抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用

抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用，抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒包括：抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成抗缪勒氏管激素的检测。这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到0.01ng/mL，相对于传统的抗缪勒氏管激素的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
【专利说明】
抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及体外检测领域，尤其涉及一种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂 盒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 缪勒氏管激素(MIS)，也叫做抗缪勒氏管激素(Anti-Miillerian hormone，AMH)，是 由二硫化物桥连接两个72kDa单体组成的140kU的糖蛋白二聚物。MIS/AMH属于转化生长 因子(TGF-P)家族总科。由Profess Alfred Jost于1947年首先发现。AMH由睾丸未成熟的 Sertoli细胞及出生后卵巢生长卵泡的颗粒细胞分泌，具有调节细胞发育及分化，使雄性胚 胎苗勒氏管退化的作用。在男性，最初表达在8周胎儿睾丸支持细胞中，始于胚胎形成，并贯 穿生命始终。在胚胎发育期间，AMH会引起缪勒氏管退化，形成正常的男性生殖管道。对于女 性而言，AMH是在36周胎儿期的卵泡颗粒细胞生成的，直至女性更年期，AMH逐渐下降至无法 检测的水平。
[0003] 在临床上可用于真假两性畸形的诊断，肿瘤的特异性标记，精子形成的标记等。 AMH已应用于主要用于监测卵巢储备力、预测体外受精联合胚胎移植技术(IVF)的卵巢反应 性、预防卵巢过度刺激综合征(0HSS)、男性生殖功能的评估等。在多囊卵巢综合征(PC0S)的 诊断中也以此来代替窦卵泡数(AFC)指标。
[0004] 妇女卵巢功能与年龄、基础卵泡刺激素（FSH)、基础抑制素B(INHB)、基础雌二醇 (E2)、氯米芬激发试验(CCCT)、促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)激发试验、窦卵泡数、 卵巢体积和卵巢血流丰度以及抗苗勒管激素(AMH)水平等多种因素相关。AMH为其中最敏感 的指标。
[0005] 传统的AMH的检测方法主要采用酶联免疫吸附法，然而，受限于酶联免疫的特点， 传统的AMH的检测方法在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染， 并且由于检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复 杂，容易发生操作差错，检测精度较差。

【发明内容】

[0006] 基于此，有必要提供一种检测精度较高的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂 盒及其制备方法和应用。
[0007] -种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，包括:抗缪勒氏管激素单克隆抗 体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0008] 在一个实施例中，所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相 载体为表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒。
[0009] 在一个实施例中，所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒为表面带 有氨基、羧基、甲苯磺酰基或环氧乙烷基的磁微粒。
[0010] 在一个实施例中，所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的粒径为 0.05M1 ~3mid
[0011] 在一个实施例中，所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相 载体上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联 有生物素。
[0012] 在一个实施例中，所述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所 述化学发光标记物为异鲁米诺、三联吡啶钌、吖啶酯、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
[0013] 在一个实施例中，所述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所 述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述抗缪勒氏管激素单克 隆抗体上偶联有生物素。
[0014] 在一个实施例中，所述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所 述化学发光标记物与所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体通过化学反应键直接连接或通过蛋 白交联剂连接。
[0015]在一个实施例中，所述蛋白交联剂选自碳酰二亚胺盐和琥珀酰亚胺中的至少一 种。
[0016] 在一个实施例中，所述蛋白交联剂选自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和磺酸化N-羟基琥珀 酰亚胺中的至少一种。
[0017] 在一个实施例中，还包括抗缪勒氏管激素定标品。
[0018] -种上述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步 骤：
[0019] 将抗缪勒氏管激素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到抗缪勒氏管激素 单克隆抗体包被的固相载体;以及
[0020] 将化学发光标记物和抗缪勒氏管激素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学发光 标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0021] 在一个实施例中，所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相 载体为表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒；
[0022] 所述将抗缪勒氏管激素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到抗缪勒氏管 激素单克隆抗体包被的固相载体的操作为:取表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁 微粒的悬浮液，磁分离去上清后用缓冲液重悬，接着活化剂活化所述表面带有用于蛋白质 化学反应连接基团的磁微粒的表面连接基团，接着加入抗缪勒氏管激素单克隆抗体，室温 下充分反应，磁分离去除上清后重悬，得到抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的表面带有用 于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒。
[0023] 在一个实施例中，所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相 载体上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联 有生物素；
