肺癌诊断试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肺癌诊断试剂盒，属于生物科学技术领域。所述肺癌诊断试剂盒包括用于检测肺组织中非磷酸化EphB1表达水平的试剂。本发明该公开了检测肺癌组织中非磷酸化EphB1表达水平的试剂在制备肺癌诊断用试剂中的用途。通过检测肺组织中非磷酸化EPHB1表达水平，可以判断患肺癌的风险，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，对肺癌的诊断和治疗具有重大意义。
【专利说明】
肺癌诊断试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种肺癌诊断试剂盒，属于生物科学技术领域。
【背景技术】
[0002] 肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。 近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均 占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完 全明确。
[0003] 患肺癌的原因有多种，包括吸烟、职业和环境接触、电离辐射、既往肺部慢性感染、 遗传、大气污染等等；目前认为吸烟是肺癌的最重要的高危因素，烟草中有超过3000种化学 物质，其中多链芳香烃类化合物(如:苯并芘)和亚硝胺均有很强的致癌活性。多链芳香烃类 化合物和亚硝胺可通过多种机制导致支气管上皮细胞DNA损伤，使得癌基因（如Ras基因）激 活和抑癌基因（如p53，FHIT基因等)失活，进而引起细胞的转化，最终癌变。
[0004] 为了对肺癌进行诊断，一般都综合运用多种方法。到目前为止，通过对肺部原发 肿瘤以及转移性肿瘤(包括淋巴结及其它组织器官)进行病理活检并通过免疫组织化学方 法进行分析是当前国际公认的疾病诊断的金标准。此外，还可以结合胸部X-线摄影、胸部计 算机断层扫描、纤维支气管镜等进行辅助诊断。
[0005] 与病理诊断相比，其它辅助诊断方式均有不同的缺陷与不足;如采用胸部计算机 断层扫描，肺癌的大小必须达到约〇 . lcm以上才能够进行测定，在这一时期，癌症很可能已 经转移到了其它的组织;再如纤维支气管镜虽然可以将内镜插入支气管直接对肺内部进行 直接观察，但对可疑肿瘤部位也仅仅能根据临床经验进行怀疑，最终准确诊断还需活检可 疑组织进行病理诊断。
[0006] 国家知识产权局于2015年6月10日公告的公告号为CN102959398B的发明专利，该 专利公开了一种含有以HpaR为有效成份的肺癌诊断用标记，其使用血液作为检体，不会给 患者带来任何负担，其存在以下技术问题：（1)外周血与局部肿瘤组织相比，无法做到及时 准确地反映肿瘤的真实情况；（2)外周血无法反映出肿瘤局部微环境(肿瘤局部微环境在肿 瘤发生、发展、侵袭及转移中扮演着极为重要的角色）；（3)外周血是机体绝大多数蛋白、因 子等的终末汇集处、机体任何一种损伤或应激都可能导致许多蛋白、因子表达不稳定，因此 单一检测外周血中的某种因子其敏感性和特异性均差强人意。
[0007] 又如公告号为CN104694623A的发明专利，公开了一种同于肺癌诊断的血浆miRNA 标志物及应用。所述标志物包括miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和miRNA-210,其存在以 下技术问题:miRNA在血浆中极其容易降解，对血浆的保存要求较高。
[0008] 目前，暂未见有包括有用于检测肺组织中非磷酸化EphBl表达水平的试剂的试剂 盒以及检测肺组织中非磷酸化EPHB1表达水平的试剂在制备肺癌诊断用试剂中的用途的相 关报道。
【发明内容】
[0009] 本发明目的之一在于提供一种新的肺癌诊断试剂盒，以解决现有技术中肺癌诊断 方式不够高灵敏性、高特异性等问题。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下： 肺癌诊断试剂盒，其特征在于：包括用于检测肺组织中非磷酸化EphBl表达水平的试 剂。
[0011]进一步地，所述检测肺组织中非磷酸化EphBl表达水平为免疫组化检测方法用试 剂，非磷酸化EphBl是一种激酶。
[0012] 所述检测肺组织中非磷酸化EphBl表达水平为Western Blot或ELISA检测方法用 试剂。
[0013]所述试剂盒内的试剂包括:EphBl抗体、抗体稀释液、抗原修复液、洗涤液、二抗、 DAB显色剂和免疫组化笔。
[0014]本发明的另一个目的是提供检测肺组织中非磷酸化EphBl表达水平的试剂在制备 肺癌诊断用试剂中的用途。
[0015]所述检测肺组织中非磷酸化EphBl表达水平的试剂为免疫组化检测方法用试剂。 [0016] 所述检测肺组织中非磷酸化EphBl表达水平的试剂为Western Blot或ELISA检测 方法用试剂。
