专利名称：：一种土壤微生物基因组dna提取方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学
技术领域：
，具体的说是一种土壤微生物基因组DNA提取方法。
背景技术：
：土壤微生物是土壤生态系统中最具活力的组成部分，对维持土壤生态功能起重要作用。土壤微生物对土壤质量的变化非常敏感，因此，土壤微生物一直被认为是与土壤质量及可持续发展能力最为密切相关的生物学指标之一，为科学评价土壤质量变化、预测各种人类活动对土壤环境的破坏及其潜在风险提供依据.目前可在实验室培养的微生物还不到自然界中微生物总数的l%,还有相当多的菌种因为无法人工培养而未被人类所认识。分子生物学技术的引入，使研究土壤微生物生态降低了对培养技术的依赖性，而提取土壤DNA则成为开展土壤微生物分子生态学工作的前提。土壤成分复杂，含有大量的无机及有机化合物，存在着对某些酶反应的抑制剂，如腐殖酸、重金属离子等都会干扰提取反应的进行。且各种土壤类型组成不一，这些都为从土壤中有效提取高质量的DNA带来了困难。分子生物学技术研究土壤微生物群落结构的实质是用土壤微生物薩A的不均一性来反映土壤微生物的种群结构特征。因此，获得高浓度.、大片段、多样性程度高、具有代表性的土壤微生物总DNA是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础。由于土壤样品中含有较多的腐殖质酸和粘粒等抑制物质，这些物质可对内切酶消化、PCR扩增、杂交等后续操作产生强烈的影响，因而提取与纯化土壤微生物基因组总DNA在研究中尤为重要。土壤微生物基因组DNA提取分为直接和间接提取两种方法。(1)间接法从土壤中收集细胞，然后进行裂解得到DNA。此法分离得到的DNA纯度较高，但是由于微生物细胞与土壤粘附在一起，不容易分离，细胞收集过程中会丢失很多，所获得顧A量比较少。(2)直接法通过各种手段使微生物细胞在土壤中裂解，然后抽提纯化直接得到总DNA。此法获得的DNA会受到胞外DNA以及土壤中腐殖质酸等物质的污染，纯度不及间接法高，但是可以得到较多的DNA。土壤微生物分子生态学研究的基础是DNA的提取，只有提取到的頭A量大质纯，多样性程度高才能更全面真实地反映土壤中微生物的分布状态。
发明内容本发明提供了一种提取纯度高不需要核酸吸附材料进一步纯化，可直接用于PCR扩增的土壤微生物基因组DNA提取方法。为实现上述目的，本发明所釆用的技术方案为提取方法l)初步裂解微生物细胞取土壤样品与石英沙相混合放入含有850-1000W提取缓冲液的离心管中，其中土样与石英沙重量比为1:0.5-1:2;而后将离心管置于核酸提取仪内振荡40-60秒，或在涡旋混合器上振荡10-20分钟；2)进一步裂解微生物细胞将50-浓度为100mg/ml的溶菌酶加入初步裂解液中混匀，在30-4(TC温洛30-60分钟后，再加入75-125W20%(w/v)的SDS,混匀，再在60-7(TC温洛30-60分钟，10000-12000转/分钟离心10-20分钟，收集上清；3)土壤微生物基因组DNA:将裂解后的缓冲液经分离纯化得粗提DNA溶液，而后将粗提液纯化，即得土壤微生物基因组DNA。所述称取的待测土样重量为0.3-0.8g;提取缓冲液为50-120mMTris-HC1(pH8.0)、50-120mMEDTA(pH8.0)和1.0-1.6M,NaCl。所述提取缓冲液优选为100mMTris-HCl(pH8.0),100mMEDTA(pH8.0)和1.5MNaCl。所述细胞裂解液的纯化步骤2)分离后的上清液内加入其0.1-0.3倍体积的5-10MKAc,冰洛20-60分钟后，12000-14000转/分钟离心10-20分钟，收集上清，而后在上清液中加入其0.3-0.7倍体积的20°/。-60%(w/v)聚乙二醇溶液和0.1-0.3倍体积的5M-15MNaCl溶液，混匀，室温放置30分钟，离心收集DNA沉淀，70%乙醇洗涤沉淀，自然干燥后，加入500-700WTE溶解，得到粗提DNA溶液，其中聚乙二醇分子量为6000-10000。所得粗提DNA溶液用与其等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提，取上层水相；而后再用与上层水相等体积的氯仿和异戊醇的混合液抽提，取上层水相；而后加入0.1-0.2倍体积的3MNaAc溶液和0.6-1.0倍体积的异丙醇溶液，混勾后室温放置30-60分钟，离心收集DNA沉淀，70%(v/v)乙醇洗涤沉淀，自然干燥后，加入30-50l^TE溶解，得到DNA溶液；其中酚、氯仿和异戊醇按体积份数比为25:24:1,氯仿和异戊醇按体积份数比为24:1。