[0024] 所述将抗缪勒氏管激素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到抗缪勒氏管 激素单克隆抗体包被的固相载体的操作为:将偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素的 固相载体和偶联有生物素的抗缪勒氏管激素单克隆抗体在缓冲液中混合，充分反应后得到 抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体。
[0025] 在一个实施例中，所述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所 述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述抗缪勒氏管激素单克 隆抗体上偶联有生物素；
[0026] 所述将化学发光标记物和抗缪勒氏管激素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学 发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体的操作为:将偶联有链霉亲和素、亲和素或 中性亲和素的化学发光标记物和偶联有生物素的抗缪勒氏管激素单克隆抗体在缓冲液中 混合，充分反应后得到化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0027] 在一个实施例中，所述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所 述化学发光标记物与所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体通过化学反应键直接连接；
[0028] 所述将化学发光标记物和抗缪勒氏管激素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学 发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体的操作为:将抗缪勒氏管激素单克隆抗体和 化学发光标记物在缓冲液中混合，充分反应后得到化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素 单克隆抗体。
[0029] 在一个实施例中，所述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所 述化学发光标记物与所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体通过蛋白交联剂连接；
[0030] 所述将化学发光标记物和抗缪勒氏管激素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学 发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体的操作为:将抗缪勒氏管激素单克隆抗体、 化学发光标记物和蛋白交联剂在缓冲液中混合，充分反应后得到化学发光标记物标记的抗 缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0031] -种抗缪勒氏管激素的浓度的检测方法，采用上述抗缪勒氏管激素化学发光免疫 检测试剂盒，所述抗缪勒氏管激素的浓度的检测方法包括如下步骤：
[0032]使用抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪 勒氏管激素单克隆抗体对待测样本进行夹心免疫试验，所述待测样本中的抗缪勒氏管激素 与抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素 单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得待测样本的发光强度；
[0033]使用抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪 勒氏管激素单克隆抗体对抗缪勒氏管激素定标品进行夹心免疫试验，所述抗缪勒氏管激素 定标品中的抗缪勒氏管激素与抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标 记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得抗缪 勒氏管激素定标品的发光强度，根据所述抗缪勒氏管激素定标品的发光强度和所述抗缪勒 氏管激素定标品的浓度构建横纵坐标分别为浓度和发光强度的抗缪勒氏管激素的标准曲 线；以及
[0034]将所述待测样本的发光信号带入所述抗缪勒氏管激素的标准曲线中，计算得到所 述待测样本中的抗缪勒氏管激素的浓度。
[0035]这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析 仪为检测工具，完成抗缪勒氏管激素的检测。这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂 盒，经过实验，其检测灵敏度达到0.0 lng/mL，相对于传统的抗缪勒氏管激素的检测方法灵 敏度至少提高了 10倍，这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
【附图说明】
[0036] 图1为实施例3得到的抗缪勒氏管激素的标准曲线图；
[0037] 图2为实施例7得到的抗缪勒氏管激素的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0038] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实 施例对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于 充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术 人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施 的限制。
[0039] -实施方式的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，包括:抗缪勒氏管激素 单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0040] 抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，抗缪勒氏管激素单克隆抗体可以 为人源、基因工程表达或动物源。
[0041] 化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，抗缪勒氏管激素单克隆抗 体可以为人源、基因工程表达或动物源。
[0042] 抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏 管激素单克隆抗体中，各自使用的抗缪勒氏管激素单克隆抗体可以相同，也可以不相同。
[0043] 在一个实施方式中，抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，固相载体为 表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒、表面可进行蛋白质物理吸附的硅基材料 或经过高分子表面处理的磁微粒。
[0044]固相载体为表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒或经过高分子表面 处理的磁微粒时，优选的，抗缪勒氏管激素单克隆抗体与磁微粒的质量比为1:20~100。 [0045]表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒可以为表面带有氨基、羧基、甲 苯磺酰基或环氧乙烷基的磁微粒。
