专利名称：心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测方法及其诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种体外诊断检测方法及其诊断试剂盒，特别是涉及心脑血管疾病相关的蛋白标志物的液相芯片联合并行检测方法及其诊断试剂盒。
背景技术：
心脑血管疾病是中国城市人口和西方发达国家的主要疾病和主要死亡原因之一， 主要包括以冠心病、高血压等为代表的心血管疾病，以及缺血性脑血管病和出血性脑血管病。缺血性脑血管病，又称急性缺血性脑血管综合症(AICQ，包括脑梗死(亦称脑梗塞， Cl)和短暂性脑缺血性发作(TIA)；出血性脑血管病包括脑出血和蛛网膜下腔出血。心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测已成为心脑血管疾病的危险因素筛查或预测、早期诊断、疾病进程、疗效监测和预后判断的非常重要的指标，而多指标联合并行检测的高通量迅速性、准确性和稳定性就更加至关重要。近年来研究发现的与心脑血管疾病的发生发展相关的蛋白标志物包括D-二聚体D-D、纤溶酶原激活物抑制物PAI-I、组织型纤溶酶原激活物tPA、瘦素LEP、载脂蛋白B ApoB0目前，对于心脑血管疾病相关的蛋白标志物的测定已有多种检测方法，包括免疫比浊分析、酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、磁分离酶联免疫分析(EIMA)等。但是这些技术都存在着检测通量的局限性，且操作繁琐、灵敏度较差，不能真正满足临床诊断检测的需要。而固相生物芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的缺点。液相芯片(xMAP)又称液态芯片，是一种可广泛应用于蛋白质、基因、受体/配体等多种生物反应的新一代生物芯片技术，主要包括颜色编码的微球(Color-coded Beads)、探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、 绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。本发明基于液相芯片技术的极高通量性、高灵敏度、高特异性、重复性好、操作简便、线性范围宽、检测迅速等突出优点，对心脑血管疾病相关的多种蛋白标志物进行并行检测，能够在临床检测上得到更好的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种用于心脑血管疾病相关的蛋白标志物的液相芯片联合并行检测方法；本发明所要解决的技术问题之二是提供一种检测心脑血管疾病相关的蛋白标志物的诊断试剂盒；本发明所要解决的技术问题之三是提供上述诊断试剂盒的应用。为解决上述技术问题，本发明的一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的液相芯片联合并行检测方法，包括以下步骤(1)将捕获抗体与不同编号的微球(Beads)偶联，形成“捕获抗体-微球” 二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物，从而使待测样品中的心脑血管疾病相关的蛋白标志物与捕获抗体形成“心脑血管疾病相关的蛋白标志物-捕获抗体-微球”三联复合体；所述的心脑血管疾病相关的蛋白标志物包含以下标志物的任意一种或任意多种或加上其它标志物的组合D-D、PAI-I、tPA、LEP、ApoB ；即所述的多种蛋白标志物可以是包含D-D、PAI-U tPA、LEP、ApoB中任意一种、任意两种、任意三种、 任意四种、任意五种或加上其它标志物的组合。(2)将不同的检测抗体进行信号标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该蛋白标志物的不同抗原表位；(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤( 中带有信号标记的检测抗体混合，从而形成“信号标记的检测抗体-心脑血管疾病相关的蛋白标志物-捕获抗体-微球”四联复合体；(4)用液相芯片法(xMAP)检测出四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的存在及含量。步骤中，所述确定待检测样品中各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的含量，其具体方法为将步骤中测定的可检测标记信号与标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的含量。