一种鹿流行性出血病病毒琼扩抗体检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测鹿流行性出血病病毒(EHDV)抗体的琼扩检测试剂盒及其制备和使用方法，包括分别放置的EHDV琼扩抗原，EHDV阳性血清、EHDV阴性血清和稀释液。本发明与标准检测方法—病毒中和试验相比，检测环境条件要求低，检测时间短，检测通量高，检测费用低，可快速进行临床样品中鹿流行性出血病病毒抗体检测。
【专利说明】
一种鹿流行性出血病病毒琼扩抗体检测试剂盒
技术领域
[0001 ]本发明涉及病毒抗体检测领域，尤其涉及一种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼 扩检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鹿流行性出血病（epizootic haemorrhagic disease of deer，EHD)是一种季节 性、非接触性的病毒性传染病。在自然条件下，鹿流行性出血病病毒(EHDV)可引起牛、绵羊 等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多种驯养和野生反刍动物感染。EHDV还是茨城病的病原， 该病在日本、中国台湾、朝鲜都有报道。牛感染后，临床以发热、精神沉郁、吞咽困难、消瘦等 为特征，有时还导致怀孕牛流产、死胎。
[0003] EHDV存在多个血清型。美国主要为EHDV-2、EHDV-1，澳大利亚 2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8等6个血清型。尼日利亚有EHDV-3、EHDV-4。另外，印度尼 西亚、中国台湾省、马来西亚、菲律宾、圭亚那等地都分离到EHDV JHD目前尚无有效疫苗和 治疗措施，控制和消灭EHD必须花费大量的人力物力。
[0004] EHD病毒抗体检测包括中和试验、酶联免疫吸附试验、琼扩抗体检测试验等。其中 由于琼扩抗体检测试验具有操作环境要求低等特点，广泛应用于EHD病毒抗体的检测中，本 发明中涉及检测试剂盒正是基于此市场需求而开发的。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题在于，研制EHDV琼扩抗原；利用免疫山羊制备EHDV阳性 血清;组装试剂盒，检测指标达到国际认可的检测值。
[0006] 本发明采用如下技术方案实现：
[0007] -种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒，该试剂盒包括EHDV琼扩抗 原和EHDV阳性血清，其中，EHDV琼扩抗原为灭活的EHDV; EHDV阳性血清为EHDV多克隆抗体； 该试剂盒还包括:EHDV弱阳性血清、EHDV阴性血清、稀释液、说明书。
[0008] 本发明所述的稀释液配方为含有质量分数为0.5%~1.5%BSA的PBS。
[0009] 本发明所述的EHDV弱阳性血清为EHDV阳性血清稀释32~128倍，分装，冻干而得。
[0010] 本发明所述的检测试剂盒各组成部分的体积或数量如下：
[0012] -种鹿流行性出血病病毒琼扩抗体检测试剂盒的制备方法，本发明所述的EHDV琼 扩抗原的制备方法包括:EHDV种毒接种BHK细胞，在细胞病变达85 % -100 %时，反复冻融，收 获病毒;4000-8000rpm离心;取上清，用pH 8.0~8.5的磷酸盐缓冲液透析病毒液24h~48h， 换用pH7.0的磷酸盐缓冲液透析病毒液24h~48h，用浓缩剂PEG20000浓缩;采用琼扩法，用 标准弱阳性血清校正病毒蛋白含量，分装，冻干即得。
[0013 ]本发明所述的EHDV琼扩阳性血清的制备方法包括:使用纯化的EHDV免疫羊或牛或 鹿，经三次常规免疫后，静脉注射免疫一次，3-7天内采血分离血清，分装，冻干而得。
