一种流动注射化学发光快速检测剑麻皂苷元的方法
【专利摘要】本发明公开了一种流动注射化学发光快速检测剑麻皂苷元的方法。该方法应用IFFM-E型流动注射化学发光分析仪检测剑麻皂苷元，采用鲁米诺浓度为1.6×10-5mol/L，铁氰化钾浓度为1.6×10-5mol/L，主副泵的转数分别为45r/min(2.25mL/min)和60r/min(3.0mL/min)，流通管（聚四氟乙烯管）内径为0.8mm，阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V。本发明所述流动注射化学发光法由于其灵敏度高，重复性好，线性范围宽，仪器设备简单，操作简单，检测成本低，可在线进行常规性测定，易于应用到工业或农业生产中。
【专利说明】一种流动注射化学发光快速检测剑麻皂苷元的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种流动注射化学发光快速检测剑麻皂苷元的方法，该方法属植物化学、天然产物化学、食品化学、分析化学、有机化学、生物化学、植物次生代谢物质的生理学、植物生物活性物质、剑麻皂苷元的提取和纯化、剑麻的栽培和育种、剑麻皂苷及其苷元在食品、保健品以及皂苷类药品中的安全检测领域，特别是该方法可以与常规的在线快速检测方法相互配合，更好的实现剑麻皂苷元在其工业生产中的终端质量控制，是一种在线快速检测剑麻皂苷元的方法。
【背景技术】
[0002]剑麻皂苷元的主要成分是替可吉宁(Tigogenin )，化学名称是5 α，25D-螺甾烷-3β羟基。参见说明书附图图1剑麻皂苷元的结构式。剑麻皂苷元是从生产剑麻纤维传统产品之后废弃的麻汁和麻渣中提取的天然植物皂苷元，是合成留体激素类药物的医药中间体和重要原料，广泛应用于肾上腺皮质激素、性激素及蛋白同化激素三大类200多种药物的制造。药理研究表明，这些皂苷元成分具有较明显的抗炎、抗菌、止血、抗衰老和降血糖的生物活性。
[0003]随着人们生活水平的不断提高，天然药物的使用越来越受到人们的青睐。剑麻皂苷元的开发利用愈显重要，为了提高皂苷元品质，对生产的产品皂苷元含量的检测监控是必不可少的。目前，应用高效液相色谱蒸发光散射检测器法测定植物体内的留体皂苷国内外均有报道，薄层色谱法(TLC)(万建波，李绍平，简家荣等2004)、气相质谱联用法(GC-MS)(J.F.Cui, 1.Bjorkhem, P.Enerothl997)> 高效液相色谱(HPLC-UV) (A.J.Lau, B.H.Seo, S.0.Woo, et al2004; L.Li, J.L.Zhang, Y.X.Sheng, et al2005)、分光光度法(J.C.Baccou, F.Lambert, Y.Sauvairel977)等。这些方法有耗时长、设备昂贵等不足,相比之下,流动注射化学发光法操作简单，快速，检测成本低，容易克服上述不足，并且应用流动注射化学发光方法检测剑麻皂苷元未见报道，做常规性测定易于被生产厂家所应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了针对现有检测方法的缺陷，提高从剑麻废弃物中分离提取剑麻皂苷元的质量标准，以达到合成留体激素类药物前体物质的质量要求，提供一种操作更加简单，检测成本低，标准曲线的线性好的鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系测定剑麻皂苷元的方法。
[0005]本发明所提供的流动注射化学发光快速检测剑麻皂苷元的方法，是用流动注射化学发光分析仪检测剑麻皂苷元，具体步骤为:
[0006]I)溶液配制:用碱性溶液配制鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)溶液；以无水乙醇溶液为溶剂溶解待测样品配置得到的待测剑麻皂苷元样品的溶液；配制铁氰化钾(K3Fe (CN)6)溶液；
[0007]2)检测:主动泵分别将载流鲁米诺溶液和待测剑麻皂苷元样品的溶液以2.25-3.0mL/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入流动注射化学发光分析仪，待基线平稳后，副动泵将铁氰化钾溶液以2.25-3.5mL/min的流速通过十六通注射阀，注样时间10-25秒，各液混合，流入流通池检测其化学发光强度，记录数据；设置无水乙醇作为空白对照，将无水乙醇的发光强度记录为Ιο，样品的发光强度记为Is，增光强度记为Λ I，以公式Λ I=1-1s计算增光强度；所述检测温度环境在34-36°C的范围内；
[0008]3)标准曲线的制作:用无水乙醇作为溶剂配制浓度为1.0Omg/mL的剑麻皂苷元标准溶液，将剑麻皂苷元标准溶液用无水乙醇稀释成0.1-1.0mg/mL的不同浓度梯度，用不同浓度的剑麻皂苷元标准溶液作为待测样品溶液，重复步骤2)的检测过程，记录结果，并制作标准曲线和标准曲线方程；
