一种快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量的金标试纸及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量的金标试纸，包括底板、样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，金胶垫上含有胶体金与抗卵黄磷蛋白单抗结合形成的金标抗卵黄磷蛋白抗体复合物，硝酸纤维膜层上设有抗卵黄磷蛋白多克隆抗体溶液印制的测试线及羊抗鼠IgG抗体溶液印制的质控线。优点：1、本发明的金标试纸使用简便，检测快速，灵敏度高，较目测及经验推断卵黄物质消耗情况可靠度和工作效率均得到了极大地提高。2、本发明的金标试纸用于快速检测蟹类水产品卵黄磷蛋白含量，结果判断直观可靠，可用于蟹类育苗技术的标准化测试，提高蟹类人工育苗的成功率，为经济蟹类养殖产业可持续发展的基础。
【专利说明】
一种快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量的金标试纸及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及卵黄磷蛋白检测技术领域，具体地说，是一种快速测定蟹类卵黄磷蛋 白含量的金标试纸及其应用。
【背景技术】
[0002] 经济蟹类是我国水产品的重要组成部分，经中国渔业年鉴统计，至2014年，我国各 类经济蟹类市场消费量达60万吨，其中主要的经济蟹类包括中华绒螯蟹，三疣梭子蟹，拟穴 青蟹，远海梭子蟹等，为适应市场的巨大需求，我国自上世纪八十年代起逐步开始各种经济 蟹类的人工养殖，随着经济蟹类养殖规模的不断扩大，制约养殖发展的主要问题是优质苗 种稀缺。由于蟹类和鱼类不同，在孵化后要经过数次蜕壳，变态才能变为真正意义上的"蟹 苗"，这一复杂特性导致目前蟹类育苗水平普遍偏低，亲本性腺发育不良、抱卵量低、胚胎发 育死亡率高、幼体育成率低等都造成了优质苗种的供应不足。此外，低效的育苗技术导致每 年需要从野生资源中捕获大量的亲本或者天然苗种才能满足生产需求，这必然给经济蟹类 的自然资源保护带来巨大的压力，因此提高蟹类人工育苗的成功率，是经济蟹类养殖产业 可持续发展的基础。
[0003] 甲壳类在胚胎发育过程中均形成卵黄囊结构，卵黄囊中的卵黄物质是整个胚胎发 育过程中唯一的营养来源，在孵化后，卵黄囊中依然存有部分卵黄物质，为初孵幼体提供能 量，待卵黄物质消耗完毕，卵黄囊特化为肝胰腺，幼体才开始从外界摄食获取营养。由于甲 壳动物这种孵化后依然靠自身卵黄物质供能一段时间的特性，给育苗工作带来很大的难 题，蚤状幼体孵化后恰到时机的投饵，是保证育苗成功的重要因素之一。过早的投饵，幼体 并不摄食，饵料在水中影响水质，过晚投饵，幼体已经处于饥饿状态，会对接下来的变态发 育造成不可逆的伤害，最佳的投饵时机是幼体体内卵黄物质刚好消耗完毕，开始开口摄食。 在目前的蟹类育苗生产中，在何时开始投饵一直靠经验来判断，不同甲壳动物的初孵幼体 所携带的卵黄物质并不相同，因此，不同的甲壳动物幼体的最适宜投饵时机均不相同。即使 是同一物种，由于亲本营养情况不同，水温水质等环境因素的差异，均会影响最适投饵时 机。由此可见，目前靠人为经验判断最适投饵时机不仅准确率低，而且无法量化，阻碍了育 苗技术的标准化推广，因此目前亟需一种能快速有效确定幼体体内卵黄物质含量的检测手 段来突破此瓶颈。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量 的金标试纸。
[0005] 本发明的再一的目的是，提供如上所述金标试纸的用途。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0007] -种快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量的金标试纸，包括底板、样品垫、金胶垫、硝酸 纤维膜层和吸水纸层，所述底板上依次覆盖样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，所 述金胶垫上含有胶体金与抗卵黄磷蛋白单抗结合形成的金标抗卵黄磷蛋白抗体复合物，所 述硝酸纤维膜层上设有抗卵黄磷蛋白多克隆抗体溶液印制的测试线(T线)及羊抗鼠IgG抗 体溶液印制的质控线(C线）。
