一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法及其装置的制造方法
【专利摘要】本发明提供了一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法及其装置，将待检测样本溶液分成等量的若干份，分批次进行荧光标记物的检测得到多次检测的统计结果，从而完成对整个样本溶液中荧光标记物的含量检测，所述待检测样本溶液中含包被了时间分辨荧光标记物的磁微球。提高了反应池的检测准确性，减少系统检测波动。
【专利说明】
一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法及其装置
技术领域
[0001] 本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方 法及其装置。
【背景技术】
[0002] 随着临床医学和科技进步，荧光免疫技术发展出多种实用检测技术，如电化学荧 光免疫分析(ECLI)、化学发光免疫分析(CLIA)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)等荧光免疫 分析技术。这些技术均通过对标记物(示踪探针)检测来确定被检测物，标记物通过免疫反 应法、化学反应法、生化反应法、链霉亲和素和生物素等包被技术，制作成具有较高特异性 的探针，探针通过相应的反应与目标检测物质结合;再通过荧光仪对示踪探针进行检测，获 得目标物质的浓度等相关信息。另一方面包被技术也在发展，除传统的96微孔板包被外，还 采用磁微球作为免疫反应的载体，通过控制磁场抓取磁微球，可大大提高包被物的量，增加 检测灵敏度，减少反应时间，方便反应过程中的清洗，实验自动化操作，提高系统灵活性和 工作效率，如目前比较流行的化学发光免疫分析仪。
[0003]针对磁微球作为免疫反应载体的设备，如：免疫荧光分析仪、化学发光荧光分析 仪，由于反应过程中需要进行若干次的清洗，最后对反应池进行整杯液体的荧光标记物含 量，以获得反应池检测目标物的浓度值。以上这些常规的荧光标记检测技术，都存在一个无 法克服的问题就是：由于反应过程经过了清洗步骤，无法保证每次试验时反应池内的磁微 球的剩余数量保持一致。存在两大缺陷： 1、 检测磁微球以低浓度分布在样本溶液中，容易因为磁微球分布不均匀或清洗不彻底 造成检测结果偏差； 2、 虽然磁微球取样精确，但经过多次清洗之后，反应池中磁微球的剩余数量却不能确 定。
[0004] 时间分辨荧光分析是以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的超 灵敏度检测技术，它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电 化学发光的非直接标记等缺点。使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信 噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存 时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干 扰和应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑。
[0005] 随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，时间分辨荧光分析法 (TRFIA)具有越来越大的应用空间，但是目前市场上还没有时间分辨荧光分析法全自动检 测系统（即随机系统）。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法 及其装置。将样品池中的磁微球分成等量的若干份，并对磁微球进行汇集后再完成荧光标 记物检测。
[0007] 本发明为了实现上述发明目的，采用如下技术方案： 一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法，待检测样本溶液中含包被了时间分辨荧光 标记物的磁微球，将待检测样本溶液分成等量的若干份，分批次汇聚磁微球并进行荧光标 记物时间分辨荧光的检测，得到多次检测的统计结果，从而完成对整个样本溶液中荧光标 记物的含量检测;单次时间分辨荧光检测的步骤如下： 1) 在两端开口的石英管中持续通入样本溶液，同时启动激发光光源，石英管的一侧设 置电磁铁，在电磁铁的磁场作用下，使流动溶液中的磁微球驻留在电磁铁的前端，随着液体 的流动，石英管内的磁微球汇集数量不断增加，形成汇集点； 2) 停止通入样本溶液，光线通过激发光路聚焦在汇集点的磁微球上，经至少10微秒后 关闭激发光光源;再经10-2000微秒的设定时间后，收集磁微球结合的焚光标记物的时间分 辨荧光信号，并转换为电信号，进行时间分辨荧光标记物的含量检测。
