臭曲霉表达系统的制作方法

专利名称：臭曲霉表达系统的制作方法
技术领域：
本发明领域本发明涉及在重组蛋白质生产中有用的宿主细胞。具体地说，本发明涉及曲霉属的真菌宿主细胞，可以用其高水平表达重组蛋白质，特别是酶。
本发明背景近年来，重组宿主细胞在异源蛋白质表达中的使用已经大大简化了有商业价值蛋白质的大量生产，当然，从其天然来源仅仅通过纯化也是可以得到的。最近，选择了许多表达系统用于从中生产任何给定的蛋白质，其中包括原核和真核宿主。适宜表达系统的选择常常不仅取决于宿主细胞以活性状态生产相当产率的蛋白质的能力，而且在大程度上受蛋白质的最终用途所支配。
尽管常常用哺乳动物和酵母细胞作为真核宿主，但是已现在开始认识到用丝状真菌作为重组蛋白质生产的宿主细胞是非常有用的。目前用于或建议用于所述目的的丝状真菌是粗糙链孢霉，Acremonium chrysogenum，Tolypocladium geodes，卷枝毛霉和Trichoderma reesei。另外，已经特别有效地用曲霉属的某些种作为重组蛋白质生产的宿主细胞。曲霉属是半知菌类真菌，其特征在于aspergillum由终止于泡囊的分生孢子菌柄组成，每个菌柄依次带有一或两层同时形成的特化细胞，称为小梗或瓶梗，以及无性形成的孢子，称为分生孢子。已经报道了用重组质粒转化构巢曲霉(Ballance et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.112284-289，1983)，但发现转化的的频率相当低。已经描述了将黑曲霉和米曲霉用于重组生产蛋白质。但是，尚未表明将曲霉属的其他种可用于蛋白质的重组生产，而且事实上，由于蛋白酶或真菌毒素的低表达和/或过量生产，并不是曲霉属的所有种均适于作为宿主细胞用于该目的，而且从一个种的这种能力也不能推测到另一个种。已经用臭曲霉表达乙型肝炎抗原(Hongdi，et al ActaMicrobiologica Sinica 3098-104，1990)，但是还没有报道将其用于表达任何其他类型的蛋白质，而且也没有报道说它可以以高产率生产蛋白质。一种理想的表达系统是基本上没有蛋白酶和真菌毒素产生且无大量内生分泌的蛋白质，但是比已知宿主细胞的表达水平高。现在本发明提供符合这些要求的新的曲霉表达系统。
本发明综述本发明提供含有编码异源酶的核酸序列的臭曲霉宿主细胞。“异源酶”指不是宿主细胞中天然存在的，或已经对其进行了修饰从而改变了天然序列的天然蛋白质。在优选的实施方案中，所述蛋白质是异源真菌酶。所述核酸序列与一适宜的启动子可操作相连，所述启动子能够指导核酸序列在所选宿主细胞中的转录。
本发明涉及重组生产酶的方法，所述方法包括在导致表达所述酶的条件下，培养含有编码异源酶的核酸序列的臭曲霉，然后从培养物中回收所述酶。在优选的实施方案中，所述酶是真菌酶。
本发明的宿主细胞和方法在各种真菌酶的重组生产中与其他已知的曲霉种例如黑曲霉或米曲霉相比，有意想不到的效果。本发明的详细描述臭曲霉属于曲霉属的Nigri组。Nigri组的成员，例如黑曲霉是特征在于有辐射状的分生孢子头和呈黑色的分生孢子群；球形泡囊；菌柄光滑透明，或在泡囊下有色素；有或没有梗基，且常常着色(“The Genus Aspergillus”，by K.B.Raper and D.I.Fennel，TheWilliams and Wikins Company，Baltimore，1965)。这些菌株的突变体在孢子颜色和纹饰上不同，或在该组内也包括其他微生物学特征。在曲霉属的Nigri组内，分类单位的界定经过了多论，这是因为主要分类目录所主要依赖的菌落颜色和产分生孢子结构有变异(即，Raper and Fennel，同上文)。Raper和Fennel鉴定的臭曲霉-相关的分类单位是臭曲霉和臭曲霉acidus变种和臭曲霉pallidus变种。
臭曲霉的一般特征为有两列小梗；分生孢子头保持灰暗的棕色或橄榄棕色；分生孢子为球形或在成熟时接近球形，不规则但细致地粗糙。更具体地说，该种的特征为在室温(24-26℃)Czapek’s溶液琼脂上菌落生长相当缓慢，在10到2星期内，直径为3.5-4.5cm，营养菌丝为白色或黄色，生长浸没程度较大或形成相当致密且相对粗糙的表面，平坦或呈放射状环沟的无环沟或浅环沟，在一些菌株中有丰富的橄榄棕色到棕黑色分生孢子头，除正在生长的边缘外，在其他菌株中，孢子形成整齐但不丰富；没有渗出物或不显著；菌落背面为黄色到橙色，在衰老时变为红棕色，而且气味很强烈，有刺激性，放线菌状。分生孢子头开始小，球形到放射状，在拥挤的菌落中心区域一直保持这样，其他靠近菌落边缘逐渐变得不规则，裂成数个很规则的柱，总直径常常为200-300μ，但在有些菌株得到500μ；大部分分生孢子直径为25-35μ，但有些菌株得到40-50μ，在较大头的整个表面或较小泡囊的四分之三上可育；有两列小梗，在棕色阴影中着色，初生的有点可变，大多数为7-12μ×3.0-5.0μ，偶尔较长，二级大多数为7-8μ×2.5-3.0μ；分生孢子球形或接近球形，有棕色的壁，常常看起来很光滑但成熟时不规则而且很粗糙，大多数直径为4.0-4.5μ，带有没有明显孢间。
菌落在麦芽提取物琼脂上菌株生长稍迅速，在两星期内直径达5-6cm，平坦，被茸毛的，营养菌丝体浸没，无色或只是稍微有点黄色，始终有很多孢子形成，黑棕色阴影，无环沟或有不显著的环沟，背面有淡黄色阴影到几乎无色；气味不显著。分生孢子头通常裂成许多显著分叉的且致密的柱，在大多数菌株中直径达到300-350μ，但在其他的菌株中达到600-800μ；分生孢子头比在Czapek琼脂上的有更均匀的小刺。分生孢子头的详细描述见上文。首先由Thom和Raper(A Manual of the Aspergilli 219-220，Fig.61C，1945)描述了这些种。
臭曲霉pallidus变种(Nakazawz，Simo，and Watanabe，J.agr.Chem.Xoc.Japan 12961-962，Fig.10，1936)的特征在于在Czapek溶液琼脂上的生长相当受限制，在室温(24-26℃)10天内直径为2.0-2.5cm，平面或很浅的环沟，有致密的基菌丝体，无孢子形成，在边缘为白色或黄色，但是在暗灰色到橄榄-棕色并接近暗橄榄到Chactura或橄榄黑的阴影中带有拥挤的分生孢子头；背面开始无色，然后变黄，在衰老时变成暗黄棕色；在种中属于气味不显著的，不可辨别。分生孢子头呈球形放射状，直径通常为500-600μ，通常裂成很少的且不清晰的柱；分生孢子光滑，无色或淡棕色，通常长为1×宽为8-16μ，偶尔有更长的；泡囊球形或接近球形，在最大的头上直径50-60μ，在整个表面上均是可育的；有两列小梗，棕色，一级的在年轻时通常为10-15μ×3.5-5.0μ，在衰老的头上达30-40μ，二级大多数为7-10μ×3.0-4.0μ；分生孢子从椭圆形到卵圆形而且光滑或近似光滑，逐渐变成球形或亚球形，直径为3.5-4.5且较粗糙，附着在液体载片上，但连续而不显著。
菌落在麦芽上生长要更迅速些，平坦通常被茸毛的而且有很多孢子形成，在暗橄榄黑阴影中。分生孢子结构直径达700-800μ，基本上与在Czapek琼脂上的情况相同，但是成熟的分生孢子为3.0-3.5μ，球形有小刺，有纵向的表面标记。这种不同区别于所述种的主要方面在于在Czapek琼脂上生长受到更多的限制，有较大的二维结构，其分生孢子结构橄榄色更深，在麦芽琼脂上的成熟头上没有明显的分生孢子分叉柱。
臭曲霉acidus(Nakazawa，Simo and Watanabe，J.Agr.Chem.Soc.Japan 12960-961，fig.8，1936)的特征在于菌落在Czapek液体琼脂上生长相当缓慢，室温(24-26℃)10-14天为4.0-5.0cm，最初为絮状且接近白色到淡黄色，孢子形成较少，后期产生相对较少的球形放射状，在边缘和次边缘区有棕黑色分生孢子头；背面黄色阴影在衰老时逐渐变成暗黄棕色；气味不显著；分生孢子头相对较大，直径为350-400μ，不裂成明晰的柱；分生孢子相对短且宽，通常为600-800μ×20-30μ，罕见1mm长的，泡囊球形或接近球形，直径达80-85μ在整个表面上均可育；双列小梗，棕色，一级为20-40μ×4.6μ，二级为6-10μ×2.5-3.5μ；分生孢子球形到有些扁平，棕色，直径为4.0-4.5μ，相对厚的壁，看起来光滑或表面有点不规则，但没有小刺或微皱。