[0009]4)计算含量:按照步骤2)的操作过程测试无水乙醇(空白)和待测剑麻皂苷元样品的溶液的化学发光强度1和Is，计算出增光强度Λ I，代入步骤3)得到的标准曲线方程，计算得到待测剑麻阜苷元样品中剑麻阜苷元的含量。
[0010]所述方法中，优选的，所述鲁米诺溶液为0.10mol/L NaOH作为溶剂配制得到的
1.6X 10_5mol/L的鲁米诺溶液；所述铁氰化钾溶液为1.6X 10_5mol/L的铁氰化钾溶液。
[0011]所述方法中，优选的，所述步骤2)中，主动泵的流速为2.25mL/min ;副动泵的流速为 3.0mL/min。
[0012]所述方法中，优选的，流动注射化学发光分析仪为IFFM-E型流动注射化学发光分析仪；流动注射化学发光分析仪的流通管为聚四氟乙烯管，流通管内径为0.8mm,阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V。
[0013]所述方法中，优选的，所述铁氰化钾溶液为用二次蒸馏水作为溶剂配制得到的
1.6X 10_5mol/L的铁氰化钾溶液。
[0014]所述方法中，优选的，所述检测温度环境为35°C。
[0015]所述步骤3)中标准曲线方程可以为:Λ 1=739.35χ+5.3589，其中χ以mg/mL计，
0.10-1.0Omg/mL 范围，R2=0.9982。
[0016]经过上述优化后，本发明的方法的具体步骤为:
[0017](I)用0.1OmoI/L NaOH作为溶剂配制1.6X l(T5mol/L的鲁米诺，用二次蒸馏水作为溶剂配制1.6X l(T5mol/L的铁氰化钾溶液,无水乙醇溶液为溶剂配制浓度为1.0Omg/mL的皂苷元标准溶液和剑麻皂苷元的样品溶液；
[0018](2)主动泵分别将步骤(I)制备好的载流鲁米诺溶液和皂苷元标准溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入流动注射化学发光分析仪，待基线平稳后，副动泵将步骤(I)制备好的铁氰化钾溶液以60r/min的流速通过十六通注射阀，注样时间10-25秒，各液混合，流入流通池检测其化学发光强度，记录数据。无水乙醇(空白)的发光强度记录为1，样品的发光强度记为Is，增光强度记为Λ I (Al=Is-1o)。上述测试过程中光电倍增管及所用试剂均在35°C恒温下进行。
[0019](3)作出标准曲线方程:Λ 1=739.35χ+5.3589，其中χ以mg/mL计，浓度在
0.10-1.0Omg/mL 范围，R2=0.9982 ；
[0020](4)样品剑麻皂苷元的测定:重复步骤(2)的操作过程，测试样品剑麻皂苷元的化学发光强度Is，计算出增光强度Λ I，代入标准曲线方程，计算样品剑麻皂苷元的含量。
[0021]在优化的条件下，剑麻皂苷元标准溶液的浓度在0.10-1.0Omg/mL范围内与增光强度Δ I呈线性关系，这表明可利用这一方法对剑麻皂苷元作定量分析。
[0022]上述待测剑麻皂苷元样品为以剑麻残渣或麻膏为原料提取的剑麻皂苷元样品，具体提取方法如下所述:
[0023]剑麻残渣中皂苷元的提取:取一定量的剑麻残渣，干燥后粉碎过100目筛，用60%的乙醇超声提取3次后合并上清液干燥成粉。称取该粉末IOOmg加入到25mL具塞玻璃试管中，再加入6M的HCL9mL，置于90°C水浴中水解50min，冷却后用6M的NaOH调节pH为中性,4500r/min离心15min,弃上清液。分别向沉淀中加入沸程60_9(TC的石油醚30mL,分三步进行萃取，合并石油醚相，置于40°C旋转蒸发浓缩干燥。
[0024]麻膏中皂苷元的提取:取一定量的麻膏，干燥后粉碎过100目筛，称取该粉末IOOmg加水充分搅拌后置于80°C水浴中恒温2h，4500r/min离心15min，弃上清液，沉淀部分重复以上操作2次。分别向沉淀中加入沸程60-90°C的石油醚30mL，分三步进行萃取，合并石油醚相，置于40°C旋转蒸发浓缩干燥。
[0025]本发明所述流动注射化学发光法由于其灵敏度高，重复性好，线性范围宽，仪器设备简单，操作简单，检测成本低，可在线进行常规性测定，易于应用到工业或农业生产中。
[0026]本发明应用IFFM-E型流动注射化学发光分析仪检测剑麻皂苷元。采用鲁米诺浓度为1.6X 10_5mol/L,铁氰化钾浓度为1.6X 10_5mol/L,主副泵的转数分别为45r/min(即流速为2.25mL/min)和60r/min(即流速为3.0mL/min),流通管(聚四氟乙烯管)内径为
0.8mm，阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V。在该条件下，剑麻皂苷元最低检出限为3.47Xl(T3mg/mL，标准曲线相关系数为0.9982，平均回收率为105.3%，相对标准偏差在