[0008] 本发明的荧光检测方法通过电磁铁对磁微球的磁力作用，将磁微球聚集在石英管 的检测区域，使磁微球在局部区域的浓度提高了成千倍，荧光标记物的荧光强度则可提高 上万倍，而背景干扰荧光没有相应的提高，从而提高系统的抗干扰能力和灵敏度高。
[0009] 优选地，待磁微球汇集0.1秒至10秒后，停止通入样本溶液。控制磁微球的汇集时 间从而使每次荧光检测时，磁微球的汇集数量都相同。
[0010]进一步优选地，所述电磁铁的磁力恒定为1~2000mg，保证磁微球聚集稳定。
[0011] 进一步优选地，所述液体在石英管中的流速恒定为0.1~100厘米/秒，此流速下的 磁微球能快速聚集。
[0012] 本发明所述石英管为中空透明管，其内径为0.1-10mm，能够限制磁微球向外延聚 集，使有限的空间内磁微球分布均匀且数量稳定，并且确保在磁微球汇集点处，获得更高的 磁微球总数与液体容积的占比，这样可大大提高时间分辨荧光强度，提高系统信噪比。
[0013] 优选地，所述石英管的内径和外径均为方形。
[0014] 本发明所述石英管磁微球汇集点处的一侧设置散射光收集光路，收集磁微球在光 照射时产生的散射光，样本溶液通入石英管时，实时监测汇集点处磁微球的汇聚数量。确保 每次标记物荧光的检测都是基于相同的磁微球条件下，从而提高荧光标记物检测结果的稳 定性，且实验可控性更强。
[0015] 本发明的磁微球中加入了与焚光标记物波长不同的焚光物质，在激发光照射下的 磁微球自带荧光，所述石英管的一侧设置有自带荧光收集光路，样本溶液通入石英管时，实 时监测汇集点处磁微球的汇聚数量。确保每次标记物荧光的检测都是基于相同的磁微球条 件下，从而提高荧光标记物检测结果的稳定性，且实验可控性更强。
[0016] 本发明所述的作为反应实验载体的磁微球中加入了特殊的荧光物质，如荧光染料 或稀土螯合物等，其荧光波长与荧光标记物荧光波长不同；所述电磁铁设置在石英管中部， 电磁铁受电后将流动液体中荧光磁微球驻留在石英管内，形成汇集点，随着液体的流动，荧 光磁微球的数量不断增加;在所述的激发光光源照射下，荧光磁微球激发自带的特殊波长 荧光，磁微球自带荧光收集光路设立在石英管汇集点侧面，并通过光电转换器转换成电信 号，信号高低反映了磁微球的数量。
[0017]优选地，当磁微球在汇集点聚集的数量达到1~100000粒之间的设定值时，停止通 入样本溶液。
[0018] 本发明提供了时间分辨荧光标记物的荧光检测方法的装置，包括样本抽取机构、 磁微球汇集机构和时间分辨荧光检测机构;所述的样本抽取机构包括吸液针头、石英管和 吸液栗，所述吸液针头连接石英管，石英管连接吸液栗;所述的磁微球汇集机构为恒流源供 电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一端朝向石英管;所述的时间分辨焚光检测机构包括 激发光光源、第一光电转换器、激发光路和时间分辨荧光收集光路;所述激发光光源的光线 通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的时间 分辨荧光收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的第一光电转换器对应时间分辨荧光收 集光路。
[0019] 本发明还提供了时间分辨荧光标记物的荧光检测方法的另一可选装置，包括样本 抽取机构、磁微球汇集机构、磁微球数量监测机构和时间分辨焚光检测机构;所述的样本抽 取机构包括吸液针头、石英管和吸液栗，所述吸液针头连接石英管，石英管连接吸液栗;所 述的磁微球汇集机构为恒流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一端朝向石英管;所 述的时间分辨荧光检测机构包括激发光光源、第一光电转换器、激发光路和时间分辨荧光 收集光路;所述激发光光源的光线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝 向石英管的位置相同，所述的时间分辨荧光收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的第 一光电转换器对应时间分辨荧光收集光路;所述的磁微球数量监测机构包括散射光收集光 路和第二光电转换器，所述散射光收集光路对应所述汇聚点的位置设置，所述的第二光电 转换器对应散射光收集光路。
[0020] 本发明还提供了时间分辨荧光标记物的荧光检测方法的另一可选装置，包括样本 抽取机构、磁微球汇集机构、磁微球数量监测机构和时间分辨焚光检测机构;所述的样本抽 取机构包括吸液针头、石英管和吸液栗，所述吸液针头连接石英管，石英管连接吸液栗;所 述的磁微球汇集机构为恒流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一端朝向石英管;所 述的时间分辨荧光检测机构包括激发光光源、第一光电转换器、激发光路和时间分辨荧光 收集光路;所述激发光光源的光线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝 向石英管的位置相同，所述的时间分辨荧光收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的第 一光电转换器对应时间分辨荧光收集光路;所述的磁微球数量监测机构包括磁微球自带荧 光收集光路和第三光电转换器，所述磁微球自带荧光收集光路对应所述汇聚点的位置设 置，所述的第三光电转换器对应磁微球自带荧光收集光路。