菌落在麦芽上生长更迅速在10天内孢子形成不规则，宽环沟，平坦或很密的褶皱，营养菌丝体生长浸没程度大，明亮的金黄色；如上，在短分生孢子上带分生孢子头但比在Czapek上的大，直径达到500-600μ，而且有很多清晰的分生孢子柱。这种变化不同于所述种的方面在于菌落在Czapek和麦芽琼脂上孢子形成程度更低，其分生孢子头和结构部分较大，有相当短和较宽的分生孢子，特别是在麦芽琼脂上有明亮的黄色菌丝体。
应当理解在说明书和权利要求中所用的术语臭曲霉不仅包括在上述三个种中所含的生物，而且包括在改变的分类目录中已经或现在被分为其他类的那些，但是，它们应具有与上述相同的形态学或培养特征，而且可以是臭曲霉及其变种异名。例如异名包括(但不限于)A.aureus Nakazawa，A.aureus var.pallidusnakazawa，Simo and Watanabe。还可能的异名是A.citricusMosseray(A.Musallam Revision of the Black Aspergiilusspecies，Ph.D.thesis，Universitu of Utrecht)。
通过评价由曲霉属不同分类组中15个以上种的各种分离物产生的蛋白酶水平来开始确定候选宿主细胞。在酸，中性和碱性pH通过在酪蛋白清除平皿上检测来达到上述目的。令人惊奇的是，发现Nigri组的几个成员完成的最好，即它们生产的蛋白酶量最小，所述蛋白酶会降解所生产的任何重组蛋白质。以这一标准为基础，选择了数个种以进行进一步的研究，包括臭曲霉，日本曲霉，日本曲霉棘孢变种，棘孢曲霉，塔里木氏曲霉，碳黑曲霉和海枣曲霉。
然后进行转化所选的种的尝试。开始的努力集中在标准米曲霉转化技术(Christensen et al.，Bio/Technology 61419-1422，1988；欧洲申请87 103806.3)的使用。总之，用有关形成原生质体的米曲霉方法，转化和amdS或潮霉素B(hygB)标记基因的筛选得到了共转化体。表达载体含有米曲霉TAKA-淀粉酶基因和来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止信号，此外，还有异源编码序列。转化频率从1/μg DNA到10/μg DNA不等。在下列实施例中详细描述用表达载体的共转化试验中，共转化的频率为0-60％。
然后观察转化的种以确定各种异源酶的表达水平。所试验的异源酶包括Humicola lanuginosa脂酶(HLL)，Humicola insolens木聚糖酶(木聚糖酶)，Humicola insolens纤维素酶(纤维素酶)，Coprinus cinereus过氧化物酶(CiP)，和Candidaantarctica脂酶A。令人惊奇的是，臭曲霉对于一种或多种酶而言，均有最好的表达结果，但在某些情况下，均比对照米曲霉菌株的酶产率高。具体地说，在振荡烧瓶培养中，一个臭曲霉菌株生产很高水平的HLL(每升约1克)。这些试验结果的总结见表2。
正如结果清楚地表明的，该种的数个分离物都能表达异源蛋白。因此，这种能力并不限于单个分离物或菌株，而是这个种整个的特征。本领域专业人员应认识到这些种的其他菌株或分离物也可以用于表达异源蛋白质。在美国典型培养物收集中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockille Maryland 200852)；Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL，1815North University Street，Peoria，Illinois 61604)；Fungal GeneticsStock Center (FGSC，Kansas)；Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkuturen(DSM，Mascheroder Weg1B，D-3300 Braunschweig，Germany)；Institute of Applied Microbiology(IAM，TodyoUniversity 1-1，1-Chome，Yayoi，Bunkyo-ku，Tokyo113，Japan)；Institute for Fermentation(IFO，17-85 uso-Honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka 532，Japan)；和Centraal Bureau voor Schimmelcultures(CBS，Oosterstraat 1，3740 AG Baarn，Netherlands)所述各个种的许多菌株均是公众可以得到的。
本领域专业人员也会理解成功地转化本文所述的宿主种并不限于使用具体举证的载体，启动子和选择性标记。通常来说，在转化米曲霉，黑曲霉和构巢曲霉中有用的那些技术也适用于本发明的宿主细胞。例如，尽管amdS和hygB选择性标记是优选的，但是其他有用的选择性标记包括argB(构巢曲霉和黑曲霉)，trpC(黑曲霉或构巢曲霉)或pyrG(黑曲霉或构巢曲霉)标记。启动子可以是在这些种中表现出强转录活性的任何DNA序列，而且可以得自编码细胞外和细胞内蛋白质，如淀粉酶，葡糖淀粉酶，蛋白酶，脂酶，纤维素酶和糖酵解酶的基因。所述适宜的启动子可以得自米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂酶的基因。糖酵解酶基因启动子的实例是TPI，ADH和PGK。启动子也可以是同源启动子，即天然臭曲霉基因的启动子。本发明优选的启动子是米曲霉TAKA淀粉酶启动子。TAKA淀粉酶是熟知的α-淀粉酶(Todaet al.，Proc.Japam Acad.58 Ser.B.208-212，1992)。启动子序列也可以有连接子以便导入特异性限制位点，从而有利于将启动子序列与所选的基因或与所选的信号肽或前区相连。终止子和多聚腺苷酸序列可以从与启动子相同的来源得到。也可以将增强子序列插入构建体。
为了避免因得到表达产物而不得不破碎细胞，并使细胞内表达产物可能的降解量最小，优选的是将产物分泌到细胞外。为了达到此目的，在优选的实施方案中，将所需的基因与可使表达产物进入细胞分泌途径的信号或前导肽相连。前区可以得自来自任何生物的分泌蛋白的基因或可以是天然的前区。所述前区的有用的来源是曲霉属的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因，杆菌属的淀粉酶基因，Rhizomucor miehei的脂酶或蛋白酶基因，啤酒酵母α-因子的基因或牛凝乳酶原基因。最佳的前区得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸性α-淀粉酶、地衣形牙孢杆菌α-淀粉酶、Bacillus NCIB 11837产麦芽(maltogenic)淀粉酶或地衣形牙孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的基因。一种有效的信号序列是米曲霉TAKA淀粉酶信号，Rhizomucor miehei脂酶信号。另外，也可以使用所表达蛋白的天然前区。