[0014] -种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒的使用方法，其操作步骤 为，
[0015] 【实验准备】
[0016] 0.85%生理盐水配置称取NaCl 8.5g，加入去离子水或灭菌蒸馏水至1000ml;
[0017] 1%琼脂糖凝胶制备称取琼脂糖lg，加入至100ml 0.85%生理盐水中。加热煮沸 溶解，自然冷却至55°C，加入0.01 %柳硫汞；
[0018] 1 %琼脂糖凝胶平皿制备取55 °C左右1 %琼脂糖凝胶12ml加入到直径85mm平皿， 琼脂板厚度约为2.8mm-3mm，待自然凝固后置4°C冰箱30min，即可进行试验；制备的琼脂凝 胶平板在2_8 °C可保存24h;
[0019] EHD琼扩抗原在EHDV琼扩抗原冻干瓶中加入0.5-lml稀释液，混匀，即为EHDV琼扩 抗原;4 °C保存，保存期12个月；
[0020] EHDV阳性血清在EHDV阳性血清冻干瓶中加入1.5-3ml稀释液，混匀，即为EHDV阳 性血清;4 °C保存，保存期12个月；
[0021] EHDV弱阳性血清在EHDV弱阳性血清冻干瓶中加入0.5-lml稀释液，混匀，即为 EHDV弱阳性血清;4 °C保存，保存期12个月；
[0022] EHDV阴性血清在EHDV阴性血清冻干瓶中加入0.5-lml稀释液，混匀，即为EHDV阴 性血清;4 °C保存，保存期12个月；
[0023]【实验操作】
[0024] 打孔
[0025] 采用7孔制；用打孔器(孔直径3mm，孔间距2mm)，垂直在1 %琼脂糖凝胶平皿上打 孔，打孔后用连接真空栗的18号针头或普通针头，挑出孔中间的琼脂;最终形成中间1孔，周 围6孔为一组的梅花图形;其中周围6孔从顶部开始按照顺时针方向，依次为1孔、2孔、3孔、4 孔、5孔、6孔；
[0026] 加样
[0027] 每孔加25ul;按照图1所示，1、3、5孔加测试血清（测试样品），2、4、6孔加EHDV阳性 血清；中心孔加EHDV琼扩抗原；
[0028] 每次试验应设阳性、弱阳性和阴性对照；
[0029] 阳性对照:周边6孔加入EHDV阳性血清，中间孔加抗原;如图2所示；
[0030] 弱阳性对照：1、3、5孔加EHDV弱阳性血清；2、4、6孔加EHDV阳性血清，中间孔加抗 原；如图3所不。
[0031]阴性对照：1、3、5孔加EHDV阴性血清；2、4、6孔加EHDV阳性血清，中间孔加抗原；如 图4所示；
[0032] 感作
[0033] 加样后静置5min，移入湿盒内；湿盒放置于室温(22 °C~25 °C )，或放置于（22°C~ 25 °C)的反应箱中感作;感作时间为24h~48h。
[0034]本发明被检血清孔与抗原孔之间出现明显清晰致密的沉淀线，此时被检血清为阳 性血清。（如图5所示）。
[0035]本发明EHDV阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲，而被检血 清孔与抗原之间不形成完整的沉淀线，此时被检血清为弱阳性血清。（如图3所示）。
[0036] 本发明被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，EHDV阳性血清孔与抗原孔间沉淀线直 伸延到被检血清孔边缘，无弯曲，此时被检血清为阴性血清。（如图4所示）。
[0037] 本发明抗原孔与被检血清与EHDV阳性血清的沉淀线交叉，为非特异性反应(如图6 所示，第1孔样品）。
[0038] 第一次检测为弱阳性、非特异性样品须重复试验。重复试验仍为弱阳性，此时被检 血清为判为阳性血清，重复试验仍为非特异性反应，此时被检血清为阴性血清。