本发明所具有的优点1.提取产物纯度高，本发明通过核酸提取仪或涡旋混合器振荡进行细胞破碎，并通过二次细胞裂解和二次纯化，得到高纯度基因组DNA可直接用于PCR的扩增。2.提取成本低，本发明在提取土壤微生物基因组顧A的过程中，不需使用商品化的纯化试剂盒进行纯化，因而降低了成本。3.适用范围广，可用于多种土壤、活性污泥以及水体沉淀物等样品中微生物基因组DNA的提取。图1为三种方法所得DNA电泳图谱；其中l为本发明，2为利用美国Q-BIOGENE公司生产的FastDNASPINforsoilKIT,3为周氏方法，M为Marker入-HindIII,最大片段为23.13Kb。图2为以三种方法提取DNA为摸板的PCR结果图，其中1、2为本发明提取的基因组DNA，3、4为釆用美国Q-BIOGENE公司生产的FastDNASPINforsoilKIT试剂盒提取的基因组DNA，5、6为周氏方法提取的基因组DNA,M为MarkerDL2000。图3为采用本发明提取4种土壤的基因组DNA电泳图谱；其中l为水稻田土，2为旱田棕土，3为草垫土，4为旱田黑土，M为Marker入-EcoT14。具体实施方式实施例1以东北农田黑土为例(参见表2),釆用三种方法提取土壤微生物基因组DNA:表2供试土壤理化性质/gkg—1釆样深度sampling有机质pHOrganicmatter全氮TotalN全磷TotalP全钾TotalK土壤颗粒(mm)物理组成(WParti%clesize(mm)depth(cm)沙粒Sand(0.01-1.0)粉粒Silt(0.001-0.01)粘粒Clay(〈0.001〉0-206.5837.832.560.6126.0051.439.626.6方法一是本发明提供的方法1)初步裂解微生物细胞取0.5g土与0.5g石英沙放入1.5ml旋盖离心管，加入提取缓冲液，用核酸提取仪(美国Q-biogene公司，型号FP220)振荡40S,震荡速度为5.5m/s。2)进一步裂解微生物细胞将浓度为100mg/ml的溶菌酶加入初步裂解的细胞液中混匀，37。C温洛30min后，再加入100W20%(w/v)的SDS,混匀，再在65。C温浴30min，而后以].2000转/分钟，室温离心5min，收集上清；3)初步纯化裂解液步骤2)分离后的上清液内加入其0.2倍体积的8MKAc,冰洛20min后，以14000转/分钟，l(TC下离心20min，收集上清，而后在上清液中加入其0.5倍体积的20y。(w/v)分子量为8000的聚乙二醇溶液和0.1倍体积的5MNaCl溶液，混勻，室温放置30min,以14000转/分钟，l(TC下离心20min,收集DNA沉淀，而后用70%乙(v/v)醇洗涤沉淀2次，自然干燥后，加入500mTE溶解，得到粗提腿A溶液，所述TE溶液为10mMTris和lmMEDTA，pH8.0;70%乙醇为4。C预冷；异丙醇为4°C预冷。4)进一步纯化裂解液将所得粗提DNA溶液用与其等体积的酴、氯仿和异戊醇的混合液抽提，取上层水相；而后再用与上层水相等体积的氯仿和异戊醇的混合液抽提，取上层水相；而后加入上层水相0.l倍体积的3MNaAc溶液和0.6体积的倍异丙醇溶液，混匀后室温放置30min,以14000转/分钟，l(TC下离心20min,收集DNA沉淀，70%(v/v)乙醇洗涤沉淀，自然干燥后，加入50WTE溶解，得到DNA溶液；其中酚、氯仿和异戊醇按体积份数比为25:24:1,氯仿和异戊醇按体积份数比为24:1,所述TE溶液为lOmMTris和lmMEDTA,pH8.0。5)测定所得DNA溶液浓度及纯度，并用琼脂糖电泳检测目的DNA片段大小及纯度。琼脂糖凝胶浓度为0.6%,电压50V,电泳2小时，EB染色30分钟；检测提取核酸的浓度和纯度使用美国Bio-Rad公司生产的核酸-蛋白含量测定仪(SmartSpecPlusSpectrophotometer)。方法二利用美国Q-BI0GENE公司生产的FastDNASPINforsoilKIT进行提取(提取方法见使用说明书)方法三周氏方法(ZhouJZ,MaryAB.TiedjeJM.1996.DNArecoveryfromsoilsofdiversitycomposition.ApplEnvironMicrobiol。62(2):316-322)表1.三种方法所得DM浓度及纯度<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表l可知，方法1所提取的土壤基因组薩A产量最少，但产物的纯度接近试剂盒所提取的结果，方法三提取的DNA产量最高，但其纯度最低，含有大量腐殖质等杂质，因而方法三提取产物必须经过核酸纯化试剂盒纯化后才能扩增出产物来。