[0021] 优选地，所述的吸液栗为蠕动栗或空气喷射栗，对液体流动石英管产生压差，促使 液体从反应池中流过石英管，并且流速可控。
[0022] 本发明的激发光路、时间分辨荧光收集光路、散射光收集光路和磁微球自带荧光 收集光路均由聚集透镜和滤光片构成。
[0023]本发明所述磁微球的粒径在0 ? lum-20um之间，作为时间分辨荧光标记物的载体。
[0024] 荧光标记物为反应试验的示踪物质，包被有能与检测目标物相结合的物质，荧光 标记物具有在特定波长激发光照射下激发出长寿命荧光的特异性。
[0025] 本发明磁微球数量监测机构所用光源可与时间分辨荧光检测机构共用同一光源， 或者另外设置散射光光源或荧光磁微球激发光源，可以与时间分辨荧光检测机构的激发光 源共用一种波长，也可以是两种不同波长。
[0026]磁微球数量监测机构，还可以利用设定合适的聚集时间，使汇集点的微球数量区 域饱和，达到监测磁微球数量的目的。
[0027]本发明的有益效果在于： 1、通过电磁铁将磁微球聚集在检测区域，使磁微球在检测区域的浓度提高成千倍，荧 光标记物的荧光强度则可提高上万倍，而溶液中的杂质所产生的背景干扰信号不会被增 强，有效消减由于清洗不彻底对检测结果带来的干扰。
[0028] 2、通过设置磁微球数量监测装置来监测磁微球聚集的数量，确保每次标记物荧光 的检测都是基于相同的磁微球条件下，从而提高荧光标记物检测结果的稳定性。
[0029] 3、常规反应试验清洗的目的是减少杂质，提高荧光标记物与背景信号占比；本发 明的检测方法，通过提高磁微球密度，提高荧光标记物与背景信号占比，来提高实验精度， 特别适用于免清洗的反应体系检测荧光标记物含量。
[0030] 4、本发明检测方法将反应池的液体样本分成若干份，分别依次进行荧光标记物检 测，用多次的检测结果的统计值，代替对反应池中荧光标记物进行一次检测的常规方法，提 高了反应池的检测准确性，减少系统检测波动。
【附图说明】
[0031] 图1是本发明实施例10的荧光检测装置的结构示意图。
[0032] 图2是本发明实施例10的荧光检测装置在汇集点处垂直液体流动方向的剖面图。
[0033] 图3是本发明实施例11的荧光检测装置的结构示意图。
[0034] 图4是本发明实施例11的荧光检测装置在汇集点处垂直液体流动方向的剖面图。
[0035] 图5是本发明实施例12的荧光检测装置在汇集点处垂直液体流动方向的剖面图。
[0036] 图6是实施例14中磁微球在不同时刻汇集数量的曲线图。
[0037] 附图标记：1、石英管，2、磁微球，3、激发光光源，4、第二光电转换器，5、第一光电转 换器，6、电磁铁恒流源，7、汇集点，8、电磁铁，9、激发光路，10、时间分辨收集光路，11、散射 光收集光路，12、反应池，13、吸液针头，14、吸液栗，15、第三光电转换器，16、磁微球自带荧 光收集光路。
【具体实施方式】
[0038]下面结合【具体实施方式】对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
[0039] 实施例1 一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法，待检测样本溶液中含包被了时间分辨荧光 标记物的磁微球，将待检测样本溶液分成等量的若干份，分批次汇聚磁微球并进行荧光标 记物时间分辨荧光的检测，得到多次检测的统计结果，从而完成对整个样本溶液中荧光标 记物的含量检测;单次时间分辨荧光检测的步骤如下： 1) 在两端开口的石英管中持续通入样本溶液，同时启动激发光光源，石英管的一侧设 置电磁铁，在电磁铁的磁场作用下，使流动溶液中的磁微球驻留在电磁铁的前端，随着液体 的流动，石英管内的磁微球汇集数量不断增加，形成汇集点； 2) 停止通入样本溶液，光线通过激发光路聚焦在汇集点的磁微球上，经至少10微秒后 关闭激发光光源;再经10微秒的设定时间后，收集磁微球结合的荧光标记物的时间分辨荧 光信号，并转换为电信号，进行时间分辨荧光标记物的含量检测。
[0040] 实施例2 一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法，待检测样本溶液中含包被了时间分辨荧光 标记物的磁微球，将待检测样本溶液分成等量的若干份，分批次汇聚磁微球并进行荧光标 记物时间分辨荧光的检测，得到多次检测的统计结果，从而完成对整个样本溶液中荧光标 记物的含量检测;单次时间分辨荧光检测的步骤如下： 1) 在两端开口的石英管中持续通入样本溶液，同时启动激发光光源，石英管的一侧设 置电磁铁，在电磁铁的磁场作用下，使流动溶液中的磁微球驻留在电磁铁的前端，随着液体 的流动，石英管内的磁微球汇集数量不断增加，形成汇集点； 2) 停止通入样本溶液，光线通过激发光路聚焦在汇集点的磁微球上，经至少10微秒后 关闭激发光光源;再经2000微秒的设定时间后，收集磁微球结合的荧光标记物的时间分辨 荧光信号，并转换为电信号，进行时间分辨荧光标记物的含量检测。