可将与启动子和终止子序列功能相连的所需产物的基因掺入含有选择性标记的载体中或可以将其放在能够被整合到宿主菌株基因组中的单独载体或质粒中。所述载体系统可以是单个载体或质粒或者一起含有被整合到基因组中的整个DNA的两个或多个载体或质粒。载体或质粒可以是线性的或闭合的环状分子。根据本发明优选的实施方案，用两个载体转化宿主，其中一个含有选择性标记，另一个含有剩下的待导入的异源DNA，包括启动子，编码所需蛋白质的基因和转录终止子及多聚腺苷酸序列。
可以使用本发明的宿主细胞以表达所需的原核或真核异源酶，而且优选的是用于表达真核酶。所述种是特别有用的，即已经同意将它们用于食品工业。所述种还特别适于表达异源真菌酶(Regulatory Aspects of Microbial Food Enzymes Third Edition，The Association of Microbiaa Food Enzyme Producers，Brussels，Belgium)。可以用新的表达系统表达酶，如过氧化氢酶，漆酶，酚氧化酶，氧化酶，氧化还原酶，纤维素酶，木聚糖酶，过氧化物酶，脂酶，水解酶，酯酶，角质酶(cutinase)，蛋白酶和其他蛋白水解酶，氨肽酶，羧肽酶，肌醇六磷酸酶(植酸酶)，裂解酶，果胶酶和其他果胶水解(pectinolytic)酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，甘露糖苷酶，异构酶，蔗糖酶，转移酶，核糖核酸酶，几丁质酶和脱氧核糖核酸酶。本领域专业人员应该理解术语“真菌酶”不仅包括天然真菌酶，而且也包括已经通过氨基酸取代，缺失，加入或其他可以提高活性，热稳定性，pH耐受性等的改变而修饰的真菌酶。
也可以用本发明的宿主细胞重组生产所述宿主细胞的天然蛋白质。所述应用的实例包括但不限于将臭曲霉天然蛋白质置于不同启动子的控制下以提高所述蛋白质的表达，利用信号序列将所需的天然蛋白质迅速运输到细胞外，或增加由主体宿主细胞产生的蛋白质的拷贝数。因此，本发明还包括同源蛋白质的重组生产，从而所述的表达包括使用宿主细胞中天然不存在的遗传元件，或使用已经经过加工不以在所述宿主细胞中常见的方式发挥功能的天然元件。
将利用下列非限制性实施例进一步说明本发明。I蛋白酶检测检测来自至少15个不同种的50个以上的菌株以确定由各分离物生产的蛋白酶的量，同时观察其细胞外蛋白酶图谱。为了制备培养接种物，将10ml灭菌水加到一在9cm平皿中的7-10天的各菌株的老培养物中，从菌丝体上轻轻刮下孢子制成稠密的悬浮液。用2.5ml悬浮液接种100mlASPO4培养基[ASPO4培养基含有1g/lCaCl2，2g/l酵母提取物，1g/lMgSO4，5g/l KH2PO4，2g/l柠檬酸，0.5mlTrace Metal溶液(含有14.3g/lZnSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，0.5g/lNiCl2·6H2O，13.8g/lFeSO4·7H2O，8.5g/lMnSO4·H2O，和3g/l柠檬酸)，1g/l脲，2g/l(NH4)2SO4，在自来水中的20g/l麦芽糖糊精(8ml25％的原液，灭菌后加入)，灭菌前将pH调到4.5或6.5，灭菌后用8ml0.1M/100ml柠檬酸将pH调到4.5]。将烧瓶在30和/或37℃培养，在旋转的振荡仪上以200rpm振荡培养5天，在连续光照下。将各培养液的上清液以2500rpm离心5分钟，然后用于酪氨酸澄清平皿检测，确定作为重组蛋白质表达潜在候选菌的各真菌种生产的蛋白酶水平。
按如下完成酪蛋白平皿澄清实验。平皿培养基由20g/l脱脂牛奶，29g/l琼脂糖和用于在pH5和pH7跑样试验的0.2M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，以及用于在pH9跑样试验的苷氨酸NaOH缓冲液组成。将奶粉与100ml缓冲液混合并于60℃保持。将琼脂糖与400ml缓冲液混合，然后高温灭菌5分钟。稍微冷却后，加入热牛奶混合物，将混合物轻轻地倒置2-3次以便混合。将培养基倒入150mm平皿中，每平皿使用50-70ml，然后在5℃贮存直到使用。
即将使用前，在每平皿的琼脂上做12个小孔。将25μl各菌株发酵上清液在不同的pH加到不同的平皿中，然后在37℃培养过夜。对于pH9的平板，加入0.5M冰乙酸以使酪氨酸沉淀，然后对任何澄清的区进行肉眼观察。接着测量各平皿澄清区的大小(即，直径从没有区到＞2cm)和区类型(澄清，模糊或介于两者之间)。
再用各培养物的上清液评估这些菌株的细胞外蛋白质生产。用按制造商的说明制备的Novex(San Diego，California)8-16％梯度凝胶估计蛋白质图谱。将75μl(3和5天)培养上清液样品与20μl5X解离缓冲液(解离缓冲液＝4mlTris-HCl，pH6.8，1gSDS，617mg二硫苏糖醇，和至10ml蒸馏水)和甘油/溴酚蓝(10-20mg加到约10ml80-90％甘油中，然后在沸水中放1-2小时以溶解)混合，煮5分钟，冷却，上样，在60-200V跑样直到溴酚蓝示踪染料到达凝胶底部。用Biorad Silver Stain Plus Protocol(BioradLaboratories，Hercules，CA)将凝胶银染。认为有大量带的那些分离物不太适宜作为潜在的新宿主，而认为图谱相对澄清并只有1-4个主要带的那些可用于进行进一步的实验。
纵观蛋白酶检测和蛋白质图谱的综合结果，发现大多数适宜的潜在候选菌株均是Nigri组的成员。基于这些结果，选用下列分离物进行转化研究臭曲霉E46，臭曲霉CBS 103.14，臭曲霉pallidus变种(NRRL356)，臭曲霉N0953(NRRL337；ATCC1-254)，日本曲霉A1438(CBS 568.65)，棘孢曲霉N1136(CBS 101.43)，棘孢曲霉N1454(CBS 172.66)，棘孢曲霉N1455(CBS 186.67)，日本曲霉棘孢变种N0956(IAM13871)，海枣曲霉A528(CBS 139.48)，海枣曲霉A530(CBS137.52)，海枣曲霉E419(CBS 137.52)，炭黑曲霉A3993(IBT4977)，炭黑曲霉ATCC1025，塔木里氏曲霉E112(ATCC 10836)，塔木里氏曲霉N2266(IFO 4358)和塔木里氏曲霉N2267(IFO 4142)，还将这些培养物保藏在Novo NordiskBiotech Culture Collection，Davis Califonia。II载体构建A选择性标记载体在转化带有潮霉素B抗性选择性标记的宿主细胞时，使用载体pJaL77和pJaL154。该选择性标记是以E.coli潮霉素B磷酸转移酶基因为基础，所述基因在pJaL77中位于TAKA启动子的控制下，在pJaL154中位于amdS启动子的控制下。简而言之，按如下构建这些载体。从Boehringer Mannheim购买作为质粒pHph-1赋予潮霉素B抗性的基因。所述基因配有ATG密码子和经PCR在氨基和羧基末端的适宜的限制位点，使用的引物为5’-GCT CAG AAGCTT CCATCC TAC ACC TCA GCAATG TCG CCT GAA CTC ACC GCG ACG TCT-3’(N-末端)和3’-CGT CCG AGG GCA AAG GAA TAG CTCCAGAGATCT CAT GCT-5’(C-末端)。用限制酶BamHI和XhoI切割PCR片段，然后克隆到曲霉表达载体pToC68(参见WO91/17243)中的相应位点以得到pJaL77。
按如下构建质粒pJaL154。用下列引物(划线区表示与amdS启动子同源)CCT GGA TCC TCT GTG TTA GCT TAT AG和CCT GCA TGC CGC CAG GAC CGA CGA GCA AG.经PCR从质粒pCaHj406中克隆amdS启动子突变体I9+I666(Hynes et al.Mol.Cell.Biol.3(8)1430-1439，1983 and Katz et al.MolGenGenet.220373-376，1990)。用BamHI和SphI切割含有amdS启动子的694bp的PCR片段，然后克隆到pJaL77的相应位点，以便将pJaL77中的TAKA启动子换成amdS启动子。