由图1可以看出，方法一的产物条带较为整齐，方法二的碎片段较多，方法三的产物杂质较多，三种方法均可得到大片段的基因组DNA。实施例2以实施例1三种方法所提取的基因组DNA为摸板，扩增16SrRNA基因部分片段，PCR扩增引物为27F:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'519R:5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，在前引物5'端加上一个GC夹5,-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcccggggg-3,。PCR反应体系为buffer溶液为lOOmMTris、lOOmMEDTA和1.5MNaCl,pH8.0;MgCl2反应终浓度2.0mM;dNTP反应终浓度0.2mM;前引物Pl反应终浓度0.5幽；后引物P2反应终浓度0.5南；Taq酶(Takara公司)1U;反应才^板1W;反应体系总量25吣。PCR反应条件预变性94°C,5min;变性94°C,10s，退火63°C,30s,10次循环，每次循环退火温度下降1°C。延伸68°C,2min;变性94°C,2min,退火53°C，30s,25次循环；延伸68°C,2rain;末次延伸68°C,10min。(参见图2)由图2所知直接以方法三提取的土壤基因组DNA进行扩增没有得到产物，釆用试剂盒(PromegaWizardDNAClean-Up)纯化后再进行扩增得到了目的产物。方法一和方法二所获得DNA直接扩增出目的产物，说明方法一的提取产物不需要进一步纯化，可以直接用于PCR扩增。实施例3采用本发明的方法同时提取四种土壤水稻田土、旱田棕土、草垫土、旱田黑土，前三种土壤样品采至中科院沈阳生态所沈阳生态站，黑土釆至中科院黑龙江海伦农业生态实验站。提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为6%，电压50V，电泳2小时，同时检测提取核酸的浓度和纯度(参见表4)。表4.四种土壤基因组DNA提取结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由提取结果说明本发明提供的方法完全适合于四种土壤的基因组DNA提取，提取产量在60l^g/ml以上，0D脑m/0D2^在1.78-1.99之间,OD260nm/OD23。nm介于1.70-2.03，说明提取结果纯度较高。电泳结果(参见图3)说明所提取的DNA条带较为整齐，且碎片段较少。实施例4与实施例l不同之处在于提取方法l)初步裂解微生物细胞取O.3g土壤样品与0.15g石英沙相混合放入含有1000W提取缓冲液的离心管中，而后将离心管置于在涡旋混合器上振荡10分钟；提取缓冲液为50mMTris-HC1(pH8.0)、120mMEDTA(pH8.0)和1.0M，NaCl。2)进一步裂解微生物细胞将浓度为100mg/ml的溶菌酶加入初步裂解液中混匀，在3(TC温洛60分钟后，再加入75W20%(w/v)的SDS，混匀，再在7(TC温浴60分钟，10000转/分钟离心20分钟，收集上清；3)初步纯化裂解液步骤2)分离后的上清液内加入其0.3倍体积的5MKAc，冰洛60分钟后，12000转/分钟离心20分钟，收集上清，而后在上清液中加入其0.7倍体积的60y。(w/v)聚乙二醇溶液和0.3倍体积的15MNaCl溶液，混勻，室温放置30分钟，离心收集MA沉淀，70%乙醇洗涤沉淀，自然干燥后，加入700WTE溶解，得到粗提DNA溶液，其中聚乙二醇分子量为10000。4)进一步纯化裂解液所得粗提DNA溶液用与其等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提，取上层水相；而后再用与上层水相等体积的氯仿和异戊醇的混合液抽提，取上层水相；而后加入0.2倍体积的3MNaAc溶液和1.0倍体积的异丙醇溶液，混匀后室温放置60分钟，离心收集DNA沉淀，70°/。(v/v)乙醇洗涤沉淀，自然干燥后，加入3(^TE溶解，得到DNA溶液；其中酚、氯仿和异戊醇按体积份数比为25:24:1，氯仿和异戊醇按体积份数比为24:1。实施例5与实施例l不同之处在于1)初步裂解微生物细胞取O.8g土壤样品与1.6g石英沙相混合放入含有900W提取缓冲液的离心管中，而后将离心管置于核酸提取仪内振荡60秒；提取缓冲液为120mMTris-HCl(pH8.0)、50mMEDTA(pH8.0)和1.6MNaCl。