[0041 ] 实施例3 一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法，待检测样本溶液中含包被了时间分辨荧光 标记物的磁微球，将待检测样本溶液分成等量的若干份，分批次汇聚磁微球并进行荧光标 记物时间分辨荧光的检测，得到多次检测的统计结果，从而完成对整个样本溶液中荧光标 记物的含量检测;单次时间分辨荧光检测的步骤如下： 1) 在两端开口的石英管中持续通入样本溶液，同时启动激发光光源，石英管的一侧设 置电磁铁，在电磁铁的磁场作用下，使流动溶液中的磁微球驻留在电磁铁的前端，随着液体 的流动，石英管内的磁微球汇集数量不断增加，形成汇集点； 2) 停止通入样本溶液，光线通过激发光路聚焦在汇集点的磁微球上，经至少10微秒后 关闭激发光光源;再经1000微秒的设定时间后，收集磁微球结合的荧光标记物的时间分辨 荧光信号，并转换为电信号，进行时间分辨荧光标记物的含量检测。
[0042] 实施例4 本实施例在实施例1的基础上： 待磁微球汇集0.1秒，停止通入样本溶液。
[0043] 所述石英管为中空透明管，其内径为5_。
[0044] 实施例5 本实施例在实施例2的基础上： 待磁微球汇集10秒，停止通入样本溶液。
[0045]电磁铁的磁力恒定为2000mg。
[0046] 所述石英管为中空透明管，其内径为0.1mm。
[0047] 所述石英管的内径和外径均为方形。
[0048] 实施例6 本实施例在实施例3的基础上： 待磁微球汇集10秒，停止通入样本溶液。
[0049]电磁铁的磁力恒定为lmg。
[0050]溶液样本在石英管中的流速恒定为100厘米/秒。
[0051]所述石英管为中空透明管，其内径为10_。
[0052] 所述石英管的内径和外径均为方形。
[0053] 实施例7 本实施例在实施例1的基础上： 所述石英管磁微球汇集点处的一侧设置散射光收集光路，收集磁微球在光照射时产生 的散射光，样本溶液通入石英管时，实时监测汇集点处磁微球的汇聚数量；当磁微球在汇集 点聚集的数量达到1粒时，停止通入样本溶液。
[0054] 实施例8 本实施例在实施例2的基础上： 磁微球中加入了与荧光标记物波长不同的荧光物质，在激发光照射下的磁微球自带荧 光，所述石英管的一侧设置有自带荧光收集光路，样本溶液通入石英管时，实时监测汇集点 处磁微球的汇聚数量;当磁微球在汇集点聚集的数量达到100000粒时，停止通入样本溶液。
[0055] 实施例9 本实施例在实施例3的基础上： 电磁铁的磁力恒定为1500mg。
[0056] 溶液样本在石英管中的流速恒定为60厘米/秒。
[0057] 磁微球中加入了与焚光标记物波长不同的焚光物质，在激发光照射下的磁微球自 带荧光，所述石英管的一侧设置有自带荧光收集光路，样本溶液通入石英管时，实时监测汇 集点处磁微球的汇聚数量;当磁微球在汇集点聚集的数量达到10000粒时，停止通入样本溶 液。
[0058] 实施例10 本实施例为实施例4-6所述时间分辨荧光标记物的荧光检测方法的装置。
[0059] 如图1和图2所示，包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和时间分辨荧光检测机构； 所述的样本抽取机构包括吸液针头13、石英管1和吸液栗14,所述吸液针头13连接石英管1， 石英管1连接吸液栗14;所述的磁微球汇集机构为恒流源6供电线圈缠绕的电磁铁8,所述电 磁铁8的一端朝向石英管1;所述的时间分辨荧光检测机构包括激发光光源3、第一光电转换 器5、激发光路9和时间分辨收集光路10,所述激发光光源3的光线通过激发光路9聚焦在石 英管1上，且该汇集点7与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的时间分辨收集光路10对应 该汇集点7的位置设置，所述的第一光电转换器5对应时间分辨收集光路10。
[0060] 实施例11 本实施例为实施例7所述时间分辨荧光标记物的荧光检测方法的装置。
[0061] 如图3和图4所示，包括样本抽取机构、磁微球汇集机构、磁微球数量监测机构和时 间分辨荧光检测机构;所述的样本抽取机构包括吸液针头13、石英管1和吸液栗14,所述吸 液针头13连接石英管1，石英管1连接吸液栗14;所述的磁微球汇集机构为恒流源6供电线圈 缠绕的电磁铁8,所述电磁铁8的一端朝向石英管1;所述的时间分辨荧光检测机构包括激发 光光源3、第一光电转换器5、激发光路9和时间分辨收集光路10,所述激发光光源3的光线通 过激发光路9聚焦在石英管1上，且该汇集点7与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的时间 分辨收集光路10对应该汇集点7的位置设置，所述的第一光电转换器5对应时间分辨收集光 路10;所述的磁微球数量监测机构包括散射光收集光路11和第二光电转换器4;所述散射光 收集光路11对应所述汇聚点7的位置设置，所述的第二光电转换器4对应散射光收集光路 llo
