微透析采样?流动注射化学发光联用法在小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力测定中的应用
【专利摘要】本发明公开了在线微透析采样?流动注射化学发光联用分析法在针对小分子半抗原的单克隆抗体的亲和力测定中的应用及其具体测定方法，该联用分析法是在非标记的条件下于均相体系中研究小分子半抗原与单克隆抗体间的亲和力，方法简单、便捷、稳定、灵敏。与现有的测定抗体亲和力的方法相比，其无需用酶等信号分子对抗体进行标记，也无需将小分子半抗原与载体蛋白偶联后用于包被，可以省去标记、偶联等繁琐工作，更重要的是可以更加客观的反映抗原与抗体间的真实结合情况，且不需要昂贵的仪器，成本较低。本发明不仅为抗体的性能评价提供了一种简单、快速、客观的分析技术手段，同时也是对微透析采样技术应用领域的新拓展。
【专利说明】
微透析采样-流动注射化学发光联用法在小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力测定中的应用
技术领域
[0001]本发明属于免疫分析领域，涉及在线微透析采样-流动注射化学发光联用分析法在针对小分子半抗原的单克隆抗体的亲和力测定中的应用。
【背景技术】
[0002]单克隆抗体技术是一种免疫学技术，它将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体、又能无限增殖的杂交瘤细胞，并以此生产抗体。该技术为抗体的分子学研究提供了一个全新的手段，极大地促进了免疫学的发展。近年来，单克隆抗体技术在免疫检测、免疫治疗、分离纯化等领域得到了非常广泛的应用。在单克隆抗体的制备和筛选过程中，最重要的工作之一是对不同细胞株分泌的单克隆抗体对特定抗原的结合亲和力这一关键指标进行评价，其对于单克隆抗体的开发应用具有十分重要的指导意义。
[0003]目前，用于测定抗原-抗体间结合常数的方法主要包括竞争结合法、硫氰酸盐洗脱法、非竞争酶免疫分析法等基于抗体标记的异相分析方法。近年来，也有一些非标记的方法用于测定抗体亲和力，其原理与前述标记法类似，不同之处在于抗体无需以信号探针标记，而是在抗原和抗体结合后，以表面等离子体共振、石英晶体微天平等非标记方法测定传感器界面上的生物结合反应，依此研究抗原和抗体的结合过程。标记法的弊端在于，所有抗体均需要以酶等信号分子进行标记，一来标记过程繁琐，二来标记可能影响抗体的生物活性，所获得的测定结果难以客观反映抗原-抗体间真实的亲和力。而无论是标记法还是非标记法，都需要将抗原固定于酶标板或传感器表面。如果抗原是小分子半抗原，由于它们很难在酶标板或传感器表面有效固定，通常需要与载体蛋白偶联形成人工完全抗原后方可用于包被，而偶联可能带来以下问题:首先，偶联过程较为麻烦;其次，偶联可能破坏抗原分子结构中的抗原决定簇，或者，抗原决定簇与偶联蛋白距离过近，对抗原-抗体间的结合反应产生空间位阻，均不能真实反映抗体的亲和力。因此，有必要发展一种无需对小分子半抗原及抗体进行偶联或标记即可直接进行针对小分子半抗原的单克隆抗体亲和力测定的均相分析方法。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种无需对小分子半抗原及抗体进行偶联或标记即可直接进行针对小分子半抗原的单克隆抗体亲和力测定的均相分析方法。
[0005]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案:
1.在线微透析采样-流动注射化学发光联用法在小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力测定中的应用。
[0006]2.在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力的方法，包括以下步骤:在小分子半抗原与单克隆抗体的均相免疫反应体系中，采用在线微透析采样方法获得含有部分游离小分子半抗原的透析液，再采用流动注射化学发光法测定透析液中游离小分子半抗原的浓度，结合微透析采样方法的透过率求得均相免疫反应体系中游离小分子半抗原的浓度，进一步计算出均相免疫反应体系中与单克隆抗体结合的小分子半抗原的浓度，最后根据Scatchard分析或/和Klotz分析计算出单克隆抗体的亲和力常数。