2)进一步裂解微生物细胞将浓度为100mg/ml的溶菌酶加入初步裂解液中混匀，在3(TC温浴40分钟后，再加入125W20%(w/v)的SDS，混匀，再在6(TC温洛50分钟，11000转/分钟离心10分钟，收集上清；3)初步纯化裂解液步骤2)分离后的上清液内加入其0.3倍体积的lOMKAc，冰浴40分钟后，13000转/分钟离心15分钟，收集上清，而后在上清液中加入其0.3倍体积的40y。(w/v)聚乙二醇溶液和0.2倍体积的10MNaCl溶液，混匀，室温放置30分钟，离心收集DNA沉淀，70%乙醇洗涤沉淀，自然干燥后，加入600WTE溶解，得到粗提DNA溶液，其中聚乙二醇分子量为6000。权利要求1.一种土壤微生物基因组DNA提取方法，其特征在于按如下步骤操作:1)初步裂解微生物细胞:取土壤样品与石英沙相混合放入含有850-1000μl提取缓冲液的离心管中，其中土样与石英沙重量比为1:0.5-2；而后将离心管置于核酸提取仪内振荡40-60秒，或在涡旋混合器上振荡10-20分钟；2)进一步裂解微生物细胞:将50-100μl浓度为100mg/ml的溶菌酶加入初步裂解液中混匀，在30-40℃温浴30-60分钟后，再加入75-125μl20％(w/v)的SDS，混匀，再在60-70℃温浴30-60分钟，10000-12000转/分钟离心10-20分钟，收集上清；3)土壤微生物基因组DNA:将裂解后的缓冲液经分离纯化得粗提DNA溶液，而后将粗提液纯化，即得土壤微生物基因组DNA。2.按权利要求1所述的土壤微生物基因组DNA提取方法，其特征在于所述称取的待测土样重量为0.3-0.8g;提取缓冲液为50-120mMTris-HCl、50-120mMEDTA和1.0-1.6M,NaCl。3.按权利要求1所述的土壤微生物基因组DNA提取方法，其特征在于所述提取缓冲液优选为100mMTris-HCl，100mMEDTA和1.5MNaCl。4.按权利要求1所述的土壤微生物基因组顧A提取方法，其特征在于所述细胞裂解液的纯化步骤2)分离后的上清液内加入其0.1-0.3倍体积的5-lOMKAc,冰浴20-60分钟后，12000-14000转/分钟离心10-20分钟，收集上清，而后在上清液中加入其0.3-0.7倍体积的2(T/。-60y。(w/v)聚乙二醇溶液和0.1-0.3倍体积的5M-15MNaCl溶液，混匀，室温放置30分钟，离心收集DNA沉淀，70°/。(v/v)乙醇洗涤沉淀，自然干燥后，加入500-70(HUTE溶解，得到粗提DNA溶液，其中聚乙二醇分子量为6000-10000。5.按权利要求1或4所述的土壤微生物基因组DNA提取方法，其特征在于所得粗提DNA溶液用与其等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提,取上层水相；而后再用与上层水相等体积的氯仿和异戊醇的混合液抽提，取上层水相；而后加入0.1-0.2倍体积的3MNaAc溶液和0.6-1.0倍体积的异丙醇溶液，混匀后室温放置30-60分钟，离心收集DNA沉淀，70°/。(v/v)乙醇洗涤沉淀，自然干燥后，加入30-5(mTE溶解，得到DNA溶液；其中酚、氯仿和异戊醇按体积份数比为25:24:1,氯仿和异戊醇按体积份数比为24:1。全文摘要本发明涉及分子生物学
技术领域：
，具体的说是一种土壤微生物基因组DNA提取方法。具体将土壤样品与石英沙相混合放入提取缓冲液中，而后将离心管置于核酸提取仪内振荡40-60秒，或在涡旋混合器上振荡10-20分钟；加将50-100μl溶菌酶，30-40℃温浴30-60分钟后，再加入75-125μlSDS混匀，再在50-60℃温浴30-60分钟，离心得上清液；经进一步分离纯化，即得土壤微生物基因组DNA。采用本发明方法提取的土壤基因组DNA纯度高，OD<sub>260nm</sub>/OD<sub>280nm</sub>值可达1.6以上，产量可达100ug/ml，全程用时约10小时；整个过程中不需用纯化试剂盒进一步纯化，可以直接应用于PCR扩增，以所得DNA为模板，可以顺利扩增出目的产物。文档编号C12N15/31GK101372689SQ200710012539公开日2009年2月25日申请日期2007年8月22日优先权日2007年8月22日发明者吴敏娜,张惠文,张成刚,李新宇,苏振成申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所