[0046]表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的粒径优选为0.05M1~3wii。 [0047]以固相载体为表面带有用于羧基的磁微粒为例，抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被 的固相载体的制备过程可以为:取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液 重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗缪勒氏管激素单 克隆抗体，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到抗缪勒氏管激 素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒。其中，MES (2-(N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液的浓度为 0.02M，pH为5.5; Tris缓冲液的浓度为0.1M并且含有2 %BSA，pH为8.0 ;EDC( 1-乙基-3-(3-二 甲基氨丙基)_碳化二亚胺)水溶液的浓度为10mg/mL~20mg/mL，EDC与羧基化的磁微粒的比 例为 0.05:0.1 ~1。
[0048] 在另一个实施方式中，抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，固相载体 上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联有生物素。
[0049] 抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体可以是直接购买的商品化亲和素固 相载体，也可以是通过亲和素化学键和偶联其他固相载体制备的亲和素固相载体。
[0050] 化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，化学发光标记物为异鲁米 诺、三联吡啶钌、吖啶酯、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
[0051] 优选的，抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，抗缪勒氏管激素单克隆抗 体与化学发光标记物的比例为50:1~10。
[0052] 在一个实施例中，化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，化学发 光标记物上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联 有生物素。
[0053] 以化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联有生 物素为例，化学发光标记物为吖啶酯为例，化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆 抗体的制备过程如下:取抗缪勒氏管激素单克隆抗体溶液，加入500yL pH8.0的磷酸盐缓冲 液，加入0. lmg生物素琥珀酰亚胺(Biotin-NHS)混合，室温下避光反应，lh~2h后取出，离心 脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液 体保存，得到生物素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体;取链霉亲和素溶液，加入0.1M~ 0.2M pH9.0~9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，1~2h后 取出，用zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理， 最后加入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素;将生物素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体和 吖啶酯标记的链霉亲和素混合，得到吖啶酯标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0054] 在另一实施例中，化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，化学发 光标记物与抗缪勒氏管激素单克隆抗体通过化学反应键直接连接或通过蛋白交联剂连接。
[0055] 蛋白交联剂可以为碳酰二亚胺盐和琥珀酰亚胺中的至少一种。
[0056] 优选的，蛋白交联剂选自1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、1-乙基_(3_二 甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和磺酸化N-羟基琥珀酰亚胺中的至 少一种。
[0057]以化学发光标记物为吖啶酯为例，化学发光标记物与抗缪勒氏管激素单克隆抗体 通过化学反应键直接连接制得化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体的过程 如下:取抗缪勒氏管激素单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温 下避光反应，lh~2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓 冲液进行处理，得到吖啶酯标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0058]以化学发光标记物为碱性磷酸酶，蛋白交联剂为1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳 酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺为例，化学发光标记物与抗缪勒氏管激素单克隆抗体 通过蛋白交联剂连接制得化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体的过程如下： 取lmg抗缪勒氏管激素单克隆抗体溶液、lmg碱性磷酸酶，加入500此pH5.5的2-(N-吗啡啉） 乙磺酸(MES)缓冲液，加入lmgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和lmg N-羟 基琥珀酰亚胺混合，室温下避光反应，lh~2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首 先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保存，得到碱性磷酸酶标记的 抗缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0059]在其他的实施例中，上述抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发 光底物液。
[0060] 化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2〇2溶液，B液可以为NaOH溶液。
[0061 ] 本实施例中，A液为浓度为0. lmol/L的H2〇2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶 液。
[0062] 在其他的实施例中，上述抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒还包括抗缪勒 氏管激素定标品。
[0063] 抗缪勒氏管激素定标品的制备过程如下:采用定标品缓冲液将抗缪勒氏管激素配 制成浓度分别为〇~30ng/mL的抗缪勒氏管激素的溶液。
[0064]具体的，抗缪勒氏管激素定标品为浓度分别为0ng/mL、0 ? 7ng/mL、2 ? 5ng/mL、 4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL和28 ? 56ng/mL的抗缪勒氏管激素的溶液。