[0008] 进一步，所述金标抗卵黄磷蛋白抗体复合物制备方法如下：取胶体金溶液，加入 0.2mol/L K2C03溶液，K2C03加入量为7yL/mL，然后加入透析好的抗卵黄磷蛋白单抗，单抗的 加入量为1 〇y g/mL，过夜稳定后加入终浓度为1 %的BSA混匀。
[0009] 进一步，所述质控线中抗体包被浓度为lmg/mL。
[0010]进一步，所述测试线中抗体包被浓度为lmg/mL。
[0011] 进一步，所述金标试纸对于中华绒螯蟹卵黄磷蛋白的检测限为lug/ml。
[0012] 进一步，所述的金胶垫由玻璃纤维和固定其上的金标抗体组成，所述的样品垫为 吸水性玻璃纤维。
[0013] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0014] 如上任一所述金标试纸在快速检测蟹类水产品卵黄磷蛋白含量中的应用。
[0015] 本发明基于胶体金抗体竞争性结合原理来判别样品中是否含有卵黄磷蛋白。所述 抗体为通过蟹雌性亲本卵巢中纯化卵黄磷蛋白为抗原制备的鼠单克隆抗体，所述胶体金抗 体的载体为硝酸纤维素膜，所述载体上的质控区和测试区分别包被兔抗鼠IgG。将待检测的 幼体匀浆后滴于试纸上，如其体内卵黄磷蛋白尚未消耗完毕，测在测试线C和质控线T处均 出现红色条带，如果其体内卵黄磷蛋白已经消耗完毕，则在测试线处无条带，仅质控线处有 条带。
[0016] 本发明优点在于：
[0017] 1、本发明的金标试纸使用简便，检测快速，灵敏度高，较目测及经验推断卵黄物质 消耗情况可靠度和工作效率均得到了极大地提高。
[0018] 2、不同的甲壳动物幼体的最适宜投饵时机均不相同，即使是同一物种，由于亲本 营养情况不同，水温水质等环境因素的差异，均会影响最适投饵时机;本发明的金标试纸检 测用于快速检测蟹类水产品卵黄磷蛋白含量，结果判断直观可靠，用于蟹类育苗技术的标 准化测试，提高蟹类人工育苗的成功率，为经济蟹类养殖产业可持续发展的基础。
【附图说明】
[0019] 附图1为兔多抗wb检测结果。
[0020] 附图2为兔多抗elisa检测结果。
[0021] 附图3为本发明的金标试纸实际使用检测结果。
[0022] 附图4为本发明的金标试纸结构示意图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
[0024]实施例1金标试纸的制备及检测
[0025] 1卵黄磷蛋白提取
[0026]取2.0g中华绒螯蟹的成熟卵巢，加入5ml预冷的匀浆缓冲液冰浴匀浆，然后将匀浆 液在4°C下离心（离心力=12000\8)30分钟，取紫色上清液2-31111，并加入等体积的饱和硫 酸铵溶液，冰浴后在4°C下离心（离心力=12000 X g)30分钟，弃上清液，向离心管中加入2ml 的PBS缓冲液溶解沉淀，然后重复三次，最后将沉淀物溶解于lml的PBS缓冲液中，待凝胶过 滤层析。采用伯乐全自动蛋白质和多肽的纯化仪（型号:BioLogic DouFlowTM，美国伯乐公 司生产)对卵巢提取物进行分离纯化。其中凝胶柱体积为120ml(直径X高度= 2crnX4〇Cm， 上海厦美生物科技发展有限公司生产），装入30ml凝胶（型号Sephaeryl S-300瑞典 Pharmacia公司生产），纯化前首先采用PBS溶液平衡凝胶柱，流速3mL/min，平衡3小时。用注 射器上样lml Vn提取液(蛋白浓度约为lmg/ml)，流速为0.6ml，在280nm和470nm条件下检测 洗脱液的吸光度(0D)，当出现蛋白组分时每lmL收集一次。洗脱液于-70°C保存备用。
[0027] 2蛋白纯化
[0028] 丙烯酰胺单体贮液：14.55g丙烯酰胺加上0.45g N，N'_甲叉双丙烯酰胺，先用40mL 双蒸水搅拌溶解，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀至50mL，过滤。用棕色瓶4°C保存备用。
[0029] 浓缩胶缓冲液贮液(0.5mol/L !>丨8-?：14116.8):3.0381>18溶解在4〇11^双蒸水 中，用4mol/L盐酸调pH6.8。再用双蒸水稀至50mL。保存在4°C备用。
[0030] 分离胶缓冲液贮液（1 ? 5mol/L Tris-HCl，pH8 ? 9): 18 ? 16gTris溶解在80mL双蒸水 中，用4mol/L盐酸调pH8.9。再用双蒸水稀至100mL，保存在4°C备用。
[0031] 10% (AP)过硫酸铵:0. lg过硫酸铵溶入1 .OmL双蒸水，使用前新鲜配制。