通过将p3SR2(Hynes et al.，同上文)的2.7kb片段克隆到XbaI切割并去磷酸化的pUC19质粒中而构建含有amds标记的质粒pToC90。称为pToC186的衍生物除启动子区含有已知可提高amdS基因表达(Hynes et al.同上文；Corrick et al.，Gene 5363-91，1987)的两个突变(I9和I66)外，与pToC90相同。B表达载体1 Humicola insolens木聚糖酶。载体pHD414是质粒p775(EP238 023)的衍生物。与该质粒相反，pHD414在TAKA启动子和AMG终止子之间有一个特有的限制位点区。通过除去终止子3’末端约200bp长的片段(含有不必要的RE位点)，然后除去启动子5’末端约250bp长的片段(也含有不必要的位点)而构建所述质粒。通过用NarI(位于pUC载体)和XbaI(3’到终止子)裂解，随后用Klenow DNA聚合酶+dNTP补平成熟的末端，在凝胶上纯化载体片段并将载体片段再连连而除去20bp的片段。该质粒称为pHD413。用StuI(启动子的位于5’末端)和PvuII(在pUC载体中)切割pHD413，在凝胶上分离缤纷再连接，得到pHD414。将含有在pYES中的约1100bp木聚糖酶HindII/XbaI cDNA片段的E.coli菌株以DSM6995保藏在DSM。通过用HindII/XbaI裂解而从一个克隆中分离木聚糖酶cDNA片段。经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱纯化所述片段，然后准备进行连接反应。将cDNA片段连接到pHD414中以得到pAXX40-1-1。木聚糖酶基因和蛋白质的序列示于SEQ ID NO 1和2，且所述基因以DSM(Deutsche SammlungVon Mikrooroganismen und Zellkulturen GmbH)6995保藏。
2 Humicola insolens纤维素酶。在WO 91/17243中可找到Humicola insolens纤维素酶的详细特征。用限制酶BamHI和SalI裂解，从pCaHj201中切去926bp的纤维素酶编码区片段而构建用于纤维素酶表达的表达载体从pCaHj418。用标准技术经制备性凝胶电泳纯化所述片段，然后与已经BamHI和XhoI处理的pHD414(见上述)相连。所得的表达载体pCaHj418含有在米曲霉TAKA淀粉酶启动子转录控制下的纤维素酶基因和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子区。
3 Humicola langinosa脂酶。在EP305和美国系列申请No.07/236,605中报告了H.langinosa脂酶基因的分离和表达，所有内容引入本文作为参考。总之，用如Bodl等人(EMBO J 31097-1102，1984)和Chirgwin等人(Biochenistry 185294-5299，1979)描述的方法从H.langinosa菌丝体中抽提总RNA。按Aviv和Leder(PNAS USA 691408-1412，1972)所述，在寡(dT)-纤维素中进行两个循环的亲和层析而得到含Poly(A)的RNA。用Okayama和Berg(Molec.Cell.Biol.2161-170，1982)描述的方法，和Noma等人(Nature 319640-646，1986)描述的载体pSP62-K2和pCDVI-PL合成cDNA。将合成的cDNA转化到E.coli MC1000的hsdR-，M+衍生物(Casadaban and Cohen，J.Mol.Bol.138179-207，1980)中以得到重组克隆。
在Applied Biosystems，Inc.DNA合成仪上合成32个十五聚物寡脱氧核糖核苷酸混合物A A A A Ad( TT AA TG TT AA)，G G G G G其中之一与Phe-Asn-Gln-Phe-Asn编码区中的H.langinosa脂酶mRNA互补然后经PAGE纯化。将H.langinosacDNA文库中的约10000个E.coli重组体转到Whatman540滤纸上。按Gergen等人所述(Nucleic Acids Res.72115-2135，1979)溶解菌落，然后固定。将滤纸与Boel等人(EMBO J31097-1102，1984)所述的32P-标记的H.langinosa脂酶特异性十五聚物混合物杂交。分别在37℃和43℃完成滤纸杂交和洗涤，然后然后用放大屏放射自显影24小时。从两个杂交的菌落pHLL702.3和pHLL702.4用标准方法(Birnboim andDoly，Nucleic Acids Res.71513-1523，1979)分离少量制备的质粒DNA，用Maxam和Gilbert(Methods Enzymol.65499-560，1980)的方法确定DNA插入片段的DNA序列。
为了有利于用cDNA进行进一步的构建，按如下将含有特定限制位点的DNA序列加到cDNA的5’和3’末端。用消化3’非翻译区cDNA的Sau961消化pHLL702.3，然后，用大肠杆菌DNA聚合酶(Klenow片段)和四种dNTP填平所得的末端。随后用切割3’到起始甲硫氨酸密码子cDNA的SacI消化所述DNA。经琼脂糖凝胶电泳纯化所得的0.9kb cDNA片段；电洗脱，然后制备进行连接反应。合成927和928bp的作为5’衔接物的两个寡核苷酸。设计所述衔接物以便将HindIII和BamHI位点加到cDNA 5’到起始Met密码子前。用ATP和T4多聚核苷酸激酶激活所述两个寡聚物，彼此退火，然后与用HindIII和HincII消化的pUC19载体中纯化的0.9kbcDNA序列相连，在0.7％琼脂糖凝胶上纯化。所得的质粒携带了为0.9kb BamHI可携带片段的H.langinosa脂酶cDNA。BamHI消化并在琼脂糖凝胶上纯化0.9kbcDNA片段后，将其与BamHI和磷酸酶化的p775相连，以得到p960，其中脂酶cDNA位于米曲霉TAKA启动子和黑曲霉AMG终止子的转录控制下。
为了制备pMHan37，通过用来自构巢曲霉tpiA基因(McKnightet al，Cell 46143-147，1986)对应区代替在H.langinosa脂酶基因上游的米曲霉TAKA启动子5’非翻译区的60个碱基对而修饰p960。在PCR反应中使用合成的寡核苷酸和另一个引物，前者含有来自构巢曲霉tpiA两侧的5’非翻译区，在该区的每个末端均有20个碱基与正好在非翻译区外的p9609序列同源，后者含有TAKA启动子区中的BssHII位点。由于诱变引物含有靠近ATG起始密码子的BamHI位点，所以用BamHI和BssHII消化所述PCR片段，然后再克隆到用BssHII和用BamHI部分消化的p960中。用DNA序列分析确定MHan37中ATG上游的200个碱基。p960和pMHan37之间的序列差异如下所示pMHan37CATGCTTGGAGTTTCCAACTCAATTTACCTCTATCCACACTTCTCTTp960 CATGCTTGGAG...GATAGCAACCGACAACATCACATCAAGCTCTCCpMHan37CCTTCCTCAACAATAAACCCCACAGGGG..GGATCCp960 CTTCTCTGAATCCTCTATATACACAACTGGGGATCC含有BamHI位点的引物的序列5’GCTCCTCATGGTGGATCCCCAGTTGTGTATATAGACCATTGAGGAAGGAAGAGAAGTGTGGATAGAGGTAAATTGAGTTGGAAACTCCAAGCATGGCATCCCTTGC 35 Coprinus cinereus过氧化物酶。