化。
[0023]本发明还公开了上述方法在水质实时在线评估与监测中的应用。
[0024]本发明反应机理:p38MAPK信号转导通路主要参与细胞外应激引起的细胞内多种蛋白激酶的连锁反应，进而影响RNA转录和蛋白合成以及细胞表面受体表达等生物学功能，其中，P38MAPK磷酸化作为一个信号转导的分子开关，在不同通路，如代谢、神经信号转导、细胞分裂等方面控制着蛋白活性，而当受到污染物污染时，P38MAPK发生磷酸化表达变化以调节信号通路尤其是神经信号通路，因此以此可通过P38MAPK磷酸化水平即可测定不同污染物不同浓度暴露下M3受体的变化。而p38MAPK作为一个进化保守蛋白，在不同物种间差异性不显著，因此对市面上针对其他物种设计的抗体也具有良好的特异性结合，实现本发明通过使用蛋白质免疫印迹技术检测P38MAPK磷酸化水平从而测定斑马鱼M3受体蛋白变化之目的。
[0025]本发明的有益效果为:
[0026](I)本发明克服了传统斑马鱼M3受体检测受制于无针对性抗体而无法使用蛋白质免疫印迹技术之缺陷，首次提出使用P38MAPK磷酸化水平从而测定斑马鱼M3受体蛋白含量变化，，该方法灵敏度高、稳定性好、不需要复杂设备；
[0027](2)本发明操作简单快捷、特异性高、成本低，本发明从分子方面研究胆碱能系统的内在作用机制，再结合斑马鱼行为变化方面的研究，最终能够实现对水质的实时在线评估与监测。
【附图说明】
[0028]图1为实验例Western Blot结果图；
[0029]图2为生物逐级行为模型。
【具体实施方式】
[0030]实施例
[0031](I)蛋白样品提取制备:取斑马鱼脑部组织，加入细胞裂解液取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀，用Bradford蛋白分析法测定蛋白浓度；
[0032](2)SDS凝胶电泳:制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE，所述SDS凝胶电泳中分离胶的质量分数为10%，浓缩胶的质量分数为5%，电泳过程处理温度为10°C ;
[0033](3)转膜:将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，转膜过程中保持温度为4°C;
[0034](4)封闭:放入5%的脱脂奶粉中封闭lh，封闭过程中保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态；
[0035](5)—抗、二抗孵育:用5%的脱脂奶粉稀释一抗，将已封闭的膜放入一抗稀释溶液中，4 °C孵育盒中过夜，次日从冰箱里拿出来室温孵育Ih;然后将膜再放入TBST中清洗3次，每次15min;期间用5%的脱脂奶粉稀释二抗，清洗好的膜放入二抗中孵育2h，然后用TBST洗膜3次，每次15min。
[0036](6)显色反应:化学发光剂(ECL)检测NC膜上目的蛋白，然后于暗室中用膜对X光片曝光，进行扫描，记录实验结果。
[0037](7)计算结果:通过步骤(6)得出的实验结果计算斑马鱼M3受体变化。
[0038]其中，所述一抗为针对p38MAPK受体的兔抗P38/磷酸化P38抗体;所述二抗为针对P38MAPK受体的HRP标记的羊抗兔IgG。
[0039]Western Blot法测定溴氰菊酯对斑马鱼M3受体影响实验例
[0040]溴氰菊酯作为菊酯类农药的一种，其具有显著抑制斑马鱼M3受体的作用，同时剂量效应明显。
[0041 ] 1.暴露实验和组织匀浆的获取
[0042]测定溴氰菊酯的LC50-48h，以此浓度为一个毒性单位(ITU)，设置0.5TU、1TU、2TU三个浓度梯度，12h连续取样。
[0043]2.蛋白质印迹法测定M3受体的含量
[0044](I)蛋白样品提取制备:取斑马鱼脑部组织，加入细胞裂解液取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀，用Bradford蛋白分析法测定蛋白浓度；
[0045](2)SDS凝胶电泳:制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE，所述SDS凝胶电泳中分离胶的质量分数为10%，浓缩胶的质量分数为5%，电泳过程处理温度为10°C ;
[0046](3)转膜:将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，转膜过程中保持温度为4°C;
[0047](4)封闭:放入5%的脱脂奶粉中封闭lh，封闭过程中保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态；