[0032] 电极缓冲液（0.025mol/L Tris，0.2mol/L甘氨酸，pH8.3):15.14gTrisWl72.07g 甘氨酸，用双蒸水稀释到5L。可在室温保存一个月。
[0033] 样品缓冲液(0.1111〇1/11>18-11(：14册.8):21111浓缩胶缓冲液贮液加上11^87%甘 油、O.lmg溴酚蓝，用双蒸水稀释至10mL，可在-20°C保存6个月。
[0034] 分离胶配方:双蒸水:6? 6ml、30%丙稀酰胺溶液:8.0ml、1 ? 5mol/L Tris(pH8? 8): 5.0ml、10%AP(W/V):200ul、TEMED:15ul。
[0035] 浓缩胶配方：双蒸水：6.81111、30%丙稀酰胺溶液：1.71111、1111〇1/1^148(口册.8): 1.251111、10%过硫酸铵(￥/^) :10〇111、丁￡]\^0:1〇111。
[0036] 将玻璃板、胶垫、梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制分 离胶（12 % )和浓缩胶(5 % )。过硫酸铵和TEMED最后加入，加入后聚合即开始，立即混匀倒入 两块玻璃板之间。分离胶倒入两块玻璃板间，留下适合的高度，使点样孔前端离分离胶有 2.5cm左右的距离，在胶顶部缓缓加入约0.5cm高的双蒸水，待分离胶聚合完全后，倾去上层 的双蒸水，用双蒸水清洗凝胶顶层，用吸水纸吸去残余的水滴。将浓缩胶倒入玻璃板夹层， 插上梳子，待浓缩胶聚合完全后，拔去梳子，立即用双蒸水清洗点样孔，加入电极缓冲液。 [0037]将中华绒螯蟹卵黄磷蛋白洗脱液经PBS稀释为浓度20ug/ul后与上样缓冲液4:1混 合，用微量进样器点入点样孔底部，200伏电泳。当溴酚蓝到达分离胶时，电压改为250伏，继 续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。将凝胶剥下，浸泡在l〇〇ml的底物液中，染色1小时，待胶带 显色后立即照相。然后将凝胶进行染色。中华绒螯蟹卵黄磷蛋白由两个亚基构成，对条带进 行割胶回收蛋白。
[0038] 3多克隆抗体的制备
[0039] 将回收蛋白溶液与等体积的弗氏佐剂、Y0UL0NG佐剂混合乳化均匀，成油包水状 态，以备免疫兔子。免疫策略：免疫2只新西兰大白兔，皮下免疫3次，间隔一个月，最后经 ELI SA检测，抗血清滴度> 1: 50000。取血:耳缘静脉加强免疫，加强免疫半个月后采集兔血 (全部采集）。多克隆抗体纯化:兔血离心15min(4000rpm，室温），取上层血清，在4°C搅拌下 逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min( 13000rpm，4°C )，弃上清； 沉淀溶于适量PBS (0.01M，pH7.4);在4 °C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33 %，继续搅拌 30111；[11，离心30111；[11(13000印111，4°0，弃上清；沉淀溶于适量？133(0.01]\14117.4)，4°(^透析过 夜，测定抗体含量，-20°C冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein A小柱进行纯化，新柱 子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱;抗体过柱，过程中 要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上;继续10ml0.4M PB缓冲液(pH 7.0) 平衡纯化小柱;5ml 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 3.0)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。
[0040] 4单克隆抗体的制备