[0039]本发明的有益效果为，可快速进行临床样品中EHDV病毒抗体检测，与EHDV中和抗 体试验相比，检测时间短，检测通量高，检测费用低，可广泛应用于各个基层畜牧兽医站等 相关检测机构。本发明的检测试剂可以以试剂盒的形式组装，试剂盒可用于EHDV抗体的快 速检测和流行病学调查。
【附图说明】
[0040]图1.琼扩试验加样示意图。
[0041 ]图2. EHDV阳性血清形成六边形沉淀线示意图。
[0042]图3.弱阳性血清形成沉淀线示意图。
[0043]图4.阴性血清形成沉淀线示意图。
[0044] 图5.强阳性、阳性样品形成沉淀线示意图。
[0045] 图6.弱阳性、非特异性样品形成沉淀线示意图。
【具体实施方式】
[0046] -种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒，该试剂盒包括EHDV琼扩抗 原和EHDV阳性血清，其中，EHDV琼扩抗原为灭活的EHDV; EHDV阳性血清为EHDV多克隆抗体； 该试剂盒还包括:EHDV弱阳性血清、EHDV阴性血清、稀释液、说明书。
[0047]本发明所述的稀释液配方为含有质量分数为0.5 %~1.5 % BSA的PBS。
[0048] 本发明所述的EHDV弱阳性血清为EHDV阳性血清稀释32~128倍，分装，冻干而得。
[0049]本发明所述的检测试剂盒各组成部分的体积或数量如下：
[0051] -种鹿流行性出血病病毒琼扩抗体检测试剂盒的制备方法，本发明所述的EHDV琼 扩抗原的制备方法包括:EHDV种毒接种BHK细胞，在细胞病变达85 % -100 %时，反复冻融，收 获病毒;4000-8000rpm离心;取上清，用pH 8.0~8.5的磷酸盐缓冲液透析病毒液24h~48h， 换用pH7.0的磷酸盐缓冲液透析病毒液24h~48h，用浓缩剂PEG20000浓缩;采用琼扩法，用 标准弱阳性血清校正病毒蛋白含量，分装，冻干即得。
[0052]本发明所述的EHDV琼扩阳性血清的制备方法包括:使用纯化的EHDV免疫羊或牛或 鹿，经三次常规免疫后，静脉注射免疫一次，3-7天内采血分离血清，分装，冻干而得 [0053] -种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒的使用方法，其操作步骤 为，
[0054]【实验准备】-
[0055] 0.85%生理盐水配置称取NaCl 8.5g，加入去离子水或灭菌蒸馏水至1000ml;
[0056] 1%琼脂糖凝胶制备称取琼脂糖lg，加入至100ml 0.85%生理盐水中。加热煮沸 溶解，自然冷却至55°C，加入0.01 %柳硫汞；
[0057] 1 %琼脂糖凝胶平皿制备取55°C左右1 %琼脂糖凝胶12ml加入到直径85mm平皿， 琼脂板厚度约为2.8mm-3mm，待自然凝固后置4°C冰箱30min，即可进行试验；制备的琼脂凝 胶平板在2_8 °C可保存24h;
[0058] EHD琼扩抗原在EHDV琼扩抗原冻干瓶中加入0.5-lml稀释液，混匀，即为EHDV琼扩 抗原;4 °C保存，保存期12个月；
[0059] EHDV阳性血清在EHDV阳性血清冻干瓶中加入1.5-3ml稀释液，混匀，即为EHDV阳 性血清;4 °C保存，保存期12个月；
[0060] EHDV弱阳性血清在EHDV弱阳性血清冻干瓶中加入0.5-lml稀释液，混匀，即为 EHDV弱阳性血清;4 °C保存，保存期12个月；
[0061 ] EHDV阴性血清在EHDV阴性血清冻干瓶中加入0.5-lml稀释液，混匀，即为EHDV阴 性血清;4 °C保存，保存期12个月；
[0062]【实验操作】
[0063] 打孔
[0064] 采用7孔制；用打孔器(孔直径3mm，孔间距2mm)，垂直在1 %琼脂糖凝胶平皿上打 孔，打孔后用连接真空栗的18号针头或普通针头，挑出孔中间的琼脂;最终形成中间1孔，周 围6孔为一组的梅花图形；
[0065] 加样
[0066] 每孔加25ul;按照图1所示，1、3、5孔加测试血清，2、4、6孔加EHDV阳性血清；中心孔 加EHDV琼扩抗原；