[0062] 实施例12 本实施例为实施例8-9所述时间分辨荧光标记物的荧光检测方法的装置。
[0063] 包括样本抽取机构、磁微球汇集机构、磁微球数量监测机构和时间分辨焚光检测 机构;所述的样本抽取机构包括吸液针头13、石英管1和吸液栗14,所述吸液针头13连接石 英管1，石英管1连接吸液栗14;所述的磁微球汇集机构为恒流源6供电线圈缠绕的电磁铁8， 所述电磁铁8的一端朝向石英管1;所述的时间分辨荧光检测机构包括激发光光源3、第一光 电转换器5、激发光路9和时间分辨收集光路10,所述激发光光源3的光线通过激发光路9聚 焦在石英管1上，且该汇集点7与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的时间分辨收集光路 10对应该汇集点7的位置设置，所述的第一光电转换器5对应时间分辨收集光路10;所述的 磁微球数量监测机构包括磁微球自带荧光收集光路16和第三光电转换器15;所述磁微球自 带荧光收集光路16对应所述汇聚点7的位置设置，所述的第三光电转换器15对应磁微球自 带荧光收集光路16。
[0064] 实施例13 如图3和图4所不，时间分辨焚光标记物的焚光检测方法，包括样本抽取机构、磁微球数 量监测机构和标记物荧光检测机构，其中： 样本抽取系统包括吸液针头13、石英管1、吸液栗14;所述吸液针头13下端浸入反应池 12中待检测样本溶液液面以下，上端经过软管，连接石英管1，石英管下端连接吸液栗14,吸 液栗14为蠕动栗或空气喷射栗，对液体流动管路产生压差，促使液体从反应池12中流过石 英管1，并且流速可控，吸液栗14出口连接废液收集瓶，废液瓶和连接软管，未在视图中画 出； 磁微球定量控制系统包括电磁铁8、散射光收集光路11及光电转换器4;所述石英管1中 部设有电磁铁8，电磁铁8上缠绕线圈，打开恒流源6使电磁铁8受电产生磁力;石英管1内流 动的液体中的磁微球2在电磁铁8磁力作用下，渐渐汇集在石英管1内壁，越积越多并形成汇 集点7。如图2所示，汇集点7上方设有激发光源3,通过激发光路9将光源的光线聚焦在汇集 点7的微球2上，汇集点7侧面设有散射光收集光路，即收集光路二11及光电转换器二4,用来 检测磁微球2在光源3照射时的散射光波长的光线强度;汇集点7处的磁微球汇集数量越多， 检测到的散射光也越强，通过光电转换器4转换成电信号，当电信号达到设定值时，启动一 次荧光检测。
[0065] 荧光检测机构包括荧光标记物荧光光路，即时间分辨收集光路10和光电转换器一 5,所述时间分辨收集光路10包括聚焦光路和只有特异性荧光波长可通过的滤光片，设立在 磁微球2的汇集点7侧面用于收集荧光标记物荧光；当荧光标记物受到激发光光源3的照射 时，被激发出特异性波长的荧光，并通过时间分辨收集光路10聚焦，将特定波长的荧光光线 送人光电转换器一 5转换为电信号;在光电转换器二4输出的散射光光强信号到达设定值时 亥IJ，荧光检测系统记录光电转换器一 5输出的荧光光强信号;并通过更换和重新汇集磁微球 2,实现多次的荧光标记物荧光光强检测，获得平均光强值，完成对反应池12中的目标物的 检测。
[0066] 通过以下实施例，对应用上述荧光检测系统定量测定样品溶液中目标检测物含量的方 法进行详细的说明。
[0067] 实施例14 双抗体夹心法定量检测TSH(促甲状腺激素)的检测 1、把抗人TSH的亚单元单克隆抗体包被磁珠上 将20mg粒径5圓表面带羧基的磁微粒(购自Thermo Scientific公司）用磁铁分离上清 液，然后把上清液移走，除去缓冲液中的叠氮钠3次，用0.1MMES缓冲液(pH6.8~7.2)悬浮， 稀释到5ml;在搅拌下加入5mg碳二亚胺(EDC)和5mg N-羟基琥I自酰亚胺磺酸钠盐，搅拌溶 解，室温反应25分钟;把活化后的磁珠用磁铁分离上清液，然后把上清液移走，除去多余的 EDC和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐。用50mM硼酸缓冲液(pH8.2~9)清洗，之后用硼酸缓冲液 悬浮到3毫升。
[0068] 加入lmg用50mM硼酸缓冲液(pH8.2~9)透析过的抗人TSH的亚单元单克隆抗体， 搅拌均匀，室温反应16到24小时；反应结束后用磁铁分离上清液，把上清液移走，加封闭液 (含有5g/L的BSA(牛血清白蛋白）、50mM pH8.5的Tris(三羟甲基氨基甲烷醋酸盐)缓冲液封 闭8小时左右，用磁铁分离上清液，把上清液移走，然后用稀释液(含有5g/L的BSA、5g/L的 PVP(聚乙烯吡咯烷酮）、0.2%叠氮钠的pH8.0的Tris缓冲液50mM)溶解沉淀，制成标识微球试 剂。4°C冷藏保存。