所述的微球的平均直径可以为5.6 μ m，该微球是结合了不同荧光染料的聚苯烯微球，即颜色编码微球(Color-coded Beads)。所述信号标记指可采用生物素(Biotin)-链霉亲和素-藻红蛋白 (Streptavidin-PE)的标记或其它本领域常规的免疫标记方法如荧光素、酶、化学发光剂寸。步骤(1)中所述的与捕获抗体偶联的微球，可以使用已经活化的微球(Activated Beads)，能够直接和捕获抗体共价偶联(如通过抗体表面的自由thoil基团)；如果使用羧基(-C00H)微球，必须先对微球进行活化，通常是采用EDC/S-NHS等化学物质活化，这样微球就能够被含有自由氨基团(Amino Group)的分子(如抗体等)共价结合。微球活化一般可采用如下方法微球在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-MB)溶液和活化缓冲液组成的3者混合液中进行活化，其中，3者混合液的用量比是当微球数量为2. 5X IO6个时，需要50mg/mlEDC溶液 10 μ 1 50mg/mlS-NHS 溶液 10 μ 1 IOOmM NaH2PO4, ρΗ 6. 3 的活化缓冲液 80 μ 1，混合液的用量可以根据微球的数量进行相应的调整。所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下5种可以自由组合的心脑血管疾病相关的蛋白标志物的捕获抗体和检测抗体D-D、PAI-I、tPA、LEP、ApoB0
检测方法中所述的步骤⑷中用液相芯片法(xMAP)进行检测，所述的可检测标记
信号是荧光信号。在本发明的另一方面，提供一种检测心脑血管疾病相关的蛋白标志物的诊断试剂盒，主要包括以下组分(1)偶联抗体的微球含有分别偶联了不同捕获抗体的微球，包含以下任意一种或任意多种微球偶联了 D-二聚体D-D捕获抗体的微球、偶联了纤溶酶原激活物抑制物 PAI-I捕获抗体的微球、偶联了组织型纤溶酶原激活物tPA捕获抗体的微球、偶联了瘦素 LEP捕获抗体的微球、偶联了载脂蛋白B ApoB捕获抗体的微球；每种捕获抗体分别抗一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物并且偶联于不同编号的微球，形成“抗体-微球”的二联复合体；(2)信号标记的检测抗体包含以下任意一种或任意多种带有信号标记的检测抗体标记的D-D检测抗体、标记的PAI-I检测抗体、标记的tPA检测抗体、标记的LEP检测抗体、标记的ApoB检测抗体；其中所述的每一种检测抗体分别抗一种相应的心脑血管疾病相关的蛋白标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该蛋白标志物的不同抗原表位；(3)标准品包含各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物(抗原)的标准品；(4)质控品包含阳性对照和阴性对照。所述信号标记的检测抗体可以是采用生物素(Biotin)标记的检测抗体；如采用生物素标记检测抗体，该诊断试剂盒还包括链霉亲和素-藻红蛋白(Mi^ptavidin-PE)，其中链霉亲和素可与生物素特异性结合，形成带藻红蛋白(PE)荧光素标记的检测抗体，通过液相芯片仪的绿色激光激发藻红蛋白进行荧光检测。其中所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下5种可以自由组合的心脑血管疾病相关的蛋白标志物的捕获抗体和检测抗体D-D、PAI-I、tPA、LEP、ApoB0在本发明的另一方面，还提供上述诊断试剂盒的应用。本发明的一种检测心脑血管疾病相关的蛋白标志物的诊断试剂盒可用于检测体外样品中心脑血管疾病相关的蛋白标志物的存在和含量，及用于心脑血管疾病的危险因素筛查或预测、诊断检测、疗效监测和预后判断，还可用于除心脑血管疾病以外的其它疾病的诊断检测或预测。由于本发明利用了液相芯片技术，对心脑血管疾病相关的多种蛋白标志物进行联合并行检测，联合并行检测方法的特征是能够一次性检测同一个样品中的多种生物标志物，使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点，能够对多种相关的蛋白标志物同时进行定性和定量检测，能在临床检测上得到更好的应用。
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明图1是本发明实施例3中检测心脑血管疾病患者与正常对照组中D-D的浓度分布图；图2是本发明实施例3中检测心脑血管疾病患者与正常对照组中PAI-I的浓度分布图；图3是本发明实施例3中检测心脑血管疾病患者与正常对照组中tPA的浓度分布图；图4是本发明实施例3中检测心脑血管疾病患者与正常对照组中LEP的浓度分布图；图5是本发明实施例3中检测心脑血管疾病患者与正常对照组中ApoB的浓度分布图。
