专利名称：多种妇科肿瘤标志物集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于体外临床检验和生物芯片技术领域，确切地说，是一种适于多种妇科肿瘤的诊断，预测和预后的七项指标(CEA，CA15-3，CA125，SCC，抗HPV，β-HCG，AFP)集成检测的反应板和试剂盒背景技术近年来，随着经济的发展和人民生活水平的提高，一些妇科肿瘤如如宫颈癌、卵巢癌的发病率和死亡率都呈迅猛上升态势，女性健康受到严重威胁，并且除了常见的妇科肿瘤外，乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，是造成女性死亡的主要原因之一，因此加强多种女性肿瘤的早期诊断有着重要的社会意义和临床意义。
肿瘤标志物是指肿瘤细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质，或是宿主对体内寄生物反应而产生并进入到体液或组织中的物质。目前临床上常用的肿瘤标志物大多是肿瘤相关抗原，这些肿瘤标志物并非肿瘤细胞所特有，而是肿瘤细胞的表达量明显增加，与正常细胞存在量的差异。
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，年发病率可超过70/10万，在大中城市尤为突出，是造成女性死亡的重要原因。CA153作为乳腺癌的一个标志物，在乳癌的I期和II期，仅有大约10％的病人血清CA153水平有所升高，其他有效的标志物如CEA，与乳癌的复发或转移有关。如果两项肿瘤标志物同时测定则可将转移的检出敏感性提高，CA153的敏感性可提高10％，在有骨转移的病人中，肿瘤标志物的测定更有意义，大约有85％的病人可现CA153的连续增高，而用骨闪烁仪检查，则只有63％的检出率，尤其是在实行放射疗法后，骨闪烁仪在放射性区域无法进行判断。在乳癌转移超出骨骼范围时，CEA的增高则比CA153更为明显，所以在整个治疗监测过程中两个标志物的同时平行测定是十分有意义的。
世界卫生组织的统计资料表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二，在一些发展中国家甚至居于首位；每年全球大约有50万例新发宫颈癌病例，约20万人死于宫颈癌，其中，80％的死亡发生在发展中国家。据不完全统计，我国现有宫颈癌病人约13.8万，每年约有5万人死于宫颈癌。HPV感染与宫颈癌的关系最初在19世纪70年代提出，此后许多流行病学和分子学研究均毫无疑问的证实了HPV与宫颈癌的病因学联系。Bosch和Manos等通过收集来自22个国家的宫颈癌活检标本作PCR检测，发现99.7％的肿瘤中都可以检测到HPV DNA，而且各国间无显著差异。生殖道的HPV(人乳头瘤病毒)感染HPV感染与宫颈癌的相关具有普遍意义——约80％的宫颈癌与4种类型(16、18、31型和45型)的HPV感染有关，其中，50％的宫颈癌与HPV16感染相关。用分子生物学技术-PCR或Hybrid CaptureII(HC2杂交捕获试验)可在宫颈癌组织中检测到HPV的DNA，应用重组技术表达抗原可在宫颈癌患者血中检测到HPV抗体。
原有的子宫颈鳞状上皮细胞癌较敏感的肿瘤标志物SCC和CEA对原发癌的敏感性分别为50％-70％和30％-50％，而此两个标志物同时测定，可将总的敏感性提高10％，在初期治疗后的短期观察资料表明，子宫全切后SCC水平会迅速回落至正常水平。在放射治疗中，SCC浓度居高不下的其复发率可高达80％.在长期跟踪中发现，当宫颈鳞癌复发时，有50-60％的病人SCC血清浓度会增高，比临床症状的出现或用放射学方法检出早2-5个月。鳞状细胞癌抗原其水平(SCCA)与宫颈鳞癌分期，肿瘤大小、宫颈浸润深度、脉管浸润、淋巴结受累情况及临床疗效相关，连续监测SCC水平可反映肿瘤对放疗、化疗的反应，治疗结束后的临床进程。在行化疗时，病情的恶化与好转，90％的情况可在治疗开始后2-3个月时，即通过SCC和CEA测定浓度的增高或降低获得信息。对宫颈腺癌，CA125的敏感性要比SCC和CEA高，它对原发癌的敏感性为40-60％，而对复发癌则为60-85％。
卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，由于临床症状隐匿，缺乏有效的早期诊断方法，超过80％的患者就诊时已为晚期，死亡率高。卵巢癌发病高峰在50-70岁，但有5％-10％的人发病年龄不到40岁，家族史是一个危险因素，而过早的妊娠和停止排卵则能诱发此种危险。卵巢癌有70％源于上皮，5％源于基质细胞或胚细胞，有20％则是由非妇科恶性肿瘤的转移造成。对于原发性和复发的卵巢癌，最敏感的标志物是CA125，CA125对非粘蛋白类的卵巢癌，其敏感性最高，可达75％-90％，在35％-65％的恶性基质细胞瘤和70％的胚细胞瘤病人中则也可见其血清浓度明显升高。当复发时，在临床确诊前几个月便可呈现CA125增高，尤其卵巢癌转移患者的血清CA125更明显高于正常参考值。其它非卵巢恶性肿瘤也有一定阳性率，如乳腺癌40％，胰腺癌50％，胃癌47％，肺癌41.4％，结肠直肠癌34.2％，其它妇科肿瘤43％。
对一些少见的卵巢癌，则还应测定其他肿瘤标志物，如未成熟的畸胎瘤和内胚层的实房结癌，则应测AFP，无性细胞瘤测CA125，LDH同工酶I-III和AFP。
对起源于副中肾管上皮的子宫内膜癌，较为敏感的标志物是CA125，它对原发癌的敏感性为20％-30％，对复发癌的敏感性为40％-90％，它与癌瘤的分期也有密切关系，I、II期时，敏感性为20％-30％，到III、IV期时可上升到55％-90％，若在I、II期CA125水平超过35μg/ml，则有95％的可能性肿瘤已发展到子宫肌外。在肿瘤复发时，非特异性的CEA，也会出现升高现象，其敏感性为20％-30％。
绒毛膜癌简称绒癌，是滋养层细胞的高度恶性肿瘤。约50％继发于葡萄胎，25％继发于自然流产，20％以上发生于正常妊娠，5％以下发生于早产或异位妊娠等。绒癌易侵入血管，故主要为血行转移，最多见转移至肺，其次为阴道、脑、肝、脾、肾、肠等。主要临床表现是在葡萄胎、流产或足月产后阴道持续不规则流血，血及尿中β-HCG浓度显著升高。
卵巢内胚窦瘤及畸胎瘤多发生在年轻患者中。血清甲胎球蛋白(AFP)是测定卵巢内胚窦瘤的特异指标。AFP是由胚胎的卵黄囊和不成熟的肝细胞产生的一种特异蛋白，其在胚胎血清中极高，出生后数日即不能测出，正常人亦测不出。甲胎蛋白(AFP)现已被广泛用于原发性肝癌的早期诊断。而人们研究发现，来源于人类胚胎时期卵黄囊的内胚窦瘤可分泌出AFP。国内外大量文献报道，对卵巢内胚窦瘤的患者进行血清AFP测定，证明该项指标对内胚窦瘤的诊断、随诊有一定特异性、敏感度高。不但可以早期诊断，而且可以作为是否复发转移的可靠指标，从而大大提高治疗效果。
肿瘤标志物大多无器官特异性(广谱标志物)，因此基本上不可以定位。同一种肿瘤可以有几种不同的肿瘤标志物，不同肿瘤可能有相同的肿瘤标志物。如CA125不仅是卵巢癌相关抗原，也是其他肿瘤(肺癌、肝癌、胰腺癌、胃肠道癌等)的相关抗原。肿瘤标志物在一些良性疾病和炎症时也会有不同程度升高。一般表现为中等程度升高。此时，仅仅根据肿瘤标志物一次检测是很难定性的，而应联合多个相关指标连续监测，通过动态观察可以判断肿瘤的消退、疗效及预后复发。
因为血清学指标比明显的临床症状出现早，在健康妇女中定期或不定期的进行女性肿瘤相关血清指标的检测，对于恶性肿瘤的早期发现和治疗有着重要意义，有利于妇科肿瘤的预防，指导临床治疗并改善预后状况。
肿瘤标志物的血清检测方法以ELISA法为主，每次只能检测一个指标，且价格昂贵，无法满足广大女性所需全面高效的健康体检及临床诊断要求。近年来出现的蛋白芯片技术具备高通量、快速性、并行性的优势，因此，将妇科肿瘤多指标加以组合并用于临床，不仅可以提高检测效率，且诊断灵敏度和特异性也更胜一筹，在女性恶性肿瘤的早期诊断、预后判断、疗效监测和预测复发方面将有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种可同时对多种妇科肿瘤标志物进行预测，诊断和预后判断的方法。我们的试剂盒通过检测血清或血浆中的CEA，CA15-3，CA125，SCC，抗HPV，β-HCG，AFP这七项指标，来达到这一目的。
在本发明的第一方面，提供了一种多种妇科肿瘤的诊断和预测七项指标集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括2-384个样本孔，2-8个标准品孔，其中，其特征在于每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗CEA，抗CA15-3，抗CA125，抗SCC，HPV，抗β-HCG，抗AFP等七种或以上抗原或抗体的微点阵。在每一反应孔内还设有一定位基准点。
在一优选例中，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。
在另一优选例中，所述样本孔的数量为1-300个。