[0065] 这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析 仪为检测工具，完成抗缪勒氏管激素的检测。这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂 盒，经过实验，其检测灵敏度达到0.0 lng/mL，相对于传统的抗缪勒氏管激素的检测方法灵 敏度至少提高了 10倍，这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
[0066] 这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒使用时先利用全自动化学发光免 疫分析仪对抗缪勒氏管激素定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件，测试实际样 本，根据样本发光值计算样本浓度，最后对抗缪勒氏管激素全自动化学发光免疫分析系统 进行性能(灵敏度、线性、精密度、干扰性)的评价。
[0067]这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，具有以下优点：
[0068] 1、选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直 接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；
[0069] 2、选用的吖啶酯或碱性磷酸酶化学发光免疫分析系统检测灵敏度高，能够达到 0.0 lng/mL，相比其它的检测方法灵敏度至少提高了 10倍；
[0070] 3、选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到25ng/mL以上；
[0071] 4、吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它 化学发光免疫分析系统难以达到的；
[0072] 5、化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只 需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
[0073] 6、化学发光免疫分析系统可以实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成， 操作更加简便，减少了人为的误差。
[0074]综上所述，这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒检测成本低、灵敏度高、 检测线性范围广、重现性高、可以定量、操作简单。
[0075]此外，使用这种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，通过测定特定人群的 AMH浓度水平或分布，受试者AMH浓度与之比较，若偏离标定人群的AMH浓度水平，则提示受 试者为非健康或功能弱。也可以对同一受试者，进行连续AMH水平监测，以评估生殖相关功 能。可用于辅助诊断或预测疾病，监控及预测健康状态:诊断颗粒细胞瘤、诊断性发育异常、 诊断多囊卵巢综合征、监测卵巢储备力、预测体外受精联合胚胎移植技术(IVF)的卵巢反应 性、预防卵巢过度刺激综合征(0HSS)、评估男性生殖功能等。
[0076] 本发明还公开了一种上述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的制备方 法，包括如下步骤：
[0077] S110、将抗缪勒氏管激素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到抗缪勒氏 管激素单克隆抗体包被的固相载体。
[0078] 抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，抗缪勒氏管激素单克隆抗体可以 为人源、基因工程表达或动物源。
[0079] 在一个实施方式中，抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，固相载体为 表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒、表面可进行蛋白质物理吸附的硅基材料 或经过高分子表面处理的磁微粒。
[0080] 固相载体为表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒或经过高分子表面 处理的磁微粒时，优选的，抗缪勒氏管激素单克隆抗体与磁微粒的质量比为1:20~100。
[0081] 表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒可以为表面带有氨基、羧基、甲 苯磺酰基或环氧乙烷基的磁微粒。
[0082]表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的粒径优选为0.05WI1~3WI1。
[0083] 当抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，固相载体为表面带有用于蛋白 质化学反应连接基团的磁微粒时，S110为:取表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁 微粒的悬浮液，磁分离去上清后用缓冲液重悬，接着活化剂活化表面带有用于蛋白质化学 反应连接基团的磁微粒的表面连接基团，接着加入抗缪勒氏管激素单克隆抗体，室温下充 分反应，磁分离去除上清后重悬，得到抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的表面带有用于蛋 白质化学反应连接基团的磁微粒。
[0084] 以固相载体为表面带有用于羧基的磁微粒为例，抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被 的固相载体的制备过程可以为:取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液 重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗缪勒氏管激素单 克隆抗体，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到抗缪勒氏管激 素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒。其中，MES (2-(N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液的浓度为 0.02M，pH为5.5; Tris缓冲液的浓度为0.1M并且含有2 %BSA，pH为8.0 ;EDC( 1-乙基-3-(3-二 甲基氨丙基)_碳化二亚胺)水溶液的浓度为10mg/mL~20mg/mL，EDC与羧基化的磁微粒的比 例为 0.05:0.1 ~1。
[0085] 在另一个实施方式中，抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，固相载体 上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联有生物素。
[0086] 抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体可以是直接购买的商品化亲和素固 相载体，也可以是通过亲和素化学键和偶联其他固相载体制备的亲和素固相载体。
[0087] 抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，固相载体上偶联有链霉亲和素、 亲和素或中性亲和素，抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联有生物素时，S110为:将偶联有链 霉亲和素、亲和素或中性亲和素的固相载体和偶联有生物素的抗缪勒氏管激素单克隆抗体 在缓冲液中混合，充分反应后得到抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体。
[0088] S120、将化学发光标记物和抗缪勒氏管激素单克隆抗体混合并充分反应，得到化 学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0089] S110和S120的次序可以替换，不影响本方法。