1.3?2.1%之间。
[0027]本发明具有容易操作且准确性高等特点。采用了操作简便快捷、灵敏度较高的流动注射化学发光方法，可以与常规的化学发光分析仪检测方法相互配合，更好的实现剑麻皂苷元在其工业生产中的在线或终端质量控制，是一种在线快速检测剑麻皂苷元的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为剑麻阜苷元(Tigogenin)的结构式
[0029]图2为流动注射测皂苷元标准曲线。
[0030]图3为剑麻皂苷元在各种有机溶剂中的溶解度。
[0031]图4为乙醇浓度对发光体系的影响
【具体实施方式】
[0032]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。
[0033]实施例1、流动注射化学发光快速检测剑麻皂苷元的方法的优化及其效果验证
[0034]1.仪器设备
[0035]下述实验中流动注射化学发光快速检测剑麻皂苷元的方法所用的仪器均为IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈电子有限公司)。分析过程中采样、注样、实验数据采集及处理，均由Windows XP系统下IFFM-E型流动注射化学发光分析仪完成。[0036]2.材料与试剂
[0037]2.1 材料:
[0038]剑麻皂苷元标准品:98%，HPLC纯，上海研生生物技术有限公司；剑麻残渣(剑麻抽丝工艺剩余的剑麻废弃物，即剑麻抽去麻丝后的剑麻残渣)和麻膏由广西剑麻集团提供。
[0039]2.2制备试剂:用0.1OmoI/L NaOH作为溶剂配制1.6 X l(T5mol/L的鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)溶液，用二次蒸馏水作为溶剂配制1.6X10_5mOl/L的铁氰化钾(K3Fe (CN)6)溶液，用无水乙醇作为溶剂配制浓度为1.0Omg/mL的皂苷元标准溶液和剑麻皂苷元的样品溶液，将剑麻皂苷元标准溶液用无水乙醇稀释成0.1-1.0mg/mL的不同浓度梯度(如图2所示的标准曲线设置的浓度梯度0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL、0.70mg/mL、0.80mg/mL、0.90mg/mL、1.0Omg/mL),用于制备标准曲线。
[0040]3.剑麻皂苷元的分离提取
[0041]剑麻残渣中皂苷元的提取:取一定量的剑麻残渣，干燥后粉碎过100目筛，用60%的乙醇超声提取3次后合并上清液干燥成粉。称取该粉末IOOmg加入到25mL具塞玻璃试管中，再加入6M的HCL9mL，置于90°C水浴中水解50min，冷却后用6M的NaOH调节pH为中性,4500r/min离心15min,弃上清液。分别向沉淀中加入沸程60_9(TC的石油醚30mL,分三步进行萃取，合并石油醚相，置于40°C旋转蒸发浓缩干燥。
[0042]麻膏中皂苷元的提取:取一定量的麻膏，干燥后粉碎过100目筛，称取该粉末IOOmg加水充分搅拌后置于80°C水浴中恒温2h，4500r/min离心15min，弃上清液，沉淀部分重复以上操作2次。分别向沉淀中加入沸程60-90°C的石油醚30mL，分三步进行萃取，合并石油醚相，置于40°C旋转蒸发浓缩干燥。
[0043]4.流动注射化学发光检测仪各个参数的优化、设定:
[0044]流路参数的选择:利用IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈电子有限公司)进行检测，对具体参数进行优化选择:
[0045]4.1流速的影响:在流动注射分析中，流速是影响测定灵敏度的一个重要因素。流速太慢会导致最大发光在流通池之前，流速太快会导致最大发光在流通池之后，在固定以下前提条件下，流通管(聚四氟乙烯管)内径为0.8mm,阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V，鲁米诺浓度为1.6 X 10_5mol/L，铁氰化钾浓度为1.6 X 10_5mol/L，标准皂苷元溶液浓度为0.5mg/mL (作为检测样品),对主副螺动泵的转数在10_90r/min范围内进行考察，结果确定最佳主副泵的转数分别为45r/min(即流速为2.25mL/min)和60r/min(即流速为3.0mL/min)时，Λ I 最大。
[0046]4.2单因素试验确定反应介质的浓度范围