Coprinus cinereus过氧化物酶的分离和克隆参见WO 92/16634。总之，从匀浆的Coprinuscinereus(IFO 8371)菌丝体抽提，按Boel等人(EMBO J，31097-1102)和Chrigwin等人(Biochemistry 185294-5299)所述，在最大过氧化物酶活性时收集总RNA。按Aviv和Leder(PNASUSA 691408-1412，1972)所述，在寡(dT)-纤维素中进行两个循环的亲和层析而得到含Poly(A)的RNA。按制造商的说明，用Invitrogen的cDNA合成试剂盒合成cDNA。将来自CoprinuscinereuscDNA文库的约50000个大肠杆菌重组体转移到Whatman540滤纸上。按Gergen等人所述(Nucleic Acids Res.72115-2135，1979)溶解菌落，然后固定。将滤纸在0.2X SSC，0.1％SDS中与32P-标记的430个碱基对的过氧化物酶特异性探针杂交。在65℃完成滤纸的杂交和洗涤，然后用放大屏放射自显影24小时，在逐渐增加的温度洗涤滤纸，然后用放大屏放射自显影24小时。用这种方法，鉴定了50多个阳性克隆。用标准方法(Birnboimand Doly，Nucleic Acids Res.71513-1523，1979)从杂交的菌落中分离小制备的质粒DNA，然后用Sanger双脱氧方法(Sanger et al.，PNAS USA 745463-5467，1977)确定cDNA插入片段的DNA序列。用HindIII/XhoI从载体中切出过氧化物酶CDNA片段，用琼脂糖凝胶对应纯化，电洗脱，准备进行连接反应。将cDNA片段与HindIII/XhoI消化的HD414相连，以得到pCip，其中，cDNA位于米曲霉TAKA启动子和黑曲霉AMG终止子的转录控制下。从pCip准备pJVi9，即缺失正好在过氧化物酶起始密码子之前的SacI，KpnI，HindIII，PstI，SalI和BamHI限制位点。
编码Coprinus cinereus过氧化物酶的cDNA序列示于SEQ IDNO 3和4。
6茄病镰孢角质酶。角质酶表达载体pCaHj427含有位于米曲霉TAKA-淀粉酶启动子和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子区(Christiansenet al.，

图1，同上文)控制下的Fusarium solani f.pisi角质酶编码区(Soliday et al.，J.Bacteriol.1711942-1951，1989)。按上述用其与pToC90一起共转化臭曲霉菌株NRRL341，NRRL357和CBS103.14。
7 Candida antarctica脂酶B。表达载体pMT1335含有位于米曲霉TAKA-淀粉酶启动子和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子区(Christiansen et al.，图1，同上文)控制下的Candida antarctica脂酶B基因。按上述用该载体和pToC90转化臭曲霉菌株CBS103.14，NRRL356，NRRL357和NRRL341。
表1中列出了制备的表达载体的总结。
表1用于共转化新宿主候选菌株的表达载体
III转化曲霉宿主用下列一般方法转化所有待实验菌株，除特别说明的例外用被转化菌株的孢子接种100ml YDP(Sherman et al.Methodsin Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，1981)，于34℃振荡培养1-2天。通过miracloth过滤收集菌丝体，然后用200ml 0.6M MgSO4洗涤。将菌丝体悬浮在15ml1.2M MgSO4，10mM NaH2PO4，pH＝5.8中。将悬浮液在冰上冷却，加入1ml含120mg BSA(Sigma型H25)的缓冲液中，于37℃缓慢搅拌继续培养1.5-2.5小时，直到在显微镜下，在样品中可以观察到大量的原生质体。
通过miracloth过滤悬浮液，将滤液转移到无菌试管中，用5ml0.6 M山梨醇，100mM Tris-HCl，pH＝7.0覆盖。以2500rpm离心15分钟，从MgSO4层的顶部收集原生质体。将两体积的STC(1.2M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH＝7.5，10mMCaCl2)加到原生质体悬浮液中，，然后以1000Xg将混合物离心5分钟。将原生质体颗粒重悬于3mlSTC中，然后再沉淀。重复该过程，然后将原生质体重悬于0.2-1mlSTC中。
将100μl原生质体悬浮液与5-25μg在10μlSTC中的适宜DNA混合。用含有所需结构基因(见表1)的表达载体和含有选择性标记的质粒共转化各菌株。质粒pToC90和pToC186含有构巢曲霉amdS基因，用其进行转化，然后在以乙酰胺为唯一氮源的培养基上生长筛选。用质粒pJaL77和pJaL154转化，然后筛选潮霉素B抗性。
将混合物在室温放置25分钟。加入0.2ml 60％PEG4000(BDH29576)，10mM CaCl2和10mM Tris-HCl pH＝7.5，仔细混合两次，最后加入0.85ml相同的溶液并仔细混合。将混合物在室温放置25分钟，以2500Xg离心15分钟，然后将颗粒重悬于2ml1.2M山梨醇中。在沉淀一次以上后，将原生质体铺在适宜的平皿上。将原生质体铺在含有1.0M蔗糖，pH＝7.0 10mM乙酰胺为氮源(若amdS为选择性标记)和20mM CsCl的基本培养基(Cove，Biochem.Biophys.Acta 11351-56，1966)中以抑制背景生长。若hygB为选择性标记，则使用10mM硝酸钠为氮源，并存在150μg/ml潮霉素B。作为最终离心，重悬和铺展步骤的另一种方案，可以加入8mlSTC并与原生质体混合，，然后向3个选择平皿中的每一个中加入3ml，然后旋转以覆盖平皿。于37℃培养4-7天后，捡出带有分生孢子的菌落，将其悬浮在无菌水中并铺开以分离单个菌落。重复所述过程，在第二次再分离后，单个菌落的孢子作为确定的转化体贮存。IV评估重组蛋白质的表达在上述过程后，用表1中的表达载体之一和在上述实施例中提到的含有选择性标记的质粒共转化所选菌株的单个分离物。然后用适宜的检测方法检测各共转化体以确定是否表达了所需的基因。
A脂酶在含50g/l麦芽糊精，2g/lMgSO4·7H2O2g/l，KH2PO4，3g/lK2SO4，4g/l柠檬酸，8g/l酵母提取物，3g/l(NH4)2SO4，0.5ml痕量金属溶液，4ml50％脲溶液(单独高压灭菌)，1l蒸馏水，pH6.0的M400Da培养基中培养有关脂酶活性的共转化体，用tap水将5g/l酵母提取物制成800ml。在高压灭菌前将pH调到4.5。灭菌后，加入166ml过滤灭菌的1M脲(以得到10/l的终浓度)和35.3ml过滤灭菌的1M NaNO3(以得到0.3％的终浓度)。
以对-硝基苯基丁酸酯(pNB)为底物检测培养过滤物中的脂酶活性。通过将104.6μlpNB加到5mlDMSO中而制备pNB原液。将90μl50mM Tris，pH7.加到微滴定板的各孔中。向各孔加入10μl样品，将微滴定板振荡约1分钟而混合。在正要检测前，将20μlpNB原液与970μl50mMTris缓冲液(pH7)合在一起，然后混合。在将要用市售的平皿阅读器检测脂酶活性前，将100μlpNB-Tris混合物加到各样品孔中，3分钟后于405nm测量吸收值。检测是温度敏感型的，因此各样品组均使用内标。各样品确定的斜率直接与脂酶活性相关；检测的线性范围为约0.005-5μg/ml。在这种类型的检测中，确定了H.lanuginosa脂酶的比活性为约4000LU/mg，而假丝酵母脂酶A的比活性为约400LU/mg。
