Gpc1作为肿瘤诊断标志物的用图
【专利摘要】本发明提供了GPC1蛋白作为肿瘤诊断标志物的用途。GPC1蛋白作为肿瘤诊断标志物可用于制备消化系统恶性肿瘤诊断试剂或试剂盒。本发明申请的肿瘤标志物GPC1，目前在小规模临床样本中即可证实适合作为消化系统肿瘤的诊断标志物，较传统AFP、CEA、CA199等均具有更好的敏感性和特异性，可作为人群普查的肿瘤标志物。
【专利说明】
GPC1作为肿瘤诊断标志物的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及GPC1作为肿瘤诊断标志物的用途，用于早期诊断肿瘤。
【背景技术】
[0002] 肿瘤标志物是指特异性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物 质，或是宿主对肿瘤细胞的刺激反应而产生的物质。肿瘤标志物能够反映肿瘤发生、发展， 监测肿瘤对治疗反应的一类物质。目前体检常见的肿瘤标志物包括:1 )CEA:常见于胃肠癌、 肺癌、卵巢癌等肿瘤中；2)AFP:是最早发现的肿瘤标识物，常见于原发性肝细胞肝癌；3) PSA:常见于前列腺癌;4)CA199:常见于胰腺癌。但目前临床应用的肿瘤标志物都缺乏很好 的敏感性和特异性，因此，对于新型高特异性敏感性肿瘤标志物的开发十分关键，有利于我 们早期发现肿瘤、预测患者预后、和进行个性化治疗，并对肿瘤患者进行管理和随访。
[0003] GPC1是一种细胞膜卯定蛋白，大量研究表明，GPC1在胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、 卵巢癌、结肠癌等实体瘤组织中呈高表达。血清中的外泌体是由正常细胞或者肿瘤细胞分 泌的微囊泡，对微环境的变化很稳定。外泌体中含有蛋白质、核酸等多种小分子物质，可反 映机体的疾病状态。
[0004] 发表在2015年nature上的一篇文章发现在胰腺癌患者的血清外泌体中明显高表 达GPC1，而相比之下胰腺炎、良性胰腺病变和正常对照组中的血清外泌体GPC1的表达水平 较低，提示GPC1可能作为胰腺癌早期诊断的肿瘤标志物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供GPC1蛋白的新用途。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0007] GPC1蛋白作为肿瘤诊断标志物在制备消化系统恶性肿瘤诊断试剂或试剂盒中的 用途。
[0008] 优选地，所述的消化系统恶性肿瘤为肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌和胰腺癌中的 至少一种。
[0009] 优选地，所述的消化系统恶性肿瘤诊断试剂包括抗GPC1蛋白的抗体。
[0010] 优选地，所述的GPC1蛋白为外泌体膜上卯定的GPC1蛋白。
[0011] -种消化系统恶性肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，包括抗GPC1蛋白的抗体、带荧光 的二抗，和可吸附外泌体并被流式细胞仪所检测到的磁珠。
[0012]本发明通过纳入64例胰腺癌、61例食管癌、54例胃腺癌、42例结直肠癌、30例肝癌， 并用30例正常对照、30例胃肠息肉、7例胰腺炎作对照，发现GPC1可作为消化系统恶性肿瘤 的诊断标志物，且具有较高的敏感性和特异性。
[0013]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0014] 1、本发明申请的肿瘤标志物GPC1，目前在小规模临床样本中即可证实适合作为消 化系统肿瘤的诊断标志物，较传统AFP、CEA、CA199等均具有更好的敏感性和特异性，可作为 人群普查的肿瘤标志物。
[0015] 2、目前大部分血清肿瘤标志物采用ELISA或电化学发光的方法，检测血清中的肿 瘤相关蛋白，有如下问题：1)如果该肿瘤相关蛋白不是膜蛋白，则部分血清中的肿瘤蛋白被 外泌体包被起来，ELISA无法检测到，仅能够检测血清中游离的肿瘤蛋白，从而产生误差。2) 血清中游离的肿瘤蛋白受保存条件和检测时间影响易降解或变性，都会使检测结果受到影 响。3)血清中游离的肿瘤蛋白不同于外泌体所包含蛋白，大部分由细胞崩解所被动产生，因 此易受炎症和药物等影响，对于肿瘤的诊断敏感性和特异性较低。