[0041]将表达纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，以备免疫 小鼠。免疫策略:将蛋白免疫4只小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经ELISA检测，抗血清滴 度>1:32000。细胞融合:最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫，三天后进行细 胞融合。将小鼠断颈处死，70%乙醇浸泡30min消毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过 80目筛网，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合。融合筛 选:将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，三天后换液，改用HT培养液培养。 10天后，取细胞培养上清进行检测。克隆化与建株:使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化， 10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，可建立阳 性细胞株，共获取阳性细胞株27株。扩大培养:将建株的单克隆细胞扩大培养，并进行冻存。 [0042]腹水制备:提前一周在小鼠腹腔注射矿物油，将一定数量的细胞注射入小鼠腹腔， 10天左右收集腹水，4000rpm离心，得上清即为单克隆抗体腹水。单克隆抗体纯化:腹水离心 15min(4000rpm，室温），取上清，在4°C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌 30min，离心30min( 13000rpm，4°C)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0 ? 01M，pH7 ? 4);在4°C搅拌下 逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33 %，继续搅拌30min，离心30min( 13000rpm，4°C )，弃上清;沉 淀溶于适量roS(0.01M，pH7.4)，4°C透析过夜，测定抗体含量，_20°C冻存备用。硫酸铵沉淀 后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4M PB缓冲液 (pH 7.0)平衡纯化小柱;抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合 位点上;继续l〇ml 0.4M TO缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱;5ml 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液 (pH2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入lMTriS-HCl(pH8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适 合抗体保存的中性。
[0043] 5多克隆抗体效价测定
[0044]采用样品直接包被法ELISA检验兔多克隆抗体的效价。首先将纯化的Vn(卵黄磷蛋 白）用包被缓冲液溶解成lμg/ml，然后用100yl/孔进行包被;将纯化后的Vn抗血清按1:200、 1:1000、1:5000、1:10000、1:20000、1:60000、1:240000用 1 % 的BSA 进行稀释，每孔加样 100y 1，最后在酶标仪测定0D450读数。采用棋盘滴定法确定抗体和抗原的最适工作浓度（图1-2)，抗原711包被液的浓度梯度为8.05、16.09、32.19、64.38、128.75、257.5、515和10301^/ ml，每个浓度横向加样9个孔，同时设置一列作为阴性对照，添加不含Vn的包被缓冲液;Vn抗 体稀释倍数分为 1:1000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、抗体稀释 1 ? 6-6 ? 4万 倍数时，OD450读数仅相差0.19。当抗体稀释64000倍时，0D450读数仍然高达1.54，这说明该 抗体具体较高的效价，在稀释2万倍以上仍然可用于中华绒螯蟹Vn含量的ELISA测定。
[0045] 6抗体配对筛选