[0090] 化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，抗缪勒氏管激素单克隆抗 体可以为人源、基因工程表达或动物源。
[0091] 抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏 管激素单克隆抗体中，各自使用的抗缪勒氏管激素单克隆抗体可以相同，也可以不相同。
[0092]化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，化学发光标记物为异鲁米 诺、三联吡啶钌、吖啶酯、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
[0093]优选的，抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，抗缪勒氏管激素单克隆抗 体与化学发光标记物的比例为50:1~10。
[0094] 在一个实施例中，化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，化学发 光标记物上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联 有生物素。
[0095] 化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，化学发光标记物上偶联有 链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联有生物素时，S120 为:将偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素的化学发光标记物和偶联有生物素的抗缪 勒氏管激素单克隆抗体在缓冲液中混合，充分反应后得到化学发光标记物标记的抗缪勒氏 管激素单克隆抗体。
[0096] 具体的，以化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，抗缪勒氏管激素单克隆抗体上 偶联有生物素为例，化学发光标记物为吖啶酯为例，化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激 素单克隆抗体的制备过程如下:取抗缪勒氏管激素单克隆抗体溶液，加入500yL pH8.0的磷 酸盐缓冲液，加入O.lmg生物素琥珀酰亚胺(Biotin-NHS)混合，室温下避光反应，lh~2h后 取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱 盐管中的液体保存，得到生物素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体;取链霉亲和素溶液，加 入0.1M~0.2M pH 9.0~9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反 应，1~2h后取出，用zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液 进行处理，最后加入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素;将生物素标记的抗缪勒氏管激素单 克隆抗体和吖啶酯标记的链霉亲和素混合，得到吖啶酯标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗 体。
[0097] 在另一实施例中，化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，化学发 光标记物与抗缪勒氏管激素单克隆抗体通过化学反应键直接连接或通过蛋白交联剂连接。 [0098]蛋白交联剂可以为碳酰二亚胺盐和琥珀酰亚胺中的至少一种。
[0099] 优选的，蛋白交联剂选自1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、1-乙基_(3_二 甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和磺酸化N-羟基琥珀酰亚胺中的至 少一种。
[0100] 化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，化学发光标记物与抗缪勒 氏管激素单克隆抗体通过化学反应键直接连接时，S120为:将抗缪勒氏管激素单克隆抗体 和化学发光标记物在缓冲液中混合，充分反应后得到化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激 素单克隆抗体。
[0101] 具体的，以化学发光标记物为吖啶酯为例，化学发光标记物与抗缪勒氏管激素单 克隆抗体通过化学反应键直接连接制得化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗 体的过程如下：取抗缪勒氏管激素单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯 混匀，室温下避光反应，lh~2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净 水及TBS缓冲液进行处理，得到吖啶酯标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0102] 化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，化学发光标记物与抗缪勒 氏管激素单克隆抗体通过蛋白交联剂连接时，S120为:将抗缪勒氏管激素单克隆抗体、化学 发光标记物和蛋白交联剂在缓冲液中混合，充分反应后得到化学发光标记物标记的抗缪勒 氏管激素单克隆抗体。
[0103] 具体的，以化学发光标记物为碱性磷酸酶，蛋白交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺为例，化学发光标记物与抗缪勒氏管激素单 克隆抗体通过蛋白交联剂连接制得化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体的 过程如下：取lmg抗缪勒氏管激素单克隆抗体溶液、lmg碱性磷酸酶，加入500此pH5.5的2-(N-吗啡啉）乙磺酸( MES)缓冲液，加入lmgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 和lmg N-羟基琥珀酰亚胺混合，室温下避光反应，lh~2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱 盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保存，得到碱性磷 酸酶标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。
[0104]在其他的实施例中，抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底 物液。
[0105] 化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2〇2溶液，B液可以为NaOH溶液。
[0106] 本实施例中，A液为浓度为0. lmol/L的H2〇2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶 液。
[0107]在其他的实施例中，抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒还包括抗缪勒氏管 激素定标品。
[0108]抗缪勒氏管激素定标品的制备过程如下:采用定标品缓冲液将抗缪勒氏管激素配 制成浓度分别为〇~30ng/mL的抗缪勒氏管激素的溶液。
[0109]具体的，抗缪勒氏管激素定标品为浓度分别为0ng/mL、0.7ng/mL、2.5ng/mL、 4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL和28 ? 56ng/mL的抗缪勒氏管激素的溶液。