B木聚糖酶在含有下列组分的培养基中生长所有的木聚糖酶转化体，以g/l计麦芽糊精50；MgSO4·7H2O，2.0；KH2PO4，10.0；K2SO4，2.0；柠檬酸2.0；酵母提取物，10.0；AMG痕量金属溶液，0.5ml；脲，2.0；pH6.0。所有转化体均在34℃作为浸没的搅拌培养物长长。
用在柠檬酸盐磷酸盐缓冲液，pH6.5中悬浮的0.2％AZCL-木聚糖(Megazyme Co.Australia)确定在培养液中的木聚糖酶活性。将培养液通常稀释100倍，然后将10μl稀释的培养液与1mlo.2％AZCL-木聚糖底物混合。于42℃将混合物保温30分钟。每膈5分钟将反应混合物混匀。在保温结束时，以10000rpm离心5分钟沉淀未消化的底物。用在595nm的吸收值定量分析从该底物释放的蓝色染料，然后从已知活性的酶制剂制成的标准计算在培养液中的酶活性的量。根据在相同条件下制备的酶标准确定内木聚糖酶单位(EXU)。
C纤维素酶在MY50培养基(50g/l麦芽糊精，2g/lMgSO4·7H2O，10g/lKH2PO4，2g/lK2SO4，2g/l柠檬酸，10g/l酵母提取物，0.5ml痕量金属，2.0g脲)中，于34℃时纤维素酶转化体生长为浸没的培养物。
用悬浮在0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH6.5)中的0.2％AZCL-HE-纤维素(Megazyme)为底物，测量纤维素酶活性。用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH6.5稀释培养物，将10μl稀释的培养液与1ml0.2％AZCL-HE-纤维素混合。在42℃将混合物保温30分钟，同时每膈5分钟振荡。保温后，以10000rpm离心5分钟沉淀未消化的底物。在595nm分光光度计定量测量上清液中的蓝色，然后从用已知纤维素酶标准制作的标准曲线确定酶活性的量。根据在相同条件下制成的酶标准确定内纤维素酶单位(ECU)。
D过氧化物酶在含有50g/l麦芽糊精，2g/lMgSO4·7H2O2g/lKH2PO4，3g/lK2SO4，4g/l柠檬酸，8g/l酵母提取物，3g/l(NH4)2SO4，0.5ml痕量金属溶液，4ml50％脲溶液(分别高温灭菌)，在1l蒸馏水，pH6.0的M400Da培养基中培养CiP共转化体。
用ABTS为底物或用与已知浓度标准相比的火箭免疫电泳监测过氧化物酶表达。对于免疫扩散，在TM缓冲液(1.3g/lTrisbase，0.6g/l马来酸，pH7)中融解1％琼脂糖，然后冷却到55℃。将400μl抗CiP的兔抗血清与15ml琼脂糖混合，铺展，固化在10cm×10cm的平皿上。将于37℃，在CDM中生长了7天的CiP转化体的CDM琼脂(1g/l K2SO4，30g/l蔗糖，0.3g/l NaNO3，0.05g/lKCl，0.05g/lMgSO4·7H2O，0.001g/l FeSO4·7H2O，0.001g/lZnSO47H2O，0.0005g/l CuSO4·5H2O，20g/l麦芽糊精，15g/l琼脂糖)培养样品用于在琼脂平皿中制成的5 mm孔中。使蛋白质扩散48小时。用考马斯蓝R将平皿染色，一般肉眼观察蛋白质-抗体沉淀区。作为标准溶液，在浓度为500，1000，和2000过氧化物酶单位(PODU)/ml使用纯化的；1PODU是在标准条件下每分钟催化1μmol过氧化氢的酶量。
为了用ABTS(2，2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)方法确定过氧化物酶，将2ml2mM ABTS[0.110gABTS，Boehringer Mannheim No.102946在0.1 M磷酸盐缓冲液(10.63g Na2HPO4·2H2O p.a.M6580，5.49KH2PO4p.a.M4873，加软化水至1l)在30℃预热10分钟。在玻璃试管中，向其中加入10.6mMH2O2溶液(1.0g Perhydrol Suprapur 30％H2O2 Merck7298在达25ml的软化水中)，和0.2ml样品或标准(标准＝5.0mgKem-En-Tec，1级，No.4140A在达25ml的磷酸盐缓冲液中，稀释400倍)。于30℃反应3分钟。在418nm对milli Q软化水测量样品的吸收值，测量3分钟。通过吸收值的差异给出过氧化物酶活性的最佳反映ΔA＝A(75秒)-A(15秒)。吸收值的差异对应于样品中的0.05-0.1 PODU/ml应在0.15-0.30之间。
E角质酶。在三丁酸甘油酯琼脂(13％麦芽糊精，0.3％MgSO4·7H2O，0.5％KH2PO4，0.4％柠檬酸，0.6％K2SO4，0.5％酵母提取物，1％三丁酸甘油酯，1％脲，0.3％NaNO30.5ml痕量金属，2％琼脂，pH4.5)筛选所选的转化体生产细胞外角质酶的能力，通过三丁酸甘油酯的澄清来检测。
在37℃用M400Da培养基(见上文所述)在振荡烧瓶培养中评估产生最大澄清区的菌株。按如上所述，用对硝基苯基丁酸酯确定细胞外角质酶活性。在所有的转化体中，产量最高的角质酶生产菌株是称为CBS 103.14/CaHj427.1的臭曲霉CBS103.14转化体。在振荡烧瓶培养的3天中，所述转化体生产的细胞为角质酶的水平大约等于由米曲霉对照转化体Qu-1-1生产的量。在小规模(2升)培养中，所述转化体生产约1克/升的细胞外角质酶。VI结果和讨论表2总结了由本发明不同宿主生产的各种异源真菌酶的表达水平。从表中可以看出，所有菌株均成功地表达了至少一种所需的基因。在几种情况下，新宿主菌株产生了意想不到的高水平的酶。例如，至少有一个臭曲霉菌株在振荡烧瓶培养液(约1g/l)中，产生了令人惊奇的高水平的HLL，表明这些种能够表达大量的异源蛋白质。事实上，由这些转化体生产的HLL的生产水平看起来与最佳初级米曲霉转化体，例如HL-23的一样高或比其高。相似的，两个菌株以相似高水平表达脂酶B。
与米曲霉，臭曲霉也是一种优秀的木聚糖酶生产宿主。这种酶的振荡烧瓶产率大约是最佳米曲霉转化体中所见到的水平的2倍。
表2在臭曲霉中表达真菌酶<
<p>正如从所列的数据中可以看到的，许多臭曲霉菌株均可以生产显著量的各种异源蛋白质，因此确定作为标准黑曲霉和米曲霉宿主系统的替代物是有用的，而且在一些情况下，与使用这些已知的宿主相比，可能更好。
生物材料的保藏下列生物材料已保藏在Agricultural ResearchService Culture Collection(NRRL)1815North UniversityStreet，Peoria，Illinois 61604。细胞系 登记号含有pJVi9的E.coli DH5αNRRL B-21161含有pCaHJ418的E.coli DH5α NRRL B-21162含有pMT1229的E.coli DH5αNRRL B-21163含有pAXX40-1-1的E.coli DH5α NRRL B-21164含有pMHan37的E.coli DH5αNRRL B-21165臭曲霉E46 NRRL B-21167
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)名尔Novo Nordisk Biotech，Inc.
(B)街道1445 Drew Avenue(C)城市Davis，california(D)国家United states of America(E)邮政编码(ZIP)95616-4880(F)电话(916)757-8100(G)电传(916)757-0317(ii)发明题目臭曲霉表达系统(iii)序列数目4(iv)相应地址(A)收件人Novo Nordisk of North America，Inc.