[0067]每次试验应设阳性、弱阳性和阴性对照；
[0068]阳性对照:周边6孔加入EHDV阳性血清，中间孔加抗原;如图2所示；
[0069]弱阳性对照：1、3、5孔加EHDV弱阳性血清；2、4、6孔加EHDV阳性血清，中间孔加抗 原；如图3所不。
[0070]阴性对照：1、3、5孔加EHDV阴性血清；2、4、6孔加EHDV阳性血清，中间孔加抗原；如 图4所示；
[0071 ] 感作
[0072] 加样后静置5min，移入湿盒内；湿盒放置于室温(22 °C~25 °C )，或放置于（22°C~ 25 °C)的反应箱中感作;感作时间为24h~48h。
[0073]本发明被检血清孔与抗原孔之间出现明显清晰致密的沉淀线，此时被检血清为阳 性血清。（如图5所示）。
[0074]本发明EHDV阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲，而被检血 清孔与抗原之间不形成完整的沉淀线，此时被检血清为弱阳性血清。（如图3所示）。
[0075] 本发明被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，EHDV阳性血清孔与抗原孔间沉淀线直 伸延到被检血清孔边缘，无弯曲，此时被检血清为阴性血清。（如图4所示）。
[0076] 本发明抗原孔与被检血清与EHDV阳性血清的沉淀线交叉，为非特异性反应(如图6 所示，第1孔样品）。
[0077] 第一次检测为弱阳性、非特异性样品须重复试验。重复试验仍为弱阳性，此时被检 血清为弱阳性血清，，重复试验仍为非特异性反应，此时被检血清为阴性血清。
[0078] 实施例：
[0079] 本发明组装的试剂盒包括:EHDV琼扩抗原、EHDV阳性血清、EHDV弱阳性血清、EHDV 阴性血清、稀释液、说明书。
[0080]根据本发明技术方案内容制成的产品一鹿流行性出血病病毒琼扩抗体检测试剂 盒，参考体积或数量如下： 试剂盒主要组成部分名称： 体积或数量：
[00813 EHDV」;;(r抗拟 0.5mlx2 EHDV阳性血清 1.5mlx2 EHDV弱阳性血清 0.5ml EHDV阴性血清 0.5ml
[0082] 稀释液 7ml 说明书 一份
[0083]以下提供制备上述试剂盒的具体实例：
[0084] 1.制备EHDV琼扩抗原
[0085] 所述的EHDV琼扩抗原的制备方法包括：EHDV种毒接种fflK细胞，在细胞病变达 85 %-100 %时，反复冻融，收获病毒;4000rpm离心；取上清，用pH 8.0~8.5的磷酸盐缓冲液 透析病毒液24h~48h，换用pH7.0的磷酸盐缓冲液透析病毒液24h~48h，PEG20000浓缩。采 用琼扩法，用标准弱阳性血清校正病毒蛋白含量，分装即得。
[0086] 2 ?制备EHDV阳性血清
[0087] 灭活的鹿流行性出血病病毒加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂 (FIA)乳化，先后免疫16~18月龄山羊三次，第一次免疫为FCA和病毒混合物，第二、第三次 免疫为FIA和病毒混合物;每次免疫间隔7天，在末次免疫结束后的3~7天内，颈静脉取少量 血，分离血清，采用中和试验检测抗体效价，如检测为阳性，效价大于1:256,则颈部大量取 血。分离血清，1.5ml/管分装，冻干，贴上标签，4 °C保存。
[0088] 3.制备EHDV弱阳性血清
[0089] 利用阴性血清，倍比稀释鹿流行性出血病强阳性血清，采用《鹿流行性出血病病毒 中和试验》进行效价测定，与商品化标准弱阳性血清进行比较，制备鹿流行性出血病弱阳性 血清，0.5ml/管分装，冻干，贴上标签，4 °C保存。
[0090] 4 ?制备EHDV阴性血清