[0048](5)—抗、二抗孵育:用5%的脱脂奶粉稀释一抗，将已封闭的膜放入一抗稀释溶液中，4 °C孵育盒中过夜，次日从冰箱里拿出来室温孵育Ih;然后将膜再放入TBST中清洗3次，每次15min;期间用5%的脱脂奶粉稀释二抗，清洗好的膜放入二抗中孵育2h，然后用TBST洗膜3次，每次15min。
[0049](6)显色反应:化学发光剂(ECL)检测NC膜上目的蛋白，然后于暗室中用膜对X光片曝光，进行扫描，记录实验结果。
[0050](7)计算结果:通过步骤(6)得出的实验结果计算斑马鱼M3受体变化。
[0051 ]其中，所述一抗为针对p38MAPK受体的兔抗P38/磷酸化P38抗体;所述二抗为针对P38MAPK受体的HRP标记的羊抗兔IgG。
[0052]溴氰菊酯对斑马鱼脑部p38MAPK的抑制效应如图1所示，检测p38MAPK的WesternBlot结果表明，随着溴氰菊酯药物浓度的增加，p38MAPK的条带逐渐变窄，表明随着暴露药物浓度的增加，P38MAPK的表达量逐渐降低，所以，通过p38MAPK磷酸化的水平即可药物在不同浓度暴露下斑马鱼脑部受体的变化。
[0053]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1.P38MAPK蛋白表达在检测斑马鱼M3受体蛋白中的应用。2.一种基于测定P38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤: (I)斑马鱼脑部组织蛋白样品的制备；(2)SDS凝胶电泳；(3)转膜；(4)封闭；(5)—抗、二抗孵育；(6)显色反应；(7)计算M3受体变化结果。3.如权利要求2所述的一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，其特征在于，所述SDS凝胶电泳中分离胶的质量分数为10%，浓缩胶的质量分数为5%。4.如权利要求2所述的一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，其特征在于，所述封闭的具体步骤为:将步骤(3)中转好的膜置于5%的脱脂奶粉中，封闭时间为lh。5.如权利要求2所述的一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，其特征在于，所述一抗为针对P38MAPK受体的兔抗P38/磷酸化P38抗体。6.如权利要求2所述的一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，其特征在于，所述二抗为针对P38MAPK受体的HRP标记的羊抗兔IgG。7.如权利要求2所述的一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，其特征在于，所述一抗、二抗的稀释溶液均为5%的脱脂奶粉。8.如权利要求2所述的一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，其特征在于，一种基于测定P38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，包括以下步骤: (1)蛋白样品提取制备:取斑马鱼脑部组织，加入细胞裂解液取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀，用Bradf ord蛋白分析法测定蛋白浓度； (2)SDS凝胶电泳:制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE，所述SDS凝胶电泳中分离胶的质量分数为10%，浓缩胶的质量分数为5%，电泳过程处理温度为10°C ; (3)转膜:将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，转膜过程中保持温度为4°C; (4)封闭:放入5%的脱脂奶粉中封闭lh，封闭过程中保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态； (5)—抗、二抗孵育:用5%的脱脂奶粉稀释一抗，将已封闭的膜放入一抗稀释溶液中，40C孵育盒中过夜，次日从冰箱里拿出来室温孵育Ih;然后将膜再放入TBST中清洗3次，每次15min;期间用5%的脱脂奶粉稀释二抗，清洗好的膜放入二抗中孵育2h，然后用TBST洗膜3次，每次15min; (6)显色反应:化学发光剂检测NC膜上目的蛋白，然后于暗室中用膜对X光片曝光，进行扫描，记录实验结果； (7)计算结果:通过步骤(6)得出的实验结果计算斑马鱼M3受体变化。9.权利要求2-8任意一项所述方法在水质实时在线评估与监测中的应用。
【文档编号】G01N33/18GK106053829SQ201610368638
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】任宗明, 张婷婷, 任晴, 李尚戈, 邢娜, 齐鲁慧子
【申请人】山东师范大学