[0110]本发明还公开了用上述抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的抗缪勒氏管 激素的浓度的检测方法，包括如下步骤：
[0111] S210、使用抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的 抗缪勒氏管激素单克隆抗体对待测样本进行夹心免疫试验，待测样本中的抗缪勒氏管激素 与抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素 单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得待测样本的发光信号。
[0112] S220、使用抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的 抗缪勒氏管激素单克隆抗体对抗缪勒氏管激素定标品进行夹心免疫试验，抗缪勒氏管激素 定标品中的抗缪勒氏管激素与抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标 记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得抗缪 勒氏管激素定标品的发光强度，根据抗缪勒氏管激素定标品的发光强度和抗缪勒氏管激素 定标品的浓度构建横纵坐标分别为浓度和发光强度的抗缪勒氏管激素的标准曲线。
[0113] S210和S220的次序可以替换，不影响本方法。
[0114] 抗缪勒氏管激素定标品的制备过程如下:采用定标品缓冲液将抗缪勒氏管激素配 制成浓度分别为〇~30ng/mL的抗缪勒氏管激素的溶液。
[0115]具体的，抗缪勒氏管激素定标品为浓度分别为0ng/mL、0 ? 7ng/mL、2 ? 5ng/mL、 4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL和28 ? 56ng/mL的抗缪勒氏管激素的溶液。
[0116] S230、将S210得到的待测样本的发光信号带入S220得到的抗缪勒氏管激素的标准 曲线中，计算得到待测样本中的抗缪勒氏管激素的浓度。
[0117] 以下为具体实施例。
[0118]实施例1:抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的制备
[0119] (1 )AMH单克隆抗体包被的磁颗粒的制备：
[0120] 取50mg粒径为0.05iim~3ym的羧基化的磁微粒(MagnaBindTM，货号21353)悬浮液， 磁分离去上清，用0 ? 02M，pH为5 ? 5的MES缓冲液重悬，加入0 ? 5mL~2mL新配置的10mg/mL的 EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入lmg~3mg的AMH单克隆抗体(Anshlabs，AA011)，室温下 混悬2h~10h，磁分离，去除上清，用含2 %BSA的0.1M pH为8.0的Tris缓冲液重悬到lmg/mL， 得到AMH单克隆抗体包被的磁颗粒，每瓶5mL分装保存于4°C备用。
[0121 ] (2)吖啶酯标记的AMH单克隆抗体的制备：
[0122]取 500yL 1.0mg/mL 的 AMH 单克隆标记抗体（Anshlabs，AA012)溶液，加入 500yL 0.1-0.211?119.0-9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入10~20此511^/1^的吖啶酯混匀，室 温下避光反应，1~2h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯 净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的吖啶酯标记的AMH单克隆抗体溶液，收集离心 管中的液体至保存管得到吖啶酯标记的AMH单克隆抗体，每瓶lmL分装保存于4°C备用。 [0 123] (3)AMH定标品的制备：
[0124] 用标准品缓冲液(40mM Tris-HCl，0.5%BSA，l%NaCl，pH 8.0)将人源化AMH蛋白 配置成浓度为〇ng/mL、0 ? 7ng/mL、2 ? 5ng/mL、4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL、28 ? 56ng/mL，每瓶 0.5mL分装，经冻干处理后，4 °C保存备用。
[0125] 实施例2: AMH吖啶酯化学发光免疫检测方法
[0126] 本发明以全自动化学发光免疫分析仪和实施例1制得的抗缪勒氏管激素化学发光 免疫检测试剂盒为检测工具，本发明的方法学模式为夹心法，即仪器依次加入50此的样品、 50yL的AMH单克隆抗体包被的磁颗粒以及50yL的吖啶酯标记的AMH单克隆抗体，反应lOmin 后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入发光底物A液(含0.1M HN03和0.5 % H2〇2)及B液(含0.25M NaOH)进行发光反应，最后记录发光强度，从标准曲线计算出被测样品 的AMH含量。
[0127] 实施例3:实施例1制得的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒性能评价
[0128] 采用实施例2中的方法对抗缪勒氏管激素定标品进行检测，得到绘制标准曲线如 图1所示。
[0129] 灵敏度的检测：
[0130] 参照CLSI EP17-A文件推荐实验方案，计算AMH化学发光免疫试剂盒的灵敏度，求 得的灵敏度为〇. 〇〇6ng/mL。
[0131] 线性的检测：
[0132] 对浓度为0.01ng/mL、0 ? 5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、25ng/mL 标准品做线性分析，计 算线性相关系数，r = 0.9991，另外，该试剂盒对AMH样品检测的线性范围为0.01-25ng/mL。
[0133] 精密度测定：
[0134] 取浓度为0.1 ng/mL及10ng/mL两个AMH样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三 批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于 5%〇
[0135] 干扰性实验：
[0136] 取混合血清分别添加干扰物包括:结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、 甘油酯，添加质量比按照1:20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的 测值，计算二者之间的偏差，以±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到NCCLS的文件 标准，可用于临床实验室AMH状况的准确评估。
[0137] 实施例4、抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的对比实验
[0138] 分别用实施例2中的化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为0、 50pg/mL的AMH样品做检测，对零浓度样本进行20次重复测试，计算零浓度样本的均值(M)和 SD，将M+2SD的RLU值带入定标方程中，求出对应的浓度值，即为检测灵敏度。两种方法检测 灵敏度相比，数据如下表所示：
[0140] 由上表可以看出，化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了约50倍。
[0141] 实施例5:抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的制备
[0142] (1 )AMH单克隆抗体包被的磁颗粒的制备：
[0143] 取50mg粒径为0.05mi~2wii的甲苯磺酰基化的磁微粒(Dynal，301100)悬浮液，磁 分离去上清，用PH9.0~11.0的硼酸盐缓冲液重悬，加入lmg~3mg的AMH单克隆抗体 (Anshlabs，AA011)，加入0.5mL~2mL饱和硫酸铵溶液，37°C下旋转混合反应20h~30h，磁分 离，去除上清，用含2%BSA的0.1M pH为8.0的Tris缓冲液重悬到lmg/mL，得到AMH单克隆抗 体包被的磁颗粒，每瓶5mL分装保存于4°C备用。