[0091 ] 选择体格健壮的16~18个月以上的山羊，采血，用0IE (2015)《鹿流行性出血病毒 中和试验》检测方法确认血清中是否有鹿流行性出血病抗体，选择无鹿流行性出血病抗体 的山羊，无菌采血分离血清。0.5mL/管分装，冻干，贴上标签，4 °C保存。
[0092] 5.制备稀释液
[0093] 稀释液配方:NaCl 8g，KH2P〇4 0.24g，Na2HP〇4l.44g，KCl 0.2g，蒸馏水 1000mL，充 分溶解，0.5 % BSA，过滤除菌后分装。
[0094] 6.试剂盒的组装:按上述方法制备好的EHDV琼扩抗原、EHDV阳性血清、EHDV弱阳性 血清、EHDV阴性血清、稀释液、说明书，分别贴上标签。1份详细的试剂盒使用操作说明书。装 入专用的试剂盒外壳内，外壳上贴上试剂盒标签。
[0095] 7.试剂盒中各种试液的配制与分装 试剂盒主要组成部分名称： 体积或数量： EHDV谅七'抗吩 0.5mlx2 EHDV阳性血清 1.5ml><2
[0096] EHDV弱阳性血清 0.5ml EHDV阴性血清 0 5ml 稀释液 7ral 说明书 一份
[0097] 使用上述试剂盒进行检测操作的程序如下：
[0098] 【实验准备】
[0099] 0.85%生理盐水配置称取NaCl 8.5g，加入去离子水或灭菌蒸馏水至1000ml。
[0100] 1%琼脂糖凝胶制备称取琼脂糖lg，加入至l〇〇ml 0.85%生理盐水中。加热煮沸 溶解，自然冷却至55°C，加入0.01 %柳硫汞。
[0101] 1 %琼脂糖凝胶平皿制备取55°c左右1 %琼脂糖凝胶12ml加入到直径85mm平皿， 琼脂板厚度约为2.8mm-3mm，待自然凝固后置4°C冰箱30min，即可进行试验。制备的琼脂凝 胶平板在2_8 °C可保存24h。
[0102] EHD琼扩抗原在EHDV琼扩抗原冻干瓶中加入0.5ml稀释液，混匀，即为EHDV琼扩抗 原。4°C保存，保存期12个月。
[0103] EHDV阳性血清在EHDV阳性血清冻干瓶中加入1.5ml稀释液，混匀，即为EHDV阳性 血清。4 °C保存，保存期12个月。
[0104] EHDV弱阳性血清在EHDV弱阳性血清冻干瓶中加入0.5ml稀释液，混匀，即为EHDV 弱阳性血清。4 °C保存，保存期12个月。
[0105] EHDV阴性血清在EHDV阴性血清冻干瓶中加入0.5ml稀释液，混匀，即为EHDV阴性 血清。4 °C保存，保存期12个月。
[0106] 【实验操作】
[0107] 1 ?打孔
[0108] 采用7孔制。用打孔器(孔直径3mm，孔间距2mm)，垂直在1 %琼脂糖凝胶平皿上打 孔，打孔后用连接真空栗的18号针头或普通针头，挑出孔中间的琼脂。最终形成中间1孔，周 围6孔为一组的梅花图形。其中周围6孔从顶部开始按照顺时针方向，依次为1孔、2孔、3孔、4 孔、5孔、6孔；
[0109] 2 ?加样
[0110] 每孔加25ul。按照图1所示，1、3、5孔加测试血清，2、4、6孔加EHDV阳性血清；中心孔 加EHDV琼扩抗原。
[0111] 3.每次试验应设阳性、弱阳性和阴性对照。
[0112] 阳性对照:周边6孔加入EHDV阳性血清，中间孔加抗原。如图2所示。
[0113] 弱阳性对照：1、3、5孔加EHDV弱阳性血清；2、4、6孔加EHDV阳性血清，中间孔加抗 原。如图3所示。
[0114] 阴性对照：1、3、5孔加EHDV阴性血清；2、4、6孔加EHDV阳性血清，中间孔加抗原。如 图4所示。
[0115] 4 ?感作
[0116] 加样后静置5min，移入湿盒内。湿盒放置于室温(22°C~25°C)，或放置于（22°C~ 25 °C)的反应箱中感作。感作时间为24h~48h。
[0117]【结果分析】
[0118]结果分析:24h分析，48h分析。
[0119] 在阳性对照、弱阳性对照、阴性对照试验成立的条件下，进行待检样品的分析：
[0120] 本发明被检血清孔与抗原孔之间出现明显清晰致密的沉淀线，此时被检血清为阳 性血清。（如图5所示）。