[0069] 2、把在抗人-TSH的a-亚单元单克隆抗体标记在荧光标记物上 将20mg粒径1 OOnm表面带羧基的焚光纳米微粒离心除去缓冲液中的叠氮钠，用前述步 骤1制备包被磁微球的方法(备注:分离荧光微粒方式改为高速离心，其余同步骤1)，将另一 株抗人-TSH的a-亚单元单克隆抗体标记到纳米焚光微粒上，用稀释液(含有5g/L的BSA、5g/ L的PVP、0.2%叠氮钠的pH8.0的Tris缓冲液50mM)溶解沉淀，制备得到荧光标记试剂，4°C冷 藏保存。该焚光标记物能在390nm波长光源的激发下，发出610nm焚光。
[0070] 3、免疫反应样品制备 取TSH浓度为0.09IU/ml的标准样品3份各50yl，分别加入3个塑料管式样品反应池12 中，并标记物A、B和C。
[0071] 向上述3个样品池中分别加入取步骤1制备的磁微球试剂20yl (固含量为万分之 二），利用电磁场振荡，样品中的TSH抗原与磁微球的包被抗人TSH的亚单元单克隆抗体免 疫反应，并附着在磁微球表面，样品溶液中的抗原越多，则在标识微球表面聚集得越多。反 应30分钟后，利用磁场进行分离，移去上清液多余的样本，再加入200yl清洗液，磁场分散， 再利用磁场进行分离，反复清洗5次，最后加入稀释液。
[0072] 按上述步骤分别对样品池B和C进行重复清洗6次、7次。
[0073]向上述3个样品池中分别加入步骤2制备的标记物试剂50yl，荧光标记物会通过标 记的抗人-TSH的a-亚单元单克隆抗体与附着在磁微球上的TSH抗原结合，形成磁微球-目标 物-标记物的复合物，约30分钟后，利用磁场进行分离，移去上清液多余的荧光标记物，再加 入200iU清洗液，磁场分散，再利用磁场进行分离，反复清洗5次，最后加入稀释液。
[0074]按上述步骤分别对样品池B和C进行重复清洗6次、7次。
[0075]理论上清洗次数越多溶液中的杂质越少，背景干扰越低，但导致磁微球数量丢失 的可能性越大。
[0076] 4、标记物荧光检测 如图3和图4所示，装置中激发光光源3为390nm光电二极管，其供电电流为80mA，从上方 照射，并将焦距对准反应池12中心，荧光光路10的滤光片为610nm光窄带通过，光电转换器5 为滨松公司光电倍增管R4220P，转换的电信号经过放大和滤波后，并进入模数转换为数字 信号。
[0077] 首先取完成上述4个步骤的样品反应池A，将吸液针头13下端浸入反应池12中液面 以下，开启吸液栗14,使液体流动管路产生压差，促使液体从反应池12中样品液体不断流过 石英管1，并且流速稳定可控，吸液栗14出口连接废液收集瓶，废液瓶和连接软管，未在视图 中画出； 打开恒流源6,使石英管1中部电磁铁8受电产生磁力，石英管1内流动的液体中的磁微 球2在电磁铁8磁力作用下，渐渐汇集在石英管1内壁，越积越多并形成汇集点7; 如图3，开启汇集点7上方激发光源3，激发光光源为390nm波长的发光二极管，并一直以 80mA恒流源供电；通过光路9将光源的光线聚焦在汇集点7的微球2上，汇集点7右侧侧面设 有散射光收集光路11及光电转换器4,光路11的滤光片为390nm光窄带通过，光电转换器4为 光电池，将磁微球2的散射光波长的光线强度转换成电信号；汇集点7处的磁微球汇集数量 越多，光电转换器4转换成电信号将约高。
[0078]荧光检测装置设置在汇集点7的左侧，当磁微球2结合的荧光标记物在390nm波长 的激发光光源3的照射时，将被激发出特异性610nm波长的荧光，荧光光路10将荧光聚焦后 经过610nm波长可通过的滤光片后，进入光电转换器5转换为电信号;监测光电转换器4输出 的散射光光强信号到达设定值时，记录荧光标记物的荧光光强电信号。
[0079] 完成一次检测后，关闭电磁铁8,磁微球随液体流走，然后再次开启，按上述步骤进 行荧光标记物检测，并重复30次后将检测结果进行统计，最后获得平均荧光标记物含量结 果，达到检测目标物的目的。
[0080] 至此，完成了对样品A的检测后，对吸液针头13进行清洗，防止交叉污染。按上述同 样方法依次对样品B和C进行检测，得到检测结果如下。
[0081 ]表1 TSH定量微球检测荧光结果
5、使用常规检测仪进行荧光检测 进行上述1-3步操作，最后把反应物移入酶标板内，对整个反应池检测荧光，使用ro Victor3 V1420-040检测仪，检测A、B和C反应池的荧光信号，结果如下： 表2 TSH反应池检测荧光结果
本实施例的实验数据说明，通过监测磁微球在汇集点的数量，使荧光标记物检测结果 减少了清洗过程中磁微球丢失造成的误差;而且通过磁力使磁微球驻留在石英管内汇集点 的密度，比反应池中的密度要高10至10000倍，减少了由于清洗不彻底引入的背景干扰，更 适合应用于全自动、快速、高灵敏度、高精度和高通量检测。
[0082] 在常规反应试验中，清洗的目的是减少杂质，提高荧光标记物与背景信号占比，本 发明给出的方法，可以通过提高磁微球密度，提高荧光标记物与背景信号占比，本实施例说 明本发明适用于免清洗的反应体系检测荧光标记物含量。