在另一优选例中，所述的抗CEA，抗CA15-3，抗CA125，抗SCC，HPV，抗β-HCG，抗AFP等七种抗原或抗体在固相载体上各有2-8个点样点。
在另一优选例中，所述反应孔每孔设有一个定位基准点。
在本发明的第二方面，提供了一种多种妇科肿瘤的诊断和预测七项指标集成检测试剂盒，它包括本发明上述的多种妇科肿瘤的诊断和预测八项指标集成检测反应板。
在另一优选例中，还包括酶标工作液、检测液和标准品。
在另一优选例中，所述的酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合。
在另一优选例中，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。
图1是本发明一种固相载体上多种妇科肿瘤检测的七项指标的点样示意2是本发明的反应孔中进行的各抗原——抗体反应的示意图具体实施方式
多种妇科肿瘤七项指标集成检测的关键是要使八项指标检测的灵敏度和特异性均达到要求以保证结果的准确可靠，而相应的难点是如何将浓度差高达10000倍的各检测指标整合到一个孔里来检测。经过深入而广泛的研究，本发明采用两种不同的反应方式进行检测，并对检测反应板作了改进，同时本发明采用的微点阵检测技术，酶免疫夹心法和化学发光检测技术，大大提高了检测的灵敏度和特异性，从而解决了上述问题。
具体而言，为提高多种妇科肿瘤疾病七项或七项以上指标(CEA，CA15-3，CA125，SCC，抗HPV，β-HCG，AFP等)的检测效率，本发明应用微点阵检测技术，结合酶免疫夹心法和化学发光检测技术设计了一种多种肿瘤疾病八项指标集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括2-384个样本孔，2-200个标准品孔，其中，其特征在于每一反应孔的底部平面上有固相载体，且在固相载体上包被着抗CEA，抗CA15-3，抗CA125，抗SCC，HPV，抗β-HCG，抗AFP等七种抗原或抗体的微点阵。
各反应孔的数量没有特别限制，通常样本孔为2-384个，较佳地2-50个。标准品孔1-300个，较佳地2-8个。
在本发明中，反应孔的形状和大小没有特别限制，可以是圆形、方形、六角形、椭圆形、或其他形状。大小通常为直径0.1nm-8cm，深度为0.1nm-4cm。
在本发明中，反应板基板的材料可以选用本领域常用的各种材料，较佳的基板材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。
在本发明中，包被多种妇科肿瘤抗原或抗体的固相载体可以选用本领域常用的各种固相载体，包括(但并不限于)玻璃片、塑料、硝酸纤维(NC)膜、PDVF膜等，较佳的固相载体包括NC膜、PDVF膜。
在固相载体上，各有抗CEA，抗CA15-3，抗CA125，抗SCC，HPV，抗β-HCG，抗AFP等七种抗原或抗体1-300个点样点，较佳地2-8个点样点。此外，较佳地在固相载体上还包括一个定位点(见图1)。各点样点之间的距离通常为0.1nm-20mm。
另一方面，本发明还提供了一种多种妇科肿瘤七项指标集成检测蛋白芯片试剂盒，该试剂盒可实现多指标并行化、微型化、高通量检测。它包括本发明的反应孔板、洗涤液、酶标工作液、检测液(A、B)、标准品等。其中，酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，使用前混合。
在本发明中，各指标的检测采用酶免夹心法或竞争法，检测原理如图2所示。详细叙述如下1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。封闭，除去未结合的位点。
2)加受检血清和酶标溶液，酶标溶液包含七项检测指标的相应的酶标抗体(夹心法)。
采用夹心法检测的指标，特异的酶标抗体与血清中的抗原形成复合物，并进一步与固相抗体形成双抗夹心复合物。
3)洗涤除去未结合的抗体，抗原及杂质。
4)加底物固相上的酶催化底物，化学发光，CCD检测，光强度与标本中受检抗原的量呈正相关。
本发明巧妙地综合利用了蛋白质微点阵检测技术，酶免疫夹心法和竞争法，以及化学发光检测技术，实现了多种妇科肿瘤疾病七项指标的同时检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1检测反应板的制备取96孔板，设置42-84个样本孔，1-6个标准品孔。在每个反应孔的底部放置一固相载体(NC膜或PDVF膜)，且在固相载体上包被着抗CEA，抗CA15-3，抗CA125，抗SCC，HPV，抗β-HCG，抗AFP等七种抗原或抗体的蛋白质微列阵(图1)。