[0121 ]本发明EHDV阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲，而被检血 清孔与抗原之间不形成完整的沉淀线，此时被检血清为弱阳性血清。（如图3所示）。
[0122] 本发明被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，EHDV阳性血清孔与抗原孔间沉淀线直 伸延到被检血清孔边缘，无弯曲，此时被检血清为阴性血清。（如图4所示）。
[0123] 本发明抗原孔与被检血清与EHDV阳性血清的沉淀线交叉，为非特异性反应(如图6 所示，第1孔样品）。
[0124] 5.第一次检查为弱阳性、非特异性样品须重复试验。重复试验仍为弱阳性，此时被 检血清为弱阳性血清，重复试验仍为非特异性反应，此时被检血清为阴性血清。
[0125] 应用上述试剂盒检测云南地区采集90份临床样品，检出阳性8份，阴性82份，同时 用国际公认病毒中和试验进行检测，发现本专利所发明检测试剂盒与中和试验检测结果均 相同；同时检测赤羽病、口蹄疫、小反刍兽疫阳性血清，均为阴性。
[0126] 上述具体实施例的实验数据表明，本发明的EHDV琼扩抗体检测试剂盒特异性强， 敏感性高，适用于EHDV抗体的快速检测和流行病学调查。
[0127] 以上所述内容记载的全部内容，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保 护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻 易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
[0128] 本发明技术方案涉及的名称解释如下：
[0129] BSA:牛血清白蛋白；
[0130] PBS:磷酸盐缓冲液；
[0131] EHDV:鹿流行性出血病病毒；
[0132] BHK细胞:仓鼠肾细胞。
【主权项】
1. 一种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括 EHDV琼扩抗原和EHDV阳性血清，其中，EHDV琼扩抗原为灭活的EHDV; EHDV阳性血清为EHDV多 克隆抗体;该试剂盒还包括:EHDV弱阳性血清、EHDV阴性血清、稀释液、说明书。2. 根据权利要求1所述的一种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒，其特 征在于，所述的稀释液配方为含有质量分数为0.5%~1.5%BSA的PBS。3. 根据权利要求1所述的一种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒，其特 征在于，所述的EHDV弱阳性血清为EHDV阳性血清稀释32~128倍，分装，冻干而得。4. 根据权利要求1所述的一种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒，其特 征在于，所述的检测试剂盒各组成部分的体积或数量如下：5. -种鹿流行性出血病病毒琼扩抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的 EHDV琼扩抗原的制备方法包括:EHDV种毒接种BHK细胞，在细胞病变达85 % -100 %时，反复 冻融，收获病毒；4000_8000rpm尚心；取上清，用pH 8.0~8.5的磷酸盐缓冲液透析病毒液 24h~48h，换用pH7.0的磷酸盐缓冲液透析病毒液24h~48h，用浓缩剂PEG20000浓缩;采用 琼扩法，用标准弱阳性血清校正病毒蛋白含量，分装，冻干即得。6. 