[0144] (2)碱性磷酸酶标记的AMH单克隆抗体的制备：
[0145] 取500yL 2.0mg/mL的AMH单克隆标记抗体(Anshlabs，AA012)，加入500yL pH5.0的 MES酸性缓冲液，加入lmg碱性磷酸酶混匀，然后加入lmg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰 二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)交联剂或加入lmg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸 盐(EDC.HCL)及lmg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合交联剂，室温下避光反应，lh~2h后取出， 离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中 的液体保存。将脱盐液上AKTA蛋白纯化系统进行纯化，收集得到碱性磷酸酶标记的AMH单克 隆抗体，每瓶lmL分装保存于4°C备用。
[0146] (3)AMH定标品的制备：
[0147] 用标准品缓冲液(40mM Tris-HCl，0.5%BSA，l%NaCl，pH 8.0)将人源化AMH蛋白 配置成浓度为〇ng/mL、0 ? 7ng/mL、2 ? 5ng/mL、4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL、28 ? 56ng/mL，每瓶 0.5mL分装，经冻干处理后，4 °C保存备用。
[0148] 实施例6: AMH碱性磷酸酶化学发光免疫检测方法
[0149] 本发明以全自动化学发光免疫分析仪和实施例5制得的抗缪勒氏管激素化学发光 免疫检测试剂盒为检测工具，本发明的方法学模式为夹心法，即仪器依次加入20此的样品、 50yL的AMH单克隆抗体包被的磁颗粒以及50yL的碱性磷酸酶标记的AMH抗体，反应lOmin后， 进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，加入AMPH)发光底物进行发光反应，最后记录发 光强度，从标准曲线计算出被测样品的AMH含量。
[0150]实施例7:实施例5制得的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒性能评价
[0151] 采用实施例6中的方法对抗缪勒氏管激素定标品进行检测，得到绘制标准曲线如 图2所示。
[0152] 灵敏度的检测：
[0153] 参照CLSI EP17-A文件推荐实验方案，计算AMH化学发光免疫试剂盒的灵敏度，求 得的灵敏度为〇.〇6ng/mL。
[0154]实施例8:抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的制备
[0155] (1 )AMH单克隆抗体包被的磁颗粒的制备。
[0156] 与实施例5中（1)一致。
[0157] (2)生物素标记AMH单克隆抗体的制备：
[0158] 取500yL 2.0mg/mL的AMH单克隆标记抗体，加入500yL pH8.0的磷酸盐缓冲液，加 入O.lmg生物素琥珀酰亚胺(Biotin-NHS)混合，室温下避光反应，1-2h后取出，离心脱盐柱 脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保 存。得到生物素标记的AMH单克隆抗体，每瓶lmL分装保存于4°C备用。
[0159] (3)吖啶酯标记的链霉亲和素的制备：
[0160] 取500此1.011^/1^的链霉亲和素，加入500此0.1-0.21^119.0-9.5的碳酸盐缓 冲液，混匀，然后加入10_20yL 5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1-2h后取出，用2mL 的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加 入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素，收集离心管中的液体至保存管得到吖啶酯标记的链霉 亲和素，每瓶lmL分装保存于4°C备用。
[0161 ] (4)吖啶酯标记的AMH单克隆抗体的制备:将生物素标记AMH单克隆抗体和吖啶酯 标记的链霉亲和素按照4:1比例混合，得到吖啶酯标记的AMH单克隆抗体。
[0162] (5)AMH定标品的制备：
[0163]用标准品缓冲液(40mM Tris-HCl，0.5%BSA，l%NaCl，pH 8.0)将人源化AMH蛋白 配置成浓度为〇ng/mL、0 ? 7ng/mL、2 ? 5ng/mL、4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL、28 ? 56ng/mL，每瓶 0.5mL分装，经冻干处理后，4 °C保存备用。
[0164] 实施例9:亲和素-生物素系统免疫检测AMH的方法
[0165] 以全自动化学发光免疫分析仪和实施例8制得的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检 测试剂盒为检测工具，即仪器依次加入1〇此的样品、50此的AMH单克隆抗体包被的磁颗粒以 及50此的生物素标记的AMH抗体、50此叮啶酯标记的链霉亲和素，反应20min后，进行磁分 离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入发光底物A液(含0.1M HN03和0.5%H2〇2)及B液 (含0.25M NaOH)进行发光反应，最后记录发光强度，从标准曲线计算出被测样品的AMH含 量。
[0166] 实施例10:实施例8制得的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒性能评价
[0167] 灵敏度的检测：
[0168] 参照CLSI EP17-A文件推荐实验方案，计算AMH化学发光免疫试剂盒的灵敏度，求 得的灵敏度为〇. 〇〇lng/mL。
[0169] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括:抗缪勒氏管激素 单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述 抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体为表面带有用于蛋白质化学 反应连接基团的磁微粒。3. 根据权利要求2所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述 表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒为表面带有氨基、羧基、甲苯磺酰基或环 氧乙烷基的磁微粒。4. 根据权利要求2或3所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的粒径为〇. 〇5μηι~3μηι。5. 根据权利要求1所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述 抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体上偶联有链霉亲和素、亲和 素或中性亲和素，所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联有生物素。6. 根据权利要求1所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述 化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所述化学发光标记物为异鲁米诺、 三联吡啶钌、吖啶酯、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。7. 根据权利要求1或6所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有 链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联有生物素。