[0016] 3、血清中的外泌体对保存环境和检测时间都很稳定，不易被降解，且外泌体内的 蛋白、核酸等均为细胞主动或被动分泌，为功能性的，更具诊断价值。而本发明通过提取血 清中的外泌体，检测外泌体表面的膜铆钉蛋白GPC1，可保证结果的稳定和可靠。
【附图说明】
[0017] 图1各组血清外泌体GPC1阳性率柱状图，可见肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺 癌中血清外泌体GPC1阳性率明显高于胃肠息肉、胰腺炎和正常组，P值〈0.01。
[0018] 图2为R0C曲线图，如图2所示，外泌体GPC1阳性率可诊断肝癌、胃癌、食管癌、结直 肠癌、胰腺癌，且相比于传统的肿瘤标志物CA199、AFP、CEA具有较高的敏感性和特异性。图 中，A为GPC1和CA199对胰腺癌诊断的R0C曲线，B为GPC1和AFP对肝癌诊断的R0C曲线，C为 GPC1和CEA对胃癌诊断的R0C曲线，D为GPC1对食管鳞癌诊断的R0C曲线，E为GPC1和CEA对胰 腺癌诊断的R0C曲线。
[0019] 图3为胰腺癌患者术前和术后(术后5天)血清中GPCl+crExos的表达水平图，如图3 所示，胰腺癌患者术后5天血清外泌体GPC1阳性率明显低于术前。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0021] 实施例
[0022] 1、实验方法：
[0023] (1)病人和样本纳入：
[0024]在本实验中，共纳入了64个胰腺癌患者，61个食管鳞癌患者，54个胃腺癌患者，42 个结直肠癌患者，30例肝癌患者，30个胃肠息肉患者，7个胰腺炎患者，和30个正常人对照。
[0025] 肿瘤患者的入选和排除标准包括：1)有明确的病理诊断确诊为相应肿瘤;2)初诊 肿瘤，之前没有进行过任何抗癌治疗;3)没有其他急性疾病或者系统性疾病例如自身免疫 性疾病、糖尿病、冠心病等。
[0026] 对照组的患者要求没有急性疾病或者系统性疾病。
[0027] (2)样品收集
[0028]血样采集后置于黄头促凝管中，在4°C下以离心力2500g离心10分钟，吸取上层淡 黄色血清之后存储于-80°C冰箱中。
[0029] 外泌体的提取借助Invitrogen公司Total Exosome Isolation试剂盒，提取方法 如下：20yl提取试剂加入100ul血清中，4°C孵育30分钟，之后在室温以离心力10,000g离心 10分钟，弃去上清，沉淀溶于40ul 1 X PBS中，即为外泌体。
[0030] (3)流式分析外泌体包被磁珠
[0031 ] 取100ul血清中所提的外泌体中加入5ul 4-ym aldehyde/sulphate latex磁珠 (Invitrogen)室温颠倒翻转15分钟混勾，之后加入lml PBS继续室温颠倒旋转30分钟。加入 0.5ml 100mM glycine(甘氨酸)和2%BSA(牛血清白蛋白）室温颠倒旋转30分钟。以离心力 14，800g离心1分钟后沉淀为外泌体包被磁珠，用2 %BSA清洗并再次离心，沉淀用10 %BSA终 止反应。再次用2%BSA清洗磁珠后用GPC1-抗（Invitrogen，浓度为3yl抗体加入20yl 2% BSA中）室温孵育30分钟。清洗后用Alexa-488标记的荧光二抗（Invitrogen，浓度为3yl抗体 加入20yl 2%BSA中）4°C孵育半小时。之后用2%BSA反复清洗并离心2次。沉淀用100ul 2% BSA溶解并避光保存。仅用二抗孵育的样品作为阴性对照并设门。样品用流式细胞仪检测 GPC1+的外泌体包被磁珠，100，000个磁珠中GPC1阳性率作为每个样品的最终指标。
[0032] (4)统计方法
[0033]统计米用SPSS 19.0for Windows(SPSS Inc.，Chicago，USA)软件进行。
[0034] 2、实验结果：
[0035] (1)、如图1所示，肿瘤患者血清中GPC1+外泌体(GPCl+crExos)水平明显增高：
[0036] 正常人GPCl+crExos平均值为0 ? 67 ± 0 ? 12 % (范围从0 ? 12到2 ? 29 % )