[0083] 实施例15 荧光磁微球自带荧光检测的方法 使用含有时间分辨荧光物质的磁微球作为反应载体，磁微球在激发光照射下能够被激 发出特异性荧光。
[0084] 本实施例中的这种荧光磁微球通过染色加入Sm3+螯合物，制备工艺概述如下：用丙 酮溶解萘甲酰三氟丙酮和三正辛氧膦，再把Sm 3+加入形成螯合物，再把Sm3+螯合物放入容 器浸泡磁微球10小时，然后用磁场进行分离，反复清液没有进入磁微球内部的Sm 3+螯和物， 该焚光磁微球能够在340nm光的激发下，发射出波长为644nm的焚光。
[0085]而作为时间分辨荧光标记物的物质为Eu3+螯合物，荧光标记物能够在340nm光的照 射下，发射出波长为61 Onm焚光。
[0086]焚光微球和焚光标记物可以共用一个激发光源，激发焚光波长分别为644nm和 610nm〇
[0087] 具体步骤如下： 免疫反应试验步骤同实施例14,光源3为氙灯，并使用340nm带通滤光片的激发光路9， 将光斑聚焦在石英管1的磁微球2的汇集点7;石英管1汇集点7侧面设有荧光标记物荧光收 集电路10,通过610nm波长透过的窄带滤光片光路10聚焦在光电传感器5并转换为电信号； 石英管1汇集点7侧面还设有荧光磁微球荧光收集光路18,通过644nm波长带通滤光片光路 16聚焦在电转换器15并转换为电信号。
[0088] 参考图5,首先开启吸液栗电源15,并维持电压恒定不变，吸入如实施例1所示完成 免疫反应并清洗过的待检测样品A的液体，匀速流过石英管1。开启电磁铁8的恒流源6，并维 持电流不变，磁微球2在电磁铁8产生磁力作用下在汇集点7上数量逐渐增加;打开光源3，监 测荧光磁微球荧光转换器15的输出信号，强度越高反应了磁微球2汇集的数量越多，当转换 器输出值达到设定范围时，记录在光源3照射下，激发出的荧光标记物荧光强度，即转换器5 输出的电压值，得到一次荧光标记物检测结果。
[0089] 按上述检测荧光标记物荧光的方法，分批次吸取反应池中的磁微球，进行多次的 检测，经过统计得到平均值，达到检测样品池中的荧光标记物含量的目的。
[0090] 实施例16 时间分辨荧光标记物检测 用本发明装置对样品进行检测，如图1，装置中激发光光源3为390nm光电二极管，其供 电电流为80mA，从上方照射，并将焦距对准反应池12中心，时间分辨荧光光路10的滤光片为 610nm光窄带通过，光电转换器5为滨松公司光电倍增管R4220P，转换的电信号经过发大和 滤波后，并进入模数转换为数字信号。
[0091]荧光标记物采用Eu3+螯合物，具有时间分辨特异性，在390nm光的照射下后，激发出 波长为610nm荧光，荧光寿命大于5mS〇
[0092] 如图1，首先取上述A样品反应池，将吸液针头13下端浸入反应池12中液面以下，开 启吸液栗14,使液体流动管路产生压差，促使液体从反应池12中样品液体不断流过石英管 1，并且流速稳定可控，吸液栗14出口连接废液收集瓶，废液瓶和连接软管，未在视图中画 出。打开恒流源6，使电磁铁8受电产生磁力，石英管1内流动的液体中的磁微球2在电磁铁8 磁力作用下，渐渐汇集在石英管1内壁，越积越多并形成汇集点7,经过设定的15秒后，汇集 点7聚集的磁微球2达到稳定的数量，关闭吸液栗14,开启汇集点7上方激发光源3,经过50微 秒时间的照射后关闭，经过200微秒延时时间后，开启并记录光电转换器5连续检测600微秒 时间分辨荧光信号，获得时间分辨荧光检测结果。
[0093]完成一次检测后，关闭电磁铁8，磁微球随液体流走，然后再次开启，重复30次上述 汇集磁微球2，检测记录荧光强度过程，最后进行统计获得平均光强值，完成对样本A中的目 标物的检测。
[0094]清洗吸液针头13和液路管道内壁，防止交叉污染。按上述同样方法依次对样品B和 C进行检测，得到检测结果如下。
[0095]表3 TSH定量微球检测荧光结果
时间分辨荧光标记相比瞬时荧光标记物，具有更高的特异性，更具有抗背景干扰的特 征。
【主权项】
1. 一种时间分辨焚光标记物的焚光检测方法，其特征在于:待检测样本溶液中含包被 了时间分辨荧光标记物的磁微球，将待检测样本溶液分成等量的若干份，分批次汇聚磁微 球并进行荧光标记物时间分辨荧光的检测，得到多次检测的统计结果，从而完成对整个样 本溶液中荧光标记物的含量检测;单次时间分辨荧光检测的步骤如下： 1) 在两端开口的石英管中持续通入样本溶液，同时启动激发光光源，石英管的一侧设 置电磁铁，在电磁铁的磁场作用下，使流动溶液中的磁微球驻留在电磁铁的前端，随着液体 的流动，石英管内的磁微球汇集数量不断增加，形成汇集点； 2) 停止通入样本溶液，光线通过激发光路聚焦在汇集点的磁微球上，经至少10微秒后 关闭激发光光源;再经10-2000微秒的设定时间后，收集磁微球结合的焚光标记物的时间分 辨荧光信号，并转换为电信号，进行时间分辨荧光标记物的含量检测。2. 根据权利要求1所述的一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法，其特征在于:待磁 微球汇集0.1秒至10秒后，停止通入样本溶液。