[0046] 将27株纯化后的鼠单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲液(包被液，下同）按照1:100倍稀 释，100yL/孔，4°C过夜。洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为lmin，10 %小牛血 清封闭（用PH9.6的碳酸盐缓冲液按照1:9倍稀释），每孔150此，恒温37°C封闭3小时。加入浓 度梯度为1000、100、10、(^祕勺％蛋白溶液，100此/孔，25°(：，温育451^11。用稀释液按1 :1000 比例稀释酶标抗体，充分混匀，每孔l〇〇yl，25°C，温育45min。洗液清洗包被板3次，每次洗液 用量300yL，时间为 lmin，每孔加TMB 100yL，25 °C 反应 15min。加入2M H2SO4，100此/孔，450nm 读取0D(吸光度)值。27株单抗中，大部分单抗与兔多抗配对效果很好，灵敏度可以达到lppb 以上。
[0047] 7金标抗体复合物的制备
[0048] (1)胶体金溶液的配置:取0.01 %氯金酸水溶液100ml加热至沸腾，边搅拌边加入 1 %柠檬酸三钠水溶液1.8ml，继续煮沸10min至溶液呈鲜红色后冷却。冷却后装入透析袋中 对超纯水（1:5000)透析三次，最后将透析好的胶体金转移到干净的带旋盖的玻璃瓶中，在4 °C避光的环境下保存。
[0049] (2)金标抗体的配置
[0050]标记pH的确定:取6个1.5mL的离心管，对其进行1-6编号，并在每个离心管中准确 加入1.〇11114交体金溶液。然后每个管中分别加入0此、1此、3此、5此、7此、9此的0.2111〇1/1 K2CO3，摇勾后，分别在每个管中加入15iig单抗，摇勾后静置40min，最后每管分别加入lOOyL 10 %NaCl，静置观察每管内胶体金外观变化，若颜色发生明显变蓝，产生沉淀的管中为不合 适的pH，而颜色变化不明显的为合适的pH。胶体金溶液离心10min，取上清测定520nm的0D 值，5号管的吸光度最高，说明0.2mol/L K2C03加入量为7yL/mL时为最适加入量。
[00511最佳标记浓度的确定:取7个1.5mL的离心管，对其进行1~9编号，并在每个离心管 中准确加入1. OmL胶体金溶液。然后每个管中分别加入7. OyL的0.2mo 1 /L K2C03，摇匀后分别 在每个管中加入0辟、2邱、4辟、6邱、8邱、10辟、12辟、14辟、16邱单抗，摇勾后静置40111；[11，最 后加入100此的10%的NaCl溶液在每个管中，静置察看各组管内胶体金外观的改变。若颜色 发生明显变化变蓝，产生沉淀的管中为不合适的抗体加入量，而颜色依然能保持红色变化 不明显的为合适的抗体加入量，而最先不变色的为最小标记量。胶体金溶液离心l0min，取 上清测定520nm的0D值，1 -5号管出现颜色变化，而6号管的吸光度最高，说明胶体金溶液中 抗体加入量为1 0yg/mL时为最适抗体加入量。
[0052] 金标抗体的配置:取1L胶体金溶液，加入0.2mol/L K2C03溶液，K2C03溶液的加入量 为7yL/mL。然后加入透析好的抗卵黄磷蛋白单抗，单抗的加入量为10yg/mL，过夜稳定后加 入终浓度为1 %的BSA混匀。
[0053] (3)胶体金蛋白的纯化：将制备好的胶体金标记抗体复合物在900印111/1]1；[11离心 15min，仔细吸出上清，沉淀用含5%的蔗糖和0.05%TWeen-20的0.002M硼酸盐缓冲溶液复 溶。离心洗涤两次，最后将复合物浓缩至原体积的1/10,于4°C保存备用。
[0054] 8胶体金试纸条的制备
[0055] 请参照图4,图4是测定卵黄磷蛋白含量金标试纸的结构示意图。图4中涉及的标记 如下：1.底板，2.样品垫，3.金胶垫，4.硝酸纤维膜层，5.吸水纸层。该试纸设有地底板1，底 板上依次覆盖样品垫2、金胶垫3、硝酸纤维膜层4和吸水纸层5。所述底板1是PVC底板，样品 垫2的材料是玻璃纤维。金胶垫的制作:将上述步骤7制备得到的金标单抗体用点金标膜机 均匀的喷在处理过的金标垫上，点样量为2yL/cm，于37°C烘干24小时，备用。划膜:选取PALL 的NC膜170用点金标(膜)机将浓度为1. Omg/mL的兔多抗划以0.7yL/cm划测试线(T线）；将浓 度为1 .Omg/mL的羊抗鼠二抗以0.7yL/cm划质控线(C线），于37°C烘干24小时，备用。
[0056] 9实际使用
[0057]纯化卵黄磷蛋白测试，将纯化好的中华绒螯蟹卵黄磷蛋白配置为0.5、l、10、20iig/ mL的溶液，放入1.5ml离心管中，并设无卵黄磷蛋白的溶液作为空白对照，将试纸条条按照 箭头插离心管中，在10分钟后读取结果，检测限为lug/ml(图3)。