[0007]优选的，所述方法具体包括以下步骤:
(1)制备一系列已知不同浓度的小分子半抗原溶液，采用流动注射化学发光法分别测定其化学发光强度，以化学发光强度对小分子半抗原的浓度作图得工作曲线；
(2)将已知浓度的小分子半抗原溶液采用在线微透析采样方法获得含有部分小分子半抗原的透析液，采用流动注射化学发光法测定透析液的化学发光强度，根据步骤(I)所得工作曲线推算出透析液中小分子半抗原的浓度，进一步计算出微透析采样方法的透过率；
(3)固定单克隆抗体的浓度，将其分别与一系列已知不同浓度的小分子半抗原进行结合反应，得到一系列均相免疫反应体系，采用在线微透析采样方法分别获得一系列含有部分游离小分子半抗原的透析液，采用流动注射化学发光法分别测定该系列透析液的化学发光强度，根据步骤(I)所得工作曲线分别推算出该系列透析液中游离小分子半抗原的浓度，结合步骤(2)所得微透析采样方法的透过率求得该系列均相免疫反应体系中游离小分子半抗原的浓度，进一步计算出该系列均相免疫反应体系中与单克隆抗体结合的小分子半抗原的浓度，最后根据Sca t char d分析或/和KI o t z分析计算出单克隆抗体的亲和力常数。
[0008]作为一个具体实例，所述单克隆抗体为特布他林单克隆抗体，小分子半抗原为特布他林。
[0009]作为上述实例的一个优选实施方式，在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力的方法具体为:步骤(I)和(2)中所述小分子半抗原溶液和步骤(3)中所述均相免疫反应体系的溶剂均为0.010 M pH 7.4 PBS缓冲液;步骤(I)至(3)中所述流动注射化学发光法具体如下:发光剂为1.0X10—5 M鲁米诺和1.0X10—4M铁氰化钾，所述浓度的鲁米诺由1.0 X 10—2 M氢氧化钠溶解制得;载流和发光剂的流速均为2.2 mL/min;步骤(2)和(3)中所述在线微透析采样方法具体如下:采样温度为37 °C;灌流液为0.010 M pH 7.4 PBS缓冲液，灌流速度为4.0 yL/min。
[0010]本发明的有益效果在于:本发明提供了在线微透析采样-流动注射化学发光联用分析法在针对小分子半抗原的单克隆抗体的亲和力测定中的应用及其具体测定方法，该联用分析法是在非标记的条件下于均相体系中研究小分子半抗原与单克隆抗体间的亲和力，方法简单、便捷、稳定、灵敏。与传统的标记型方法相比，其无需用酶等信号分子对抗体进行标记，可以省去标记这一繁琐工作，可以更加客观的反映抗原与抗体间的真实结合情况。与非标记方法相比，其无需将小分子半抗原与载体蛋白偶联后用于包被，可以省去偶联这一繁琐工作，真实反映抗体的亲和力，而且不需要昂贵的仪器，成本较低。本发明不仅为抗体的性能评价提供了一种简单、快速、客观的分析技术手段，同时也是对微透析采样技术应用领域的新拓展。
【附图说明】
[0011]图1为在线微透析采样-流动注射化学发光联用分析装置(MP:微量注射栗;M:微透析探针;Pl:载流传输装置;P2:发光剂传输装置;V:进样阀;F:流通池;D:化学发光检测器；W:废液;a:载流;b:发光剂I; C:发光剂2; Ant1-TEB:特布他林单克隆抗体;Terbutal ine:特布他林;PBS: PBS缓冲液)。
[0012]图2为流动注射化学发光法检测硫酸特布他林的工作曲线。
[0013]图3为特布他林与其单克隆抗体相互作用的Scatchard曲线。
[0014]图4为特布他林与其单克隆抗体相互作用的Klotz曲线。
【具体实施方式】
[0015]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0016]图1为在线微透析采样-流动注射化学发光联用分析装置。如图所示，该分析装置包括微透析采样系统和流动注射化学发光系统;所述微透析采样系统包括微量注射栗和微透析探针;所述流动注射化学发光系统包括载流传输装置、发光剂传输装置、进样阀、流通池和化学发光检测器;所述微透析探针的液体出口与流动注射化学发光系统中的进样阀连通。该分析装置由计算机进行程序自动化控制。