具体实施例方式实验材料本发明所用的5种心脑血管疾病相关的蛋白标志物D-D、PAI_l、tPA、LEP、ApoB (抗原)及相应抗体来源于 Abeam、Santa Cruz Biotechnology、Fitzgerald、Biodesign 禾Π R&D Systems公司；不同编号的羧基微球(表面羧基修饰)、链霉亲和素-藻红蛋白均购置于QIAGEN 公司；1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N_羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素(S-NHS-Biotin)购置于Pierce公司。缓冲液配制活化缓冲液(Activationbuffer) IOOmM NaH2PO4, pH 6. 3 ；偶联缓冲液(Couplingbuffer) :50mM HEPES, pH 7. 4 ；磷酸缓冲液(PBS)=IOmM NaH2PO4,150mM NaCl，pH 7. 4 ；分析缓冲液(AssayBuffer) :PBS with 1% BSA，0. 05% Sodium Azide，pH 7. 4 ；洗涤液(WashBuffer) :PBS with 0. 05% Tween 20,0. 05% Proclin, pH 7. 4。实施例1 :2种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的液相芯片联合检测方法具体的检测方法包括如下步骤选择编号为11、15号的2种微球1.所需微球的活化1. 1全速涡旋微球储存液至少3min，形成均一的微球悬液；1. 2分别称取IOmg的EDC和S-NHS到两个离心管中；1. 3用去离子水溶解使其终浓度为50mg/ml ；1. 4取Iml的微球悬液IOOOOg离心3min，小心移除上清；1. 5加入80 μ 1的活化缓冲液将微球重悬；1. 6 分别加入 10 μ 1 的 EDC 溶液(50mg/ml)和 10 μ 1 的 S-NHS 溶液(50mg/ml)，混合均勻，室温(15-25°C )，避光，振荡孵育20min。2.相应的捕获抗体与活化的微球偶联2. 1用偶联缓冲液将捕获抗体稀释成体积为500μ 1，浓度为0. lmg/ml的溶液；(抗体溶液中不能含有外源蛋白，叠氮化物，氨基乙酸，Tris或其他任何含有氨基的试剂。如果含有这些试剂，通过透析或凝胶过滤层析除去。)2. 2将微球在IOOOOg离心3min，小心移除上清；
2. 3加入步骤2. 1中已经稀释好的抗体溶液(500 μ 1)；2. 4将活化的微球与抗体溶液，在室温(15_25°C )下，避光，振荡孵育池；(离心管必须用锡纸包裹避光)2. 5将微球在IOOOOg离心3min，小心移除上清；2. 6加入500 μ 1 PBS将微球重悬，IOOOOg离心3min,小心移除上清；2. 7加入Iml分析缓冲液将微球重悬；2. 8通过血小板计数器对微球计数；3.生物素(Biotin)标记检测抗体3. 1将生物素试剂(S-NHS-Biotin)从冰箱的冷藏室中取出，在室温下平衡，使其恢复到室温；3. 2依据检测抗体的浓度，用PBS将抗体稀释到lmg/ml ；如果抗体溶解在含有氨基的溶液中，应先除去氨基，置换成没有氨基的缓冲液； 3. 3用超纯水配置IOmM的生物素溶液；3.4按摩尔比1 20(抗体生物素)，计算生物素所需要的量，加入到浓度为 lmg/ml的抗体溶液中；计算公式
, 1、 抗体体积(ml)χ抗体浓度(mg/ml) ., ^^, μ
Biotin (mmol) = -^ ., .. ^ ^3 t-^-χ生物素与蛋白的摩尔比
抗体分于星(mg/mmol)3. 5将反应液在冰上孵育2h，或是在室温孵育30min ；3. 6将反应液转移到透析盒，除去其中未反应的S-NHS-Biotin。4.抗原标准品的配置LEP 按 312. 5,62. 50,12. 50,2. 50,0. 50,0. 10、0ng/ml 的浓度进行配制，ApoB 按 31. 25,6. 25、1. 25,0. 25,0. 05,0. 0U0mg/ml 标志物混合液分别标记为 STD6、STD5、STD4、 STD3、STD2、STD1、STDO。5.偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)的配制分别取偶联了 2种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的捕获抗体的微球，如下列 LEP捕获抗体微球11、ΑροΒ捕获抗体微球15，等比例混合，使每种微球的终浓度分别为200 个/μ 1，4°C避光保存。6.含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)的配制分别取进行了生物素标记的LEP检测抗体、ApoB检测抗体，加入分析缓冲液，使每种检测抗体的终浓度分别为10μ g/ml。7.质控品质控品包括阳性对照和阴性对照。8.血清样品中2种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的含量检测血清样品包括正常人血清样本12份(正常对照组1-12号样本)，心脑血管疾病患者血清样本12份(心脑血管疾病组1-3号为冠心病患者、4-6号为高血压患者、7-9号为缺血性脑血管病患者、10-12号为出血性脑血管病患者的样本)。8. 1微孔滤膜板(96孔)中分别加入200 μ 1/孔的洗涤液预湿，在室温下震荡孵育5min，用真空泵抽滤去除液体；8. 2分别加入分析缓冲液于微孔滤膜板，25 μ 1/孔；8. 3分别加入偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)于微孔滤膜板，25 μ 1/孔；8. 4 分别加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6)、质控品(阳性对照和阴性对照)、稀释过的病人血清样本1-12号、稀释过的正常人血清样本1-12号，25 μ 1/ 孔；8. 5用排枪温柔的上下混勻混合物，在室温下避光震荡孵育60min ；8. 6真空泵抽滤去除孔内液体，用洗涤液200μ 1/孔，洗涤2次；真空抽滤去除洗涤液；8. 7分别加入含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)，25 μ 1/孔，在室温下避光震荡孵育30min ；8. 8用分析缓冲液将链霉亲和素-藻红蛋白(Mi^ptavidin-PE)稀释成浓度为 200μ g/ml的溶液，每孔加入稀释好的链霉亲和素藻红蛋白25μ 1，用排枪温柔的上下混勻混合物，在室温下避光震荡孵育20min ；8. 9真空泵抽滤去除孔内液体，用洗涤液200μ 1/孔，洗涤2次；真空抽滤去除洗涤液；8. 10每孔分别加入100 μ 1分析缓冲液重悬微球；8. 11在液相芯片仪(LiquiChip 200或Luminex 200)上，对反应的混合物进行分析，可自动绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出检测样品中2种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的含量。8. 12检测结果及分析具体参见表1-3。表1心脑血管疾病组相关的蛋白标志物的浓度值
权利要求
1.一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测方法，其特征在于，包括以下主要步骤(1)将捕获抗体与不同编号的微球Beads偶联，形成“捕获抗体-微球”二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物，从而使待测样品中的心脑血管疾病相关的蛋白标志物与捕获抗体形成“心脑血管疾病相关的蛋白标志物-捕获抗体-微球”三联复合体；所述的心脑血管疾病相关的蛋白标志物包含以下标志物的任意一种或任意多种或加上其它标志物的组合D- 二聚体D-D、纤溶酶原激活物抑制物PAI-Iji 织型纤溶酶原激活物tPA、瘦素LEP、载脂蛋白B ApoB ；(2)将不同的检测抗体进行信号标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该蛋白标志物的不同抗原表位；(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤( 中的带有信号标记的检测抗体混合，从而形成“信号标记的检测抗体-心脑血管疾病相关的蛋白标志物-捕获抗体-微球”四联复合体；(4)用液相芯片法xMAP检测出四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的存在及含量。