[0047]鲁米诺浓度:在固定以下前提条件下，流通管(聚四氟乙烯管)内径为0.8mm,阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V，铁氰化钾浓度为1.6X 10_5mol/L，配制鲁米诺溶液的NaOH溶液浓度为0.lmol/L,主副泵的转数分别为45r/min (即流速为2.25mL/min)和60r/min(即流速为3.0mL/min),标准阜苷元溶液浓度为0.5mg/mL (作为检测样品),试验考察了鲁米诺浓度在1.0X10_3-1.0X10_7mol/L范围内对化学发光强度的影响，结果表明:当鲁米诺浓度超过1.6X 10_5mol/L时增光强度Λ I最大。
[0048]4.3铁氰化钾浓度:在固定以下前提条件下，流通管(聚四氟乙烯管)内径为0.8mm,阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V，鲁米诺浓度为1.6X 10_5mol/L (用
0.1mol/LNaOH溶液配制)，主副泵的转数分别为45r/min(即流速为2.25mL/min)和60r/min(即流速为3.0mL/min),标准阜苷元溶液浓度为0.5mg/mL (作为检测样品),试验考察了铁氰化钾浓度在1.0X10_3-1.0X10_7mol/L范围内对化学发光强度的影响。结果表明:在低浓度时，增光强度较弱；随着铁氰化钾浓度增加，增光强度增大；当铁氰化钾浓度为
1.6X 10_5mol/L时增光强度Λ I达到最大。
[0049]4.4NaOH浓度:在固定以下前提条件下，流通管(聚四氟乙烯管)内径为0.8mm，阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V，鲁米诺浓度为1.6X 10_5mol/L (用不同浓度的NaOH溶液配制)，铁氰化钾浓度为1.6X10_5mOl/L，主副泵的转数分别为45r/min (即流速为
2.25mL/min)和60r/min(即流速为3.0mL/min),标准阜苷元溶液浓度为0.5mg/mL(作为检测样品)，试验了 NaOH浓度在1.0X10_3-5.0XKTmol/L范围内对化学发光强度的影响，结果表明:当NaOH浓度为1.0X IO-1Hi0VL时增光强度Λ I达到最大。
[0050]4.5皂苷元溶剂的选择:在固定以下前提条件下，流通管(聚四氟乙烯管)内径为0.8mm，阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V，鲁米诺浓度为1.6X l(T5mol/L (用
0.lmol/L NaOH溶液配制)，铁氰化钾浓度为1.6X 10_5mOl/L，主副泵的转数分别为45r/min (即流速为2.25mL/min)和60r/min (即流速为3.0mL/min),试验考察了甲醇、乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸等试剂对于皂苷元的溶解性(图3)，并测定了不同浓度的乙醇在该体系下的发光强度(图4)，最终确定100%乙醇作为皂苷元的溶剂。
[0051]优化结论:主动泵分别将载流鲁米诺溶液和阜苷元标准溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入流动注射化学发光分析仪，待基线平稳后，副动泵将铁氰化钾溶液以60r/min的流速通过十六通注射阀，注样时间10-25秒，各液混合，流入流通池检测其化学发光强度，记录数据。其中，流通管(聚四氟乙烯管)内径为0.8mm，阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V，鲁米诺浓度为1.6X 10_5mol/L，铁氰化钾浓度为
1.6X 10_5mol/L，标准皂苷元溶液浓度为0.5mg/mL ;并且，样品和标准皂苷元溶液均以乙醇为溶剂。
[0052]4.6标准曲线:作出标准曲线方程:Λ 1=739.35χ+5.3589，其中χ以mg/mL计，
0.10-1.0Omg/mL范围，R2=0.9982 ;标准曲线图如图2所示；然后重复上述优化后的操作过程，测试样品皂苷元的增光强度(Λ 1=623.46)。上述测试过程中光电倍增管及所用试剂均在35 °C恒温下进行。
[0053]4.7该方法的精密度试验:在上述优化后的最佳实验条件下，对0.1 Omg/mL的阜苷元标准溶液连续11次测定，平均值为0.101mg/mL, RSD为2.53%。
[0054]4.8该方法的重复性试验:在上述优化后的最佳实验条件下，将0.1 Omg/mL的皂苷元标准溶液分为6份，分别测定，平均值为0.982mg/mL, RSD为2.98%。
[0055]4.9该方法的检测限试验:在上述优化后的最佳实验条件下，将0.1 Omg/mL的阜苷元标准溶液的浓度以10倍的梯度向低浓度稀释，计算信噪比S/N=3时的标准皂苷元浓度，即为 3.47 X 10 3mg/mL。