(B)街道405 Lexington Avenue，Suite 6400(C)城市New York(D)洲New York(E)国家USA(F)邮政编码1017 4-62 01(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBN PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS
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Trp Ser Asp Gly Gly Gly Gln Val Gln50 55 60TAC ACC AAC CTC GAG GGC AGC CGC TAC CAG GTC AGA TGG CGT AAC ACC359Tyr Thr Ash Leu Glu Gly Ser Arg Tyr Gln Val Arg Trp Arg Asn Thr65 70 75GGC AAC TTC GTC GGT GGT AAG GGT TGG AAC CCG GGA ACC GGC CGC ACG407Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Thr Gly Arg Thr80 85 90ATC AAC TAC GGC GGC TAC TTC AAC CCC CAG GGC AAC GGC TAC CTG GCC455Ile Asn Tyr Gly Gly Tyr Phe Asn Pro Gln Gly Asn Gly Tyr Leu Ala95 100 105 110GTC TAC GGC TGG ACC CGC AAC CCG CTC GTC GAG TAC TAT GTC ATC GAG503Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Ile Glu115 120 125TCG TAC GGC ACG TAC AAT CCC GGC AGC CAG GCT CAG TAC AAG GGC ACA551Ser Tyr Gly Thr Tyr Asn Pro Gly Ser Gln Ala Gln Tyr Lys Gly Thr130 135 140TTC TAT ACC GAC GGC GAT CAG TAT GAC ATC TTT GTG AGC ACC CGC TAC 599Phe Tyr Thr Asp Gly Asp Gln Tyr Asp Ile Phe Val Ser Thr Arg Tyr145 150 155AAC CAG CCC AGC ATC GAC GGC ACC CGG ACG TTC CAG CAG TAC TGG TCT 647Asn Gln Pro Ser Ile Asp Gly Thr Arg Thr Phe Gln Gln Tyr Trp Ser160 165 170ATC CGC AAG AAC AAG CGT GTC GGA GGC TCG GTC AAC ATG CAG AAC CAC 695Ile Arg Lys Asn Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Asn Met Gln Asn His175 180 185 190TTC AAC GCG TGG CAG CAG CAC GGA ATG CCG CTC GGC CAG CAC TAC TAC 743Phe Asn Ala Trp Gln Gln His Gly Met Pro Leu Gly Gln His Tyr Tyr195 200 205CAG GTC GTC GCC ACC GAG GGC TAC CAG AGC AGT GGC GAG TCC GAC ATC 791Gln Val Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Glu Ser Asp Ile210 215 220TAT GTT CAG ACA CAC TAAGCGACGC ACCCCGCATG ACAAAAGTCC GTTAGTTACA 846Tyr Val Gln Thr His225TGCCGGGTGA AAAGGAGCTA TGCTATGGGC GCGGCAAGAC AGTCACTGCC ATCATGTCAG 906TCGGAAAAAC ATCGCAGAAT GGTGTTCTTC CGCATGGGAA TTGCCTGAGA CATCTCTCTG 966GCCATGCATT TTCTTGTTCA TACTTGTTGG GCAGTCGCTT GGTTGCCTAC CTCTGTTTAT1026AGTCATTCTT TTTCTGTACA TACTTCTTCC TCAACTTTAG AGCACACTGG CGGCCGCTCG1086AGCATGCATC TAGAGGGCCG CATCATGTAA TTAGTTA 1123(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度227个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Val Ser Leu Lys Ser Val Leu Ala Ala Ala Thr Ala Val Ser Ser1 5 10 15Ala Ile Ala Ala Pro Phe Asp Phe Val Pro Arg Asp Asn Ser Thr Ala20 25 30Leu Gln Ala Arg Gln Val Thr Pro Asn Gly Glu Gly Trp His Asn Gly35 40 45Tyr Phe Tyr Ser Trp Trp Ser Asp Gly Gly Gly Gln Val Gln Tyr Thr50 55 60Asn Leu Glu Gly Ser Arg Tyr Gln Val Arg Trp Arg Asn Thr Gly Asn65 70 75 80Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Asn85 90 95Tyr Gly Gly Tyr Phe Asn Pro Gln Gly Asn Gly Tyr Leu Ala Val Tyr100 105 110Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr115 120 125Gly Thr Tyr Asn Pro Gly Ser Gln Ala Gln Tyr Lys Gly Thr Phe Tyr130 135 140Thr Asp Gly Asp Gln Tyr Asp Ile Phe Val Ser Thr Arg Tyr Asn Gln145 150 155 160Pro Ser Ile Asp Gly Thr Arg Thr Phe Gln Gln Tyr Trp Ser Ile Arg165 170 175Lys Asn Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Asn Met Gln Asn His Phe Asn180 185 190Ala Trp Gln Gln His Gly Met Pro Leu Gly Gln His Tyr Tyr Gln Val195 200 205Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Glu Ser Asp Ile Tyr Val210 215 220Gln Thr His225(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度1307个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iv)反义无(vi)来源(A)生物Coprinus cinereus(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置5...1096(xi)序列描述SEQ ID NO3TACT ATG AAG CTC TCG CTT TTG TCC ACC TTC GCT GCT GTC ATC ATC GGT 49Met Lys Leu Ser Leu Leu Ser Thr Phe Ala Ala Val Ile Ile Gly1 5 10 15GCC CTC GCT CTA CCC CAG GGT CCT GGA GGA GGC GGG TCA GTC ACT TGC97Ala Leu Ala Leu Pro Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys20 25 30CCC GGT GGA CAG TCC ACT TCG AAC AGC CAG TGC TGC GTC TGG TTC GAC 145Pro Gly Gly Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp35 40 45GTT CTA GAC GAT CTT CAG ACC AAC TTC TAC CAA GGG TCC AAG TGT GAG 193Val Leu Asp Asp Leu Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu50 55 60AGC CCT GTT CGC AAG ATT CTT AGA ATT GTT TTC CAT GAC GCG ATC GGA 241Ser Pro Val Arg Lys Ile Leu Arg Ile Val Phe His Asp Ala Ile Gly65 70 75TTT TCG CCG GCG TTG ACT GCT GCT GGT CAA TTC GGT GGT GGA GGA GCT 289Phe Ser Pro Ala Leu Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala80 85 90 95GAT GGC TCC ATC ATT GCG CAT TCG AAC ATC GAA TTG GCC TTC CCG GCT 337Asp Gly Ser Ile Ile Ala His Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala100 105 110AAT GGC GGC CTC ACC GAC ACC GTC GAA GCC CTC CGC GCG GTC GGT ATC 385Asn Gly Gly Leu Thr Asp Thr Val Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile115 120 125AAC CAC GGT GTC TCT TTC GGC GAT CTC ATC CAA TTC GCC ACT GCC GTC 433Asn His Gly Val Ser Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Thr Ala Val130 135 140GGC ATG TCC AAC TGC CCT GGC TCT CCC CGA CTT GAG TTC TTG ACG GGC 481Gly Met Ser Asn Cys Pro Gly Ser Pro ArG Leu Glu Phe Leu Thr Gly145 150 155AGG AGC AAC AGT TCC CAA CCC TCC CCT CCT TCG TTG ATC CCC GGT CCC 529Arg Ser Asn Ser Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro160 165 170 175GGA AAC ACT GTC ACT GCT ATC TTG GAT CGT ATG GGC GAT GCA GGC TTC 577Gly Asn Thr Val Thr Ala Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe180 185 190AGC CCT GAT GAA GTA GTT GAC TTG CTT GCT GCG CAT AGT TTG GCT TCT 625Ser Pro Asp Glu Val Val Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser195 200 205CAG GAG GGT TTG AAC TCG GCC ATC TTC