[0017]采用上述分析装置进行小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力测定时，先将小分子半抗原和单克隆抗体的均相免疫反应体系进行一定时间的温育，使免疫反应达到平衡，再将微透析探针置于达到平衡的免疫反应体系中，利用微量注射栗将灌流液推送至微透析探针处，使灌流液经微透析探针与免疫反应体系进行透析交换，交换后的透析液(含游离小分子半抗原)进入进样阀的采样环中，被载流带入与发光剂混合后发生化学发光反应，化学发光信号由化学发光检测器中的光电倍增管采集。
[0018]实施例1在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定特布他林单克隆抗体的亲和力
1、流动注射化学发光法检测硫酸特布他林的工作曲线的绘制制备一系列已知浓度的硫酸特布他林溶液(溶剂为0.010 M pH 7.4 PBS缓冲液)。将微量注射栗与流动注射化学发光系统中的进样阀直接相连(不通过微透析探针)，分别将上述系列硫酸特布他林溶液吸入至微量注射栗中，由微量注射栗控制以4.0 yL/min的速度直接推送至采样环中，采用流动注射化学发光法进行测定，记录化学发光信号。流动注射化学发光法具体如下:发光剂为1.0 X 10—5 M鲁米诺(由1.0 X 10—2 M氢氧化钠溶解制得)和1.0 X10—4 M铁氰化钾;载流和发光剂的流速均为2.2 mL/min;光电倍增管的工作电压为-700V;每8分钟测定一次(7分30秒采样，进样量为30 yL)。每个浓度重复测定4次。以化学发光强度对硫酸特布他林浓度作图得工作曲线，如图2所示。
[0019]2、微透析探针透过率(R)的测定
采用如图1所示的在线微透析采样-流动注射化学发光联用分析装置。将微透析探针放入已知浓度的硫酸特布他林溶液(溶剂为0.010 M pH 7.4 PBS缓冲液)中，37 °C水浴恒温。将灌流液由微量注射栗控制进行低速灌流，灌流液经微透析探针与硫酸特布他林溶液进行透析交换，透析液(含有部分硫酸特布他林)进入进样阀的采样环中，被载流带入流动注射化学发光系统，与发光剂反应，测定化学发光信号。在线微透析采样-流动注射化学发光联用法具体如下:微透析探针为美国BASi公司的MD-2310探针;灌流液为0.010 M pH 7.4 PBS缓冲液，灌流速度为4.0 4171^11;发光剂为1.0\10—5 M鲁米诺(由1.0 X 10—2 M氢氧化钠溶解制得)和1.0 X 10—4 M铁氰化钾;载流和发光剂的流速均为2.2 mL/min;光电倍增管的工作电压为-700 V;每8分钟测定一次(7分30秒采样，进样量为30此)。根据图2推算出透析液中硫酸特布他林的浓度，再根据微透析探针透过率计算公式:R = Cd /Cm {Cd为透析液中硫酸特布他林的浓度，C?为探针周围硫酸特布他林的总浓度)，计算得出微透析探针的透过率R为26.2%。
[0020 ] 3、特布他林单克隆抗体的亲和力测定
采用如图1所示的在线微透析采样-流动注射化学发光联用分析装置。固定均相免疫反应体系中特布他林单克隆抗体的浓度为7.0 X 10—7 M，硫酸特布他林的浓度分别为1.0X 10—7 Μ、3.0Χ10—7 Μ、5.0Χ10—7 Μ、7.0Χ10—7 M 和 9.0X10—7 Μ，总体积为 1.0 mL，溶剂为
0.010 M pH 7.4 PBS缓冲液。将该均相免疫反应体系置37 °C水浴中不断搅拌混匀，平衡30分钟后，将微透析探针置免疫反应体系中，将灌流液由微量注射栗控制进行低速灌流，灌流液经微透析探针与免疫反应体系进行透析交换，透析液(含有部分游离硫酸特布他林)进入进样阀的采样环中，被载流带入流动注射化学发光系统，与发光剂反应，测定化学发光信号。在线微透析采样-流动注射化学发光联用法具体同前。每个浓度重复测定4次。根据图2推算出透析液中游离硫酸特布他林的浓度，结合微透析探针的透过率求得探针周围游离硫酸特布他林的浓度，进一步计算出与特布他林单克隆抗体结合的硫酸特布他林的浓度。