实施例2试剂盒制备制备含一多种妇科肿瘤七项指标集成检测的试剂盒，它含有实施例1的反应孔板一块(8-200人份)，洗涤浓缩液1瓶，酶标工作液1瓶，检测液A一瓶，检测液B一瓶，标准品瓶。
洗涤浓缩液、酶标工作液、检测液A、检测液B实施例3多种妇科肿瘤七项指标集成检测按以下方法对各测试血请样品进行检测1.加检测血请或标准品于相应反应孔内，100ul/孔。
2.加酶标工作液，50ul/孔。
3.30℃保温振荡反应60分钟。
4.用洗液洗涤4-6次，每次5分钟，振动。
5.加检测液40ul/孔，使检测液均匀分布于孔的底部。
6.CCD检测，视发光信号强度曝光3-20秒。
结果判定依据不同指标的CutOff值，参考标准品梯度曲线，判定样品血清的阴阳性。
与此同时，用常规方法对测试的血清样品进行常规检测。结果表明，用本发明的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种多种妇科肿瘤的诊断和预测七项指标集成检测反应板，其特征在于，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括2-384个样本孔，2-200个标准品孔，其中，其特征在于每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗CEA，抗CA15-3，抗CA125，抗SCC，HPV，抗β-HCG，抗AFP等抗体的微点阵。在每一反应孔内还设有一定位基准点。
2.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。
3.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述样本孔的数量为1-380个。
4.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的抗CEA，抗CA15-3，抗CA125，抗SCC，HPV，抗β-HCG，抗AFP等抗体在固相载体上各有2-8个点样点。
5.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，在每一反应孔内还设有一定位基准点。
6.一种多种妇科肿瘤七项集成检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的多种妇科肿瘤的诊断和预测七项指标集成检测反应板。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶标工作液，检测液和标准品。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。
全文摘要
本发明涉及多种妇科肿瘤的诊断，预测和预后的七项指标癌胚抗原(Carcinoembryonicantigen，CEA)，糖类抗原15－3 CA15－3(Carbohydrate Antigen 15－3，CA15－3)，糖类抗原CA 125(Cancer antigen 125，CA125)，鳞状细胞癌抗原(Squamous cell carcinoma antigen，SCC)，人乳头瘤病毒抗体(Human papillomavirus antibody，HPVAb)，人绒毛膜促性腺激素(β－humanchorionic gonadotropin，β－HCG)，甲胎蛋白(alpha－fetoprotein，AFP)集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒。所述的反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括2－384个样本孔，2－200个标准品孔，其中，每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗CEA，抗CA15－3，抗CA125，抗SCC，HPV，抗β－HCG，抗AFP七种抗原或抗体的微点阵。本发明的反应板和试剂盒可简便、快速、准确地实现多个人份的多种妇科肿瘤的诊断，预测和预后的七项指标的同时检测。
文档编号G01N33/533GK1880960SQ200510026780
公开日2006年12月20日 申请日期2005年6月15日 优先权日2005年6月15日
发明者汪宁梅 申请人:汪宁梅