8. 根据权利要求1或6所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所述化学发光标记物与所述抗 缪勒氏管激素单克隆抗体通过化学反应键直接连接或通过蛋白交联剂连接。9. 根据权利要求8所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述 蛋白交联剂选自碳酰二亚胺盐和琥珀酰亚胺中的至少一种。10. 根据权利要求9所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述蛋白交联剂选自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基） 碳酰二亚胺盐酸盐、Ν-羟基琥珀酰亚胺和磺酸化Ν-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种。11. 根据权利要求1所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还 包括抗缪勒氏管激素定标品。12. -种权利要求1~11中任一项所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒的 制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 将抗缪勒氏管激素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到抗缪勒氏管激素单克 隆抗体包被的固相载体;以及 将化学发光标记物和抗缪勒氏管激素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学发光标记 物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。13. 根据权利要求12所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体为表面带有用于蛋白质化 学反应连接基团的磁微粒； 所述将抗缪勒氏管激素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到抗缪勒氏管激素 单克隆抗体包被的固相载体的操作为:取表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒 的悬浮液，磁分离去上清后用缓冲液重悬，接着活化剂活化所述表面带有用于蛋白质化学 反应连接基团的磁微粒的表面连接基团，接着加入抗缪勒氏管激素单克隆抗体，室温下充 分反应，磁分离去除上清后重悬，得到抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的表面带有用于蛋 白质化学反应连接基团的磁微粒。14. 根据权利要求12所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体上偶联有链霉亲和素、亲 和素或中性亲和素，所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联有生物素； 所述将抗缪勒氏管激素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到抗缪勒氏管激素 单克隆抗体包被的固相载体的操作为:将偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素的固相 载体和偶联有生物素的抗缪勒氏管激素单克隆抗体在缓冲液中混合，充分反应后得到抗缪 勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体。15. 根据权利要求12所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有链 霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述抗缪勒氏管激素单克隆抗体上偶联有生物素； 所述将化学发光标记物和抗缪勒氏管激素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学发光 标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体的操作为:将偶联有链霉亲和素、亲和素或中性 亲和素的化学发光标记物和偶联有生物素的抗缪勒氏管激素单克隆抗体在缓冲液中混合， 充分反应后得到化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体。16. 根据权利要求12所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所述化学发光标记物与所述抗缪 勒氏管激素单克隆抗体通过化学反应键直接连接； 所述将化学发光标记物和抗缪勒氏管激素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学发光 标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体的操作为:将抗缪勒氏管激素单克隆抗体和化学 发光标记物在缓冲液中混合，充分反应后得到化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克 隆抗体。17. 根据权利要求12所述的抗缪勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体中，所述化学发光标记物与所述抗缪 勒氏管激素单克隆抗体通过蛋白交联剂连接； 所述将化学发光标记物和抗缪勒氏管激素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学发光 标记物标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体的操作为:将抗缪勒氏管激素单克隆抗体、化学 发光标记物和蛋白交联剂在缓冲液中混合，充分反应后得到化学发光标记物标记的抗缪勒 氏管激素单克隆抗体。18. -种抗缪勒氏管激素的浓度的检测方法，采用如权利要求1~11中任一项所述抗缪 勒氏管激素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述抗缪勒氏管激素的浓度的检测方 法包括如下步骤： 使用抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏 管激素单克隆抗体对待测样本进行夹心免疫试验，所述待测样本中的抗缪勒氏管激素与抗 缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏管激素单克 隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得待测样本的发光强度； 使用抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的抗缪勒氏 管激素单克隆抗体对抗缪勒氏管激素定标品进行夹心免疫试验，所述抗缪勒氏管激素定标 品中的抗缪勒氏管激素与抗缪勒氏管激素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物 标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得抗缪勒氏 管激素定标品的发光强度，根据所述抗缪勒氏管激素定标品的发光强度和所述抗缪勒氏管 激素定标品的浓度构建横纵坐标分别为浓度和发光强度的抗缪勒氏管激素的标准曲线；以 及 将所述待测样本的发光信号带入所述抗缪勒氏管激素的标准曲线中，计算得到所述待 测样本中的抗缪勒氏管激素的浓度。
【文档编号】G01N33/543GK106053791SQ201610512550
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】夏福臻, 钱纯亘, 王刚, 祝亮, 刘美婷
【申请人】深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司