然后通过Scatchard分析(r /Cu =nK ~rK ,r代表体系中结合的硫酸特布他林与特布他林单克隆抗体摩尔浓度的比值，Cu代表未结合的硫酸特布他林的浓度，/3表示单抗分子的结合位点数，尤表示单抗的亲和力常数；以r /Cu对r作图可得一直线，由直线的斜率及截距可求得J和/3 )(图3)和Klotz分析(1/r = I/η + (I/nK)(l/Cu),r代表体系中结合的硫酸特布他林与特布他林单克隆抗体摩尔浓度的比值，Cu代表未结合的硫酸特布他林的浓度，/3表示单抗分子的结合位点数，表示单抗的亲和力常数；以Ι/r对1/C?作图可得一直线，由直线的斜率及截距可求得I和/2 )(图4)，求得特布他林单克隆抗体的亲和力常数分别为4.9 X 16 M—1 和4.9 X 16 M^10
[0021]最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
【主权项】
1.在线微透析采样-流动注射化学发光联用法在小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力测定中的应用。2.在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力的方法，其特征在于，包括以下步骤:在小分子半抗原与单克隆抗体的均相免疫反应体系中，采用在线微透析采样方法获得含有部分游离小分子半抗原的透析液，再采用流动注射化学发光法测定透析液中游离小分子半抗原的浓度，结合微透析采样方法的透过率求得均相免疫反应体系中游离小分子半抗原的浓度，进一步计算出均相免疫反应体系中与单克隆抗体结合的小分子半抗原的浓度，最后根据Scatchard分析或/和Klotz分析计算出单克隆抗体的亲和力常数。3.根据权利要求2所述的在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)制备一系列已知不同浓度的小分子半抗原溶液，采用流动注射化学发光法分别测定其化学发光强度，以化学发光强度对小分子半抗原的浓度作图得工作曲线； (2)将已知浓度的小分子半抗原溶液采用在线微透析采样方法获得含有部分小分子半抗原的透析液，采用流动注射化学发光法测定透析液的化学发光强度，根据步骤(I)所得工作曲线推算出透析液中小分子半抗原的浓度，进一步计算出微透析采样方法的透过率； (3)固定单克隆抗体的浓度，将其分别与一系列已知不同浓度的小分子半抗原进行结合反应，得到一系列均相免疫反应体系，采用在线微透析采样方法分别获得一系列含有部分游离小分子半抗原的透析液，采用流动注射化学发光法分别测定该系列透析液的化学发光强度，根据步骤(I)所得工作曲线分别推算出该系列透析液中游离小分子半抗原的浓度，结合步骤(2)所得微透析采样方法的透过率求得该系列均相免疫反应体系中游离小分子半抗原的浓度，进一步计算出该系列均相免疫反应体系中与单克隆抗体结合的小分子半抗原的浓度，最后根据Sca t char d分析或/和KI o t z分析计算出单克隆抗体的亲和力常数。4.根据权利要求2或3所述的在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力的方法，其特征在于，所述单克隆抗体为特布他林单克隆抗体，小分子半抗原为特布他林。5.根据权利要求4所述的在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力的方法，其特征在于，步骤(I)和(2)中所述小分子半抗原溶液和步骤(3)中所述均相免疫反应体系的溶剂均为0.0lO M pH 7.4 PBS缓冲液;步骤(I)至(3)中所述流动注射化学发光法具体如下:发光剂为1.0 X 10—5 M鲁米诺和1.0 X 10—4 M铁氰化钾，所述浓度的鲁米诺由1.0 X 10—2 M氢氧化钠溶解制得;载流和发光剂的流速均为2.2mL/min;步骤(2)和(3)中所述在线微透析采样方法具体如下:采样温度为37 °C;灌流液为.0.010 M pH 7.4 PBS缓冲液，灌流速度为4.0 yL/min。
【文档编号】G01N33/577GK106053820SQ201610491652
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】付志锋, 王平石, 周娅莉
【申请人】西南大学