[0056]4.10干扰试验:
[0057]剑麻皂苷元来源于剑麻残渣，在提取过程中共存其他组分，它们可能对该化学发光体系测定皂苷有一定的影响。为此，研究了 100倍的Na+、Cl' K+、Br\ CO广、S042_和N03_ ；50倍的Fe3+、Ca2+、Cu2+、Mn2+ ；10倍的淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖以及葡萄糖等分别对0.05mg/ml的皂苷元进行干扰测定实验。结果表明，它们不干扰测定。
[0058]4.11加标回收率试验结果
[0059]样品加标回收:相同的样品取两份(浓度为0.5mg/mL标准皂苷元溶液)，其中一份加入定量的待测成分标准物质；两份同时按上述优化后的相同的分析步骤分析，加标的一份所得的结果减去未加标一份所得的结果，其差值同加入标准物质的理论值之比即为样品加标回收率。加标回收率=(加标试样测定值一试样测定值)+加标量X 100%。
[0060]结果如表1所示，结果表明本发明的方法测定结果精确。
[0061]表1剑麻皂苷元加标回收率实验
[0062]
【权利要求】
1.一种流动注射化学发光快速检测剑麻皂苷元的方法，是用流动注射化学发光分析仪检测剑麻阜苷元，包括如下步骤: 1)溶液配制:用碱性溶液配制鲁米诺溶液；以无水乙醇溶液为溶剂溶解待测样品配置得到的待测剑麻皂苷元样品的溶液；配制铁氰化钾溶液； 2)检测:主动泵分别将载流鲁米诺溶液和待测剑麻皂苷元样品的溶液以2.25-3.0mL/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入流动注射化学发光分析仪，待基线平稳后，副动泵将铁氰化钾溶液以2.25-3.5mL/min的流速通过十六通注射阀，注样时间10-25秒，各液混合，流入流通池检测其化学发光强度，记录数据；设置无水乙醇作为空白对照，将无水乙醇的发光强度记录为Ιο，样品的发光强度记为Is，增光强度记为Λ I，以公式Δ I=1-1s计算增光强度；所述检测温度环境在34-36°C的范围内； 3)标准曲线的制作:用无水乙醇作为溶剂配制浓度为1.00mg/mL的剑麻皂苷元标准溶液，将剑麻皂苷元标准溶液用无水乙醇稀释成0.1-1.0mg/mL的不同浓度梯度，用不同浓度的剑麻皂苷元标准溶液作为待测样品溶液，重复步骤2)的检测过程，记录结果，并制作标准曲线和标准曲线方程； 4)计算含量:按照步骤2)的操作过程测试无水乙醇和待测剑麻皂苷元样品的溶液的化学发光强度1和Is，计算出增光强度Λ I，代入步骤3)得到的标准曲线方程，计算得到待测剑麻阜苷元样品中剑麻阜苷元的含量。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于:所述鲁米诺溶液为0.1OmoI/L NaOH作为溶剂配制得到的1.6Χ 10_5mol/L的鲁米诺溶液；所述铁氰化钾溶液为1.6 X 10_5mol/L的铁氰化钾溶液。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于:所述步骤2)中，主动泵的流速为2.25mL/min ；副动泵的流速为3.0mL/min。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于:流动注射化学发光分析仪为IFFM-E型流动注射化学发光分析仪；流动注射化学发光分析仪的流通管为聚四氟乙烯管，流通管内径为0.8mm,阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述铁氰化钾溶液为用二次蒸馏水作为溶剂配制得到的1.6X 10_5mOl/L的铁氰化钾溶液。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于:所述测试过程中，均保持在35 °C下进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述步骤3)中标准曲线方程为:Δ 1=739.35x+5.3589，其中 x 以 mg/mL 计，0.10-1.0Omg/mL 范围，R2=0.9982。
8.权利要求1-7所述的方法在剑麻皂苷元工业生产中的质量控制中的应用。
9.权利要求1-7所述的方法检测剑麻植物中的皂苷或皂苷元，作为药物方向的剑麻育种及栽培方法控制的应用。
【文档编号】G01N21/76GK103837524SQ201410075707
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2014年3月4日
【发明者】郝再彬, 孙昊, 易克贤, 郑金龙 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所