2.如权利要求1所述的心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测方法，其特征在于，步骤中，所述确定待检测样品中各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的含量，其具体方法为将步骤中测定的标记信号与标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的含量。
3.如权利要求1所述的心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的微球是一种颜色编码微球Colot-coded Beads，且结合了不同荧光染料的聚苯烯微球。
4.如权利要求1所述的心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测方法，其特征在于，所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下5种标志物自由组合的心脑血管疾病相关的蛋白标志物的捕获抗体和检测抗体D- 二聚体D-D、纤溶酶原激活物抑制物PAI-I、组织型纤溶酶原激活物tPA、瘦素LEP、载脂蛋白B ApoB0
5.如权利要求1所述的心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测方法，其特征在于，所述步骤⑷中用液相芯片法xMAP进行检测，可检测的标记信号是荧光信号。
6.一种检测心脑血管疾病相关的蛋白标志物的诊断试剂盒，其特征在于，包括以下主要组成成分(1)偶联抗体的微球含有分别偶联了不同捕获抗体的微球，包含以下任意一种或任意多种微球偶联了 D- 二聚体D-D捕获抗体的微球、偶联了纤溶酶原激活物抑制物PAI-I 捕获抗体的微球、偶联了组织型纤溶酶原激活物tPA捕获抗体的微球、偶联了瘦素LEP捕获抗体的微球、偶联了载脂蛋白B ApoB捕获抗体的微球；每种捕获抗体分别抗一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物并且偶联于不同编号的微球，形成“抗体-微球”的二联复合体；(2)信号标记的检测抗体包含以下任意一种或任意多种带有信号标记的检测抗体 标记的D- 二聚体D-D检测抗体、标记的纤溶酶原激活物抑制物PAI-I检测抗体、标记的组织型纤溶酶原激活物tPA检测抗体、标记的瘦素LEP检测抗体、标记的载脂蛋白B ApoB检测抗体；其中所述的每一种检测抗体分别抗一种相应的心脑血管疾病相关的蛋白标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该蛋白标志物的不同抗原表位；(3)标准品包含各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的标准品；(4)质控品包含阳性对照和阴性对照。
7.如权利要求6所述的检测心脑血管疾病相关的蛋白标志物的诊断试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体和检测抗体是包含针对以下5种自由组合的心脑血管疾病相关的蛋白标志物的捕获抗体和检测抗体D- 二聚体D-D、纤溶酶原激活物抑制物PAI-I、组织型纤溶酶原激活物tPA、瘦素LEP、载脂蛋白B ApoB0
8.—种如权利要求6或7所述的诊断试剂盒在检测体外样品中心脑血管疾病相关的蛋白标志物的存在和含量中的应用，以及在心脑血管疾病的危险因素筛查或预测、诊断检测、 疗效监测和预后判断中的应用。
9.一种如权利要求6或7所述的诊断试剂盒在除心脑血管疾病以外的其他疾病的诊断检测或预测、疗效监测和预后判断中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测方法及其诊断试剂盒，联合并行检测方法的特征是能够一次性检测同一个样品中的多种蛋白标志物，即通过液相芯片的制备，形成“信号标记的检测抗体-心脑血管疾病相关的蛋白标志物-捕获抗体-微球”的四联复合体，通过检测四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待检测样品中各种不同的心脑血管疾病相关的蛋白标志物的存在及含量。本发明还公开了该诊断试剂盒的组成成分及该诊断试剂盒的应用。本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性、高灵敏度和特异性、检测快速准确等突出优点，能够对心脑血管疾病相关的多种蛋白标志物同时进行定性和定量检测。
文档编号G01N33/532GK102353789SQ201110169468
公开日2012年2月15日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者袁福美, 邵棠, 陈庆 申请人:江苏迈迪基因生物科技有限公司