[0058]中华绒螯蟹蚤状幼体卵黄磷蛋白快速检测方法，收集中华绒螯蟹蚤状幼体80-100 只左右，放入1.5ml离心管中，加入lml匀浆缓冲液（1M Tris HC1 10ml，NaCl 2.925g， EDTA0.0 5g，100mM PMSF 0.5ml，加蒸馏水定容至500ml)，用研磨棒在离心管中研磨5分钟， 静止15分钟，随后12000转离心5分钟，取上清液。将试纸条插入上清液，10分钟后读取结果， 如出现两条线，则表明蚤状幼体中尚含有未消化完的卵黄磷蛋白。
[0059]实施例2T线和C线最佳包被的筛选
[0060]制作NC膜检测层时，检测线和质控线的抗体包被浓度直接影响试纸条的显色效 果。如质控线抗体包被浓度过高，C线颜色过深，浓度过低显色不清晰，起不到质控线作用； 检测线的抗体包被浓度过高不仅影响质控线的显色效果，而且容易出现假阳性，浪费抗体； 浓度过低T线显色过浅，影响结果的判读。本发明对质控线和检测线的抗体包被浓度进行筛 选，实验方法与实施例1相同，在NC膜上的T线及C线上分别包被0.1、0.5、1、2mg/mL抗体，形 成16个不同的组合，组装成试纸条，选用中华绒螯蟹卵黄磷蛋白浓度为20iig/mL进行测试， 观察质控线和检测线的显色，确定包被抗体的最适浓度。不同浓度的抗体包被NC膜检测层 的结果如表1所示，当检测线包被抗体浓度为0. lmg/mL时，检测线颜色较浅，肉眼刚能分辨； 当检测线包被抗体浓度为0.5mg/mL时，检测线有显色但相比质控线显色效果较弱；当检测 线包被抗体浓度为lmg/mL时，检测线和质控线颜色均清晰明显；当检测线包被空提浓度为 3mg/mL时，由于检测线浓度偏高截留较多的金标抗体而使质控线显色减弱。从试纸成本和 检测显色结果两方面考虑，最终选择控线和检测线的抗体包被浓度分别为lmg/mL和lmg/mL 为最适浓度。
[0061]表1 T线和C线最佳包被的浓度组合
[0063] 注:检测线、质控线:+++强阳性信号;+++阳性信号;+弱阳性型号;-无阳性信号。
[0064] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量的金标试纸，包括底板、样品垫、金胶垫、硝酸纤 维膜层和吸水纸层，所述底板上依次覆盖样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，其特 征在于，所述金胶垫上含有胶体金与抗卵黄磷蛋白单抗结合形成的金标抗卵黄磷蛋白抗体 复合物，所述硝酸纤维膜层上设有抗卵黄磷蛋白多克隆抗体溶液印制的测试线(T线)及羊 抗鼠 I gG抗体溶液印制的质控线(C线）。2. 根据权利要求1所述快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量的金标试纸，其特征在于，所述金 标抗卵黄磷蛋白抗体复合物制备方法如下:取胶体金溶液，加入0.2mol/L K2CO3溶液，K2CO3 加入量为7yL/mL，然后加入透析好的抗卵黄磷蛋白单抗，单抗的加入量为10yg/mL，过夜稳 定后加入终浓度为1 %的BSA混匀。3. 根据权利要求1所述快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量的金标试纸，其特征在于，所述质 控线中抗体包被浓度为lmg/mL。4. 根据权利要求1所述快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量的金标试纸，其特征在于，所述测 试线中抗体包被浓度为lmg/mL。5. 根据权利要求1所述快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量的金标试纸，其特征在于，所述金 标试纸对于中华绒螯蟹卵黄磷蛋白的检测限为lug/ml。6. 根据权利要求1所述快速测定蟹类卵黄磷蛋白含量的金标试纸，其特征在于，所述的 金胶垫由玻璃纤维和固定其上的金标抗体组成，所述的样品垫为吸水性玻璃纤维。7. 权利要求1-6任一所述的金标试纸在快速检测蟹类水产品卵黄磷蛋白含量中的应 用。
【文档编号】G01N33/558GK106053799SQ201610629061
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月3日
【发明人】刘智俊, 李燕, 陆锦天, 李住, 张根玉, 史建华
【申请人】上海市水产研究所