根据权利要求5所述的一种鹿流行性出血病病毒琼扩抗体检测试剂盒的制备方法， 其特征在于，所述的EHDV琼扩阳性血清的制备方法包括:使用纯化的EHDV免疫羊或牛或鹿， 经三次常规免疫后，静脉注射免疫一次，3-7天内采血分离血清，分装，冻干而得。7. 根据权利要求1至4任一项所述的一种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试 剂盒的使用方法，其操作步骤为， 【实验准备】- 0.85 %生理盐水配置称取NaCl 8.5g，加入去离子水或灭菌蒸馏水至1000ml; 1 %琼脂糖凝胶制备称取琼脂糖lg，加入至l〇〇ml 0.85%生理盐水中；加热煮沸溶解， 自然冷却至55 °C，加入0.01 %柳硫汞； 1 %琼脂糖凝胶平皿制备取55°C左右1 %琼脂糖凝胶12ml加入到直径85mm平皿，琼脂板 厚度约为2.8mm-3mm，待自然凝固后置4°C冰箱30min，即可进行试验;制备的琼脂凝胶平板 在2-8°C可保存24h; EHD琼扩抗原在EHDV琼扩抗原冻干瓶中加入0.5-lml稀释液，混匀，即为EHDV琼扩抗原； 4 °C保存，保存期12个月； EHDV阳性血清在EHDV阳性血清冻干瓶中加入1.5-3ml稀释液，混匀，即为EHDV阳性血 清;4°C保存，保存期12个月； EHDV弱阳性血清在EHDV弱阳性血清冻干瓶中加入0.5-lml稀释液，混匀，即为EHDV弱阳 性血清;4 °C保存，保存期12个月； EHDV阴性血清在EHDV阴性血清冻干瓶中加入0.5-lml稀释液，混匀，即为EHDV阴性血 清;4°C保存，保存期12个月； 【实验操作】 打孔 采用7孔制；用打孔器孔直径3mm，孔间距2mm，垂直在1 %琼脂糖凝胶平皿上打孔，打孔 后用连接真空栗的18号针头或普通针头，挑出孔中间的琼脂;最终形成中间1孔，周围6孔为 一组的梅花图形;其中周围6孔从顶部开始按照顺时针方向，依次为1孔、2孔、3孔、4孔、5孔、 6孔； 加样 每孔加25ul; 1、3、5孔加被检血清，2、4、6孔加EHDV阳性血清；中心孔加EHDV琼扩抗原； 每次试验应设阳性、弱阳性和阴性对照； 阳性对照:周边6孔加入EHDV阳性血清，中间孔加抗原； 弱阳性对照：1、3、5孔加EHDV弱阳性血清;2、4、6孔加EHDV阳性血清，中间孔加抗原； 阴性对照：1、3、5孔加EHDV阴性血清;2、4、6孔加EHDV阳性血清，中间孔加抗原； 感作 加样后静置5min，移入湿盒内；湿盒放置于室温：22 °C~25°C，或放置于22 °C~25 °C的 反应箱中感作;感作时间为24h~48h。8. 根据权利要求7所述的一种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒的使用 方法，被检血清孔与抗原孔之间出现明显清晰致密的沉淀线为被检血清为阳性血清。9. 根据权利要求7所述的一种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒的使用 方法，EHDV阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲，而被检血清孔与抗 原之间不形成完整的沉淀线，此时被检血清为弱阳性血清。10. 根据权利要求7所述的一种检测鹿流行性出血病病毒抗体的琼扩检测试剂盒的使 用方法，被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，EHDV阳性血清孔与抗原孔间沉淀线直伸延到 被检血清孔边缘，无弯曲，此时被检血清为阴性血清。
【文档编号】G01N33/569GK106053804SQ201610421335
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】孙瑶, 艾军, 刘晓慧, 叶玲玲, 杨云庆, 祝贺, 杨俊兴, 周晓黎, 花群义, 董俊, 张晓丁, 尹尚莲, 徐维加, 徐自忠
【申请人】艾军, 杨俊兴