[0037] 胃肠息肉1.12±0.36%(范围从0.006到10.4%)
[0038] 胰腺炎0 ? 69 ±0 ? 22% (范围从0 ? 24到 1 ? 87 % )
[0039] 肝癌 10.20± 1.44% (范围从0.76到32%)
[0040] 胃腺癌29 ? 96±3 ? 64% (范围从2 ? 68到99 ? 5% )
[0041 ]食管鳞癌30.91 ±3.01 % (范围从 1.18到97.9%)
[0042] 结直肠癌33.18±3.05% (范围从5.65到81.7%)
[0043] 胰腺癌 34.34±3.01%(范围从 3.44 到 99 ? 8 % )
[0044] P<〇.〇〇〇1〇
[0045] (2)、GPCl+crEX〇S可作为胃肠系统肿瘤的诊断标志物(表1，图2)
[0046] 采用R0C曲线图计算相应的肿瘤蛋白在诊断肿瘤时工作曲线下面积和诊断的精确 性、敏感性，从而得到表1和图2。传统肿瘤标志物采用Roche cobas e411全自动电化学免疫 发光分析仪和配套试剂检测获得。
[0047]表1 GPC1阳性的外泌体水平和传统肿瘤标志物诊断效率
[0048]
[0050] 缩写:AUC代表曲线下面积，ROC代表工作曲线特性;95 % CI代表95 %可信区间；
[0051 ]如图2所示，外泌体GPC1阳性率可诊断肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌，且相 比于传统的肿瘤标志物CA199、AFP、CEA具有较高的敏感性和特异性。
[0052]从实验结果中可以看出，阳性率达到2.035%以上有肿瘤风险，当阳性率成倍增长 时提示肿瘤风险大，需进一步行影像学或胃肠镜检查。
[0053] (3)、GPCl+crExos水平和临床特点间的关系
[0054]选取的病人和样本的临床特点如表2、3所示：
[0055]表2纳入病人临床资料：
[0056]
[0058]表3 GPC1阳性外泌体水平和患者临床特性之间的关系：
[0061 ] 通过上述软件分析得到GPCl+crExos水平和胰腺肿瘤侵犯深度(P = 0.042)、食管 鳞癌17#分期相关(P = 0.019)，另外在胰腺癌患者中男性患者血清GPCl+crExos水平更高(P =0.002)。因此，GPC1蛋白在胰腺肿瘤中侵犯越深则表达水平越高，在食管鳞癌TM1分期越 晚期则表达水平越高。
[0062] (4)、GPC1与患者预后复发相关
[0063]在上述的64个胰腺癌患者中，选取12例胰腺癌患者，采用上述实验方法检测12例 胰腺癌患者术前和术后(术后5天)血清中GPCl+crExos的表达水平，发现11个患者术后GPC1 +crExos的表达水平发生明显下降(P = 0.020，如图3所示）。由于术后GPCl+crExos的表达水 平明显下降，提示其表达与肿瘤负荷相关。因此在复发情况下可能再次升高。
【主权项】
1. GPC1蛋白作为肿瘤诊断标志物在制备消化系统恶性肿瘤诊断试剂或试剂盒中的用 途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的消化系统恶性肿瘤为肝癌、胃癌、食管 癌、结直肠癌和胰腺癌中的至少一种。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的消化系统恶性肿瘤诊断试剂包括抗 GPC1蛋白的抗体。4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GPC1蛋白为外泌体膜上卯定的GPC1蛋 白。5. -种消化系统恶性肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，包括抗GPC1蛋白的抗体、带荧光的 二抗，和可吸附外泌体并被流式细胞仪所检测到的磁珠。
【文档编号】G01N33/574GK106053815SQ201610513757
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】沈锡中, 陈妍洁, 吴昊, 刘韬韬, 董玲
【申请人】复旦大学附属中山医院