AGG TCT CCT TTG GAC TCG ACC 673Gln Glu Gly Leu Asn Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr210 215 220CCT CAA GTT TTC GAT ACC CAG TTC TAC ATT GAG ACC TTG CTC AAG GGT 721Pro Gln Val Phe Asp Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Lys Gly225 230 235ACC ACT CAG CCT GGC CCT TCT CTC GGC TTT GCA GAG GAG CTC TCC CCC 769Thr Thr Gln Pro Gly Pro Ser Leu Gly Phe Ala Glu Glu Leu Ser Pro240 245 250 255TTC CCT GGC GAA TTC CGC ATG AGG TCC GAT GCT CTC TTG GCT CGC GAC 817Phe Pro Gly Glu Phe Arg Met Arg Ser Asp Ala Leu Leu Ala Arg Asp260 265 270TCC CGA ACC GCC TGC CGA TGG CAA TCC ATG ACC AGC AGC AAT GAA GTT 865Ser Arg Thr Ala Cys Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val275 280 285ATG GGC CAG CGA TAC NNN NNN NNC ATG GCC AAG ATG TCT GTT CTC GGC 913Met Gly Gln Arg Tyr Xaa Xaa Xaa Met Ala Lys Met Ser Val Leu Gly290 295 300TTC GAC AGG AAC GCC CTC ACC GAT TGC TCT GAC GTT ATT CCT TCT GCT 961Phe Asp Arg Asn Ala Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Ser Ala305 310 315GTG TCC AAC AAC GCT GCT CCT GTT ATC CCT GGT GGC CTT ACT GTC GAT 1009Val Ser Asn Asn Ala Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp320 325 330 335GAT ATC GAG GTT TCG TGC CCG AGC GAG CCT TTC CCT GAA ATT GCT ACC 1057Asp Ile Glu Val Ser Cys Pro Ser Glu Pro Phe Pro Glu Ile Ala Thr340 345 350GCC TCA GGC CCT CTC CCC TCC CTC GCT CCT GCT CCT TGATCTCCTC 1103Ala Ser Gly Pro Leu Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro355 360AAGATGGTAC ATCCTGCTCT CTCATCATCC CTCTTAGCTA TTTATCCAAT CTATCTACCT 1163ATCTATGCAG TTTCTGTTCT ATCACCACAG GAAGCAAGAA AGAAAAACAA CAATGCAACG 1223TGAGCAGAAA TCAGCAAAAA AATAAATCAG TATACTACAG TAATGAGGCC AGTTTGCGTG 1283GTGTCAGAAG TAAGTACGAC TCGG 1307(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征
(A)长度363个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Leu Ser Leu Leu Ser Thr Phe Ala Ala Val Ile Ile Gly Ala1 5 10 15Leu Ala Leu Pro Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys Pro20 25 30Gly Gly Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp Val35 40 45Leu Asp Asp Leu Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu Ser50 55 60Pro Val Arg Lys Ile Leu Arg Ile Val Phe His Asp Ala Ile Gly Phe65 70 75 80Ser Pro Ala Leu Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp85 90 95Gly Ser Ile Ile Ala Mis Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala Asn100 105 110Gly Gly Leu Thr Asp Thr Val Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile Asn115 120 125His Gly Val Ser Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Thr Ala Val Gly130 135 140Met Ser Asn Cys Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu Phe Leu Thr Gly Arg145 150 155 160Ser Asn Ser Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro Gly165 170 175Asn Thr Val Thr Ala Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser180 185 190Pro Asp Glu Val Val Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser Gln195 200 205Glu Gly Leu Asn Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr Pro210 215 220Gln Val Phe Asp Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Lys Gly Thr225 230 235 240Thr Gln Pro Gly Pro Ser Leu Gly Phe Ala Glu Glu Leu Ser Pro Phe245 250 255Pro Gly Glu Phe Arg Met Arg Ser Asp Ala Leu Leu Ala Arg Asp Ser260 265 270Arg Thr Ala Cys Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val Met275 280 285Gly Gln Arg Tyr Xaa Xaa Xaa Met Ala Lys Met Ser Val Leu Gly Phe290 295 300Asp Arg Asn Ala Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Ser Ala Val305 310 315 320Ser Asn Asn Ala Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp325 330 335Ile Glu Val Ser Cys Pro Ser Glu Pro Phe Pro Glu Ile Ala Thr Ala340 345 350Ser Gly Pro Leu Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro355 360
权利要求
1含有与启动子可操作相连的编码异源酶的核酸序列的臭曲霉宿主细胞。
2权利要求1的宿主细胞，其中所述酶选自过氧化氢酶，漆酶，酚氧化酶，氧化酶，氧化还原酶，纤维素酶，木聚糖酶，过氧化物酶，脂酶，水解酶，酯酶，角质酶，蛋白酶和其他蛋白水解酶，氨肽酶，羧肽酶，植酸酶，裂解酶，果胶酶和其他果胶水解酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，甘露糖苷酶，异构酶，蔗糖酶，转移酶，核糖核酸酶，几丁质酶和脱氧核糖核酸酶。
3权利要求1的宿主细胞，其中所述启动子是真菌启动子。
4权利要求1的宿主细胞，其中所述蛋白质是真菌酶。
5权利要求1的宿主细胞，还含有选择性标记。
6权利要求5的宿主细胞，其中所述标记选自argB，trpC，pyrG，amdS和hygB。
7权利要求3的宿主细胞，其中所述启动子选自米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂酶。
8臭曲霉宿主细胞，含有编码与真菌启动子和选择性标记可操作相连的异源真菌酶的核酸序列。
9权利要求8的细胞，其中所述酶选自过氧化氢酶，漆酶，酚氧化酶，氧化酶，氧化还原酶，纤维素酶，木聚糖酶，过氧化物酶，脂酶，水解酶，酯酶，角质酶，蛋白酶和其他蛋白水解酶，氨肽酶，羧肽酶，植酸酶，裂解酶，果胶酶和其他果胶水解酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，甘露糖苷酶，异构酶，蔗糖酶，转移酶，核糖核酸酶，几丁质酶和脱氧核糖核酸酶。
10权利要求9的宿主细胞，含有选自脂酶，木聚糖酶和纤维素酶的真菌酶。
11权利要求8的宿主细胞，其中所述启动子选自来自米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂酶的启动子。
12权利要求8的宿主细胞，其中所述选择性标记选自argB，trpC，pyrG，amdS和hygB。
13权利要求8的宿主细胞含有与TAKA-淀粉酶启动子可操作相连的编码真菌脂酶的核酸序列，而且还含有amdS标记。
14权利要求8的宿主细胞，含有编码与TAKA淀粉酶启动子或AMG启动子可操作相连的真菌木聚糖酶的核酸序列，而且还含有amdS或hygB标记。
15生产所需的蛋白质的方法，包括在可以表达所述蛋白质的条件下培养含有编码与启动子可操作相连的异源蛋白质的核酸序列的臭曲霉宿主细胞，然后从培养液中回收所述蛋白质。
16权利要求15的方法，其中所述蛋白质是真核酶。
17权利要求15的方法，其中所述启动子是真菌启动子。
18权利要求16的方法，其中所述蛋白质是真菌酶。
19权利要求16的方法，其中所述酶选自过氧化氢酶，漆酶，酚氧化酶，氧化酶，氧化还原酶，纤维素酶，木聚糖酶，过氧化物酶，脂酶，水解酶，酯酶，角质酶，蛋白酶和其他蛋白水解酶，氨肽酶，羧肽酶，植酸酶，裂解酶，果胶酶和其他果胶水解酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，甘露糖苷酶，异构酶，蔗糖酶，转移酶，核糖核酸酶，几丁质酶和脱氧核糖核酸酶。
20权利要求15的方法，还包括一选择性标记。
21权利要求20的方法，其中所述标记选自argB，trpC，pyrG，amdS和hygB。
22权利要求15的方法，其中所述启动子选自来自米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂酶的启动子。
23含有与启动子可操作相连的编码同源酶的核酸序列的臭曲霉宿主细胞。
24生产所需蛋白质的方法，包括在可以表达所述蛋白质的条件下培养含有编码与启动子可操作相连的同源蛋白质的重组核酸序列的臭曲霉宿主细胞，然后从培养液中回收所述蛋白质。
全文摘要
本发明涉及新的表达系统，其中用臭曲霉为宿主细胞表达异源酶。
文档编号C12N9/30GK1139456SQ94194682
公开日1997年1月1日 申请日期1994年11月29日 优先权日1993年12月1日
发明者R.M.伯卡, W.犹德, S.塔卡吉, K.C.博密纳桑 申请人:诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司