3. 根据权利要求1所述的一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法，其特征在于:所述 石英管为中空透明管，其内径为〇.1-1〇_。4. 根据权利要求3所述的一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法，其特征在于:所述 石英管的内径和外径均为方形。5. 根据权利要求2所述的一种时间分辨焚光标记物的焚光检测方法，其特征在于：电磁 铁的磁力恒定为1~2000mg。6. 根据权利要求2所述的一种时间分辨焚光标记物的焚光检测方法，其特征在于:溶液 样本在石英管中的流速恒定为〇. 1~100厘米/秒。7. 根据权利要求1所述的一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法，其特征在于:所述 石英管磁微球汇集点处的一侧设置散射光收集光路，收集磁微球在光照射时产生的散射 光，样本溶液通入石英管时，实时监测汇集点处磁微球的汇聚数量。8. 根据权利要求1所述的一种时间分辨焚光标记物的焚光检测方法，其特征在于:磁微 球中加入了与荧光标记物波长不同的荧光物质，在激发光照射下的磁微球自带荧光，所述 石英管的一侧设置有自带荧光收集光路，样本溶液通入石英管时，实时监测汇集点处磁微 球的汇聚数量。9. 根据权利要求7或者8所述的一种时间分辨荧光标记物的荧光检测方法，其特征在 于:当磁微球在汇集点聚集的数量达到1~100000粒之间的设定值时，停止通入样本溶液。10. 权利要求1所述时间分辨的磁微球荧光检测方法的装置，其特征在于:包括样本抽 取机构、磁微球汇集机构和时间分辨焚光检测机构;所述的样本抽取机构包括吸液针头、石 英管和吸液栗，所述吸液针头连接石英管，石英管连接吸液栗;所述的磁微球汇集机构为恒 流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一端朝向石英管;所述的时间分辨荧光检测机 构包括激发光光源、第一光电转换器、激发光路和时间分辨收集光路;所述激发光光源的光 线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的时 间分辨收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的第一光电转换器对应时间分辨收集光 路。11. 权利要求7所述时间分辨的磁微球荧光检测方法的装置，其特征在于:包括样本抽 取机构、磁微球汇集机构、磁微球数量监测机构和时间分辨焚光检测机构;所述的样本抽取 机构包括吸液针头、石英管和吸液栗，所述吸液针头连接石英管，石英管连接吸液栗;所述 的磁微球汇集机构为恒流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一端朝向石英管;所述 的时间分辨荧光检测机构包括激发光光源、第一光电转换器、激发光路和时间分辨收集光 路;所述激发光光源的光线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝向石英 管的位置相同，所述的时间分辨收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的第一光电转换 器对应时间分辨收集光路;所述的磁微球数量监测机构包括散射光收集光路和第二光电转 换器，所述散射光收集光路对应所述汇聚点的位置设置，所述的第二光电转换器对应散射 光收集光路。12.权利要求8所述时间分辨的磁微球荧光检测方法的装置，其特征在于:包括样本抽 取机构、磁微球汇集机构、磁微球数量监测机构和时间分辨焚光检测机构;所述的样本抽取 机构包括吸液针头、石英管和吸液栗，所述吸液针头连接石英管，石英管连接吸液栗;所述 的磁微球汇集机构为恒流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一端朝向石英管;所述 的时间分辨荧光检测机构包括激发光光源、第一光电转换器、激发光路和时间分辨荧光收 集光路;所述激发光光源的光线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝向 石英管的位置相同，所述的时间分辨荧光收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的第一 光电转换器对应时间分辨荧光收集光路;所述的磁微球数量监测机构包括磁微球自带荧光 收集光路和第三光电转换器，所述磁微球自带荧光收集光路对应所述汇聚点的位置设置， 所述的第三光电转换器对应磁微球自带荧光收集光路。
【文档编号】G01N33/543GK106053786SQ201610379775
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】吴俊清, 章健, 吴冠英
【申请人】章健, 吴俊清, 吴冠英