[0017]本发明的有益效果： 本发明通过检测非磷酸化EphBl表达水平，根据肺癌组织与正常肺组织中非磷酸化 EphBl表达水平的差异，可以判断出待检人患肺癌的风险:若非磷酸化EphBl高，则患肺癌的 风险高，若非磷酸化EphBl低，则患肺癌的风险低，非磷酸化EphBl可以作为肺癌早期诊断的 标志物，可用于肺癌的辅助诊断，临床应用前景良好，对于肺癌的诊断、治疗具有重大意义。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0019] 实施例1 以免疫组化方法为例253例肺癌患者石蜡组织进行非磷酸化EphBl表达水平的检测，并 以70例肺癌远端石蜡组织作为正常对照。
[0020] ( - )试剂来源 EPHB1抗体:购自美国affinity公司，型号为AF5012; Dako HRP标记的二抗工作液、抗体稀释液、显色剂(DAB)、抗原修复液、Wash Buffer、免 疫组化笔，均购自丹麦Dako公司。
[0021] (二)临床资料 选取肺癌患者石蜡切片253例，远端对照70例，其临床资料如下：
上述表格中，其他包括大细胞癌、腺鳞癌、小细胞癌。
[0022](三)检测方法 (I) 封闭过氧化物酶:取石蜡切片进行脱蜡，脱至水化后，用3% H202溶液于暗处封闭内 源性过氧化物酶，室温孵育15 min; 脱錯的操作过程如下：二甲苯IlOmin-二甲苯II lOmin-无水乙醇5min-95%乙醇 5min-85%乙醇 5min-75%乙醇 5min。
[0023] (2)蒸馏水漂洗:切片置于蒸馏水中，摇床上洗5 min/次，共三次； (3) 抗原修复:加入pH 8.0的Tris-EDTA或pH 6.0的柠檬酸钠溶液，在95 °C水浴锅中水 浴50 min，进行抗原修复； (4) 蒸馏水漂洗:取出切片，自然冷却至室温后，用蒸馏水洗三遍，再用Wash Buffer润 洗一次； (5) 孵育一抗:用免疫组化笔将组织圈住，防止抗体流出，然后在圈内滴加EPHB1抗体稀 释液(抗体稀释液是抗体与稀释液按1:200的比例配置而成），4 °C孵育过夜； (6) 蒸馏水漂洗：用蒸馏水洗三遍，Wash Buffer润洗一次； (7) 滴加二抗:滴加 Dako HRP标记的二抗工作液(二抗与稀释液的比例为1:50)，室温孵 育60 min; (8) 蒸馏水漂洗:蒸馏水洗，5min/次，共三次； (9) DAB显色:滴加显色底物DAB，在显微镜下观察显色情况，于蒸馏水中终止反应； (10) 苏木素复染:将切片放入苏木素染液中染色2 min，l%盐酸酒精分化后，流水冲洗 10 min； (II) 脱水透明：经80%、95%、100%梯度酒精脱水、二甲苯透明，于通风厨中干燥； (12)封片：用中性快干胶封片，在光学显微镜下观察，DP Controller图像采集系统采 图。
[0024](四）免疫组化评分标准 肿瘤细胞染色强度*肿瘤细胞阳性面积为〇~9分； (五) 检测结果
由两名经验丰富的病理医生采用SPSS17软件对实验组(肺癌组织)和对照组(远端对照 组织)进行统计分析，得到以下结果，结果中，阴性为0分，低度阳性为1~3分，高度阳性>3 分。
[0025] 阳性表达率：
(六) 结果分析 由以上结果可以看出，与癌旁正常肺组织相比，肺癌组织的非磷酸化EphBl显著升高， 说明肺癌与非磷酸化EphBl表达水平呈正相关，非磷酸化EphBl的高表达会显著提高患肺癌 的可能性。由于癌旁正常肺组织的FRK水平可反映正常人肺组织的非磷酸化EphBl水平，因 此，可以通过检测待检人群的非磷酸化EphBl的表达水平，将肺癌的易感人群筛查出来。
[0026] 实施例2 本实施例给出一种肺癌诊断试剂盒，具体如下： 1、试剂盒的组成 检测试剂盒(50人份）：
备注:本表格按每张切片滴加各类实验试剂为lOOyL/张，具体用量可根据组织大小适 当增减。
[0027] 2、试剂盒的使用方法同实施例1。
[0028]以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依 据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护 范围之内。
【主权项】
1. 肺癌诊断试剂盒，其特征在于:包括用于检测肺组织中非磷酸化EphBl表达水平的试 剂。2. 如权利要求1所述的肺癌诊断试剂盒，其特征在于：所述检测肺组织中非磷酸化 EphBl表达水平为免疫组化检测方法用试剂。3. 如权利要求1所述的肺癌诊断试剂盒，其特征在于：所述检测肺组织中非磷酸化 EphBl表达水平为Western Blot或ELISA检测方法用试剂。4. 如权利要求2所述的肺癌诊断试剂盒，其特征在于:所述试剂盒内的试剂包括:EphBl 抗体、抗体稀释液、抗原修复液、洗涤液、二抗、DAB显色剂和免疫组化笔。5. 检测肺癌组织中非磷酸化EphBl表达水平的试剂在制备肺癌诊断用试剂中的用途。6. 如权利要求5所述的用途，其特征在于：所述检测肺组织中非磷酸化EphBl表达水平 的试剂为免疫组化检测方法用试剂。7. 如权利要求5所述的用途，其特征在于：所述检测肺组织中非磷酸化EphBl表达水平 的试剂为Western Blot或ELISA检测方法用试剂。
【文档编号】G01N33/574GK106053816SQ201610692202
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月19日
【发明人】何英
【申请人】四川大学华西第二医院