一种使用自杀性载体去除大肠杆菌Nissle菌内隐秘质粒的方法
【专利摘要】本发明涉及一种使用自杀性载体去除大肠杆菌Nissle菌内隐秘质粒的方法，该方法是将自杀性载体与待去除的隐秘质粒构建成重组自杀质粒，所述自杀性载体具有抗性筛选标记和自杀载体特性；用构建的重组自杀质粒转化大肠杆菌Nissle，通过抗性筛选得到仅携带重组自杀质粒的大肠杆菌Nissle；再利用自杀性载体的自杀特性筛选出丢失重组自杀质粒的大肠杆菌Nissle，从而获得去除了隐秘质粒的大肠杆菌Nissle。本发明不存在常规使用的化学、物理方法对宿主菌造成的不良影响。本方法不会对宿主菌的基因组造成影响，亦不会影响宿主菌已知的生物学特性。
【专利说明】一种使用自杀性载体去除大肠杆菌N i SS I e菌内隐秘质粒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及到生物技术应用领域，具体涉及到宿主菌携带的隐秘质粒的消除。利用重组自杀质粒具有竞争性抑制细菌内隐秘质粒复制、重组自杀质粒自身去除简便以及不影响宿主菌基因组和自身生物学特性性状的特点，实现宿主菌原有隐秘质粒完全去除的新方法。
【背景技术】
[0002]质粒的主要类型有致育因子(fertility factor, F因子)、抗性因子(resistancefactor, R 因子)、产细菌素的质粒(bacteriocin producing plasmid)、毒力质粒(virulence plasmid)、代谢性质粒(metabolic plasmid)、隐秘质粒(cryptic plasmid)等。隐秘质粒不显示任何表型效应，他们的存在只有通过物理学方法才能发现，例如凝胶电泳检测细胞提取液等方法。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体。
[0003]常见的质粒去除技术包括使用化学方法、物理方法及分子生物学方法。化学方法可以用一定浓度的表面活性剂SDS、嵌合染料、抗生素或中药等处理。物理方法有逐级高温法、紫外线照射、电穿孔、原生质体形成与再生等。化学和物理方法或多或少存在质粒去除不理想的情况，且对宿主菌生物学形状产生较大影响。
[0004]分子生物学方法包括使用转座子消除质粒和利用质粒不相容性消除质粒等方法。分子生物学方法在消除质粒上具有一定的优势，但也都存在着自身的局限性。本方法属于利用质粒不相容性消除质粒的衍生技术。
【发明内容】
[0005]本文申请的技术建立在质粒不相容性的基础上，待去除质粒背景相对清晰作为前提条件，引入自杀性载体作为辅助工具，使用分子生物学方法构建重组自杀质粒，再利用重组自杀质粒去除菌内原有质粒并实施自杀质粒自身消除的特性，确保原有宿主菌内质粒完全去除。
[0006]本发明一种使用自杀性载体去除大肠杆菌Nissle菌内隐秘质粒的方法，其步骤如下:将自杀性载体与待去除的隐秘质粒构建成重组自杀质粒，所述自杀性载体具有抗性筛选标记和自杀载体特性；用构建的重组自杀质粒转化宿主菌(大肠杆菌Nissle)，通过抗性筛选得到仅携带重组自杀质粒的宿主菌；再利用自杀性载体的自杀特性筛选出丢失重组自杀质粒的宿主菌，从而获得去除了隐秘质粒的大肠杆菌Nissle。
[0007]作为一个实例，所述大肠杆菌Nissle是大肠杆菌Nisslel917,大肠杆菌Nisslel917中含有pMUTl、pMUT2两个隐秘质粒，所述自杀性载体实验室常规使用的，没有任何特殊要求，如本申请中提及使用的是PRE112。
[0008]常规细菌培养使用LB液体培养基配方如下:胰蛋白胨10g，酵母浸提物5g，NaCllOg，加蒸馏水定容至1L，使用lOmol/L NaOH调pH至7.2，121°C灭菌20min备用。LB固体培养基:在每IL LB液体培养基中加入17.5g琼脂粉，1211:灭菌201^11，冷至651:混匀
后倾注干烤灭菌二重皿。
[0009]按照每30mg加入ImL无水乙醇的比例溶解氯霉素(Cm)粉末,配制30mg/mL Cm母液。使用时按照1:1000的比例加入灭菌LB培养基内混匀，制备LB (30 μ g/mL)培养基。
[0010]50g蔗糖加蒸馏水定容至IOOmL,溶解后使用Φ =0.22 μ m的灭菌滤器过滤除菌，配制50%蔗糖母液。用灭菌LB或LB (no salt)稀释至10%使用。
[0011]重组自杀性质粒构建时使用DH5 α化学感受态使用0.05Μ CaCl2溶液用常规方法制备。宿主菌需使用10%甘油制备电转化感受态细胞。
[0012]本技术存在以下优势和特点:
[0013]1、去除原有质粒，不引入新的外源质粒。2、虽然需要待去除质粒背景以及构建重组自杀质粒，但极大地扩展了应用的范围，不再局限于需要准备一整套具有不同复制原点质粒的要求，同时可以弥补一些没有相同复制原点质粒的不足。3、拥有不同的自杀性载体，在较多情况下可灵活选用更简便的方法(例如相同限制性内切酶位点的选用)构建出重组自杀质粒。4、重组自杀质粒携带宿主菌质粒自身复制原点,确保质粒去除成功。5、重组自杀质粒可选用不同的抗性筛选标记，适应范围更广。6、不存在常规使用的化学、物理方法对宿主菌造成的不良影响。本方法不会对宿主菌的基因组造成影响，亦不会影响宿主菌已知的生物学特性。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为两个重组自杀质粒载体pMUTl-pRE112和pMUT2-pRE112的构建示意图，使用载体pRE112和质粒pMU·Tl和pMUT2各自存在的唯一限制性内切酶SphI的单酶切位点构建重组自杀质粒载体pMUTl-pRE112和pMUT2_pRE112。
[0015]图2为Nisslel917隐秘质粒pMUTl去除的琼脂糖电泳图
[0016]Μ: λ -Hind III DNA Marker, 1:Nissle 菌中 pMUTl 和 pMUT2 质粒，2:携带重组质粒 pMUTl-pRE112Nissle 菌(Nisslel917/pMUTl_pRE112)中 pMUTl, pMUT2 质粒和重组质粒pMUTl-pRE112，3:重组质粒pMUTl_pRE112，4:去除pMUTl质粒但携带重组质粒pMUTl-pRE112Nissle 菌(Nisslel917 ApMUTl/pMUTl_pRE112)中 pMUT2 质粒和重组质粒pMUTl-pRE112, 5:已去除重组质粒 pMUTl_pRE112Nissle 菌(Nisslel917 Λ pMUTl)中 pMUT2质粒
[0017]图3为Nisslel917隐秘质粒pMUT2去除的琼脂糖电泳图
[0018]Μ: λ -Hind III DNA Marker, 1:携带重组质粒 pMUT2_pRE112 的 Nisslel917(Nisslel917ApMUTl/pMUT2-pRE112)菌中 pMUT2 质粒 and pMUT2_pRE112 重组质粒，在含30 μ g/mL氯霉素的LB液体第一代培养物，2:携带重组质粒pMUT2_pREl 12的Nisslel917 (Nisslel917 ΔpMUTl/pMUT2-pRE112)菌中 pMUT2 质粒 and pMUT2_pRE112 重组质粒，在含30 μ g/mL氯霉素的LB液体第二代培养物，3:去除pMUT2质粒但携带重组质粒 pMUT2-pRE112 的 Nisslel917 菌(Nisslel917ApMUTlApMUT2/pMUT2_pRE112)菌中pMUT2-pRE112重组质粒，在含30 μ g/mL氯霉素的LB液体第三代培养物，4:携带重组质粒 pMUT2-pRE112 的 Nisslel917 菌(Nisslel917 Λ pMUTl Λ pMUT2/pMUT2_pRE112)中pMUT2-pRE112重组质粒，在含10%蔗糖的LB液体培养基，5 = Nissle菌中pMUTl和pMUT2质粒，6:pMUT2-pRE112重组质粒
[0019]图4为验证Nisslel917两个隐秘质粒pMUTl和pMUT2去除的琼脂糖电泳图，M:Trans2K Plus II DNAMarker,泳道 1:完全去除两个隐秘质粒 pMUTl 和 pMUT2 的 Nissle(Nisslel917ApMUTl ApMUT2)，泳道 2:Nissle 菌中 pMUTl 和 pMUT2 两个隐秘质粒。
【具体实施方式】
[0020]著名益生菌大肠杆菌Nisslel917 (德国微生物收藏中心,位于Mascheroder Wegib, D-38124, Braunscheig, Germany。登录号为 DMS6601,)中含有 pMUTl、pMUT2 两个隐秘质粒(见美国国家生物技术信息中心NCBI的DNA序列数据库登录号，分别为A84793.1和A95448.1 )，且2个质粒在Nisslel917传代中很稳定，不易丢失。为减少上述隐秘质粒对于外源性重组质粒转化和基因组DNA操作不便，同时考虑Nisslel917作为载体菌时其隐秘质粒对人和宿主动物可能产生的不良影响。使用限制性内切酶Sph I将携带sacB的自杀性质粒载体 pRE112(美国宾夕法尼亚大学 Dr.Schifferli 提供,Department of Pathobiology,School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania,3800Spruce Street,Philadelphia, PA19104-6049, USA, Phone: (215)898-1695, EMail:dmschiffivet.upenn.edu)和隐秘质粒pMUTl、pMUT2进行重组，构建重组质粒载体pMUTl_pRE112 (简称plll2)和pMUT2-pRE112 (简称p2112)。应用竞争性抑制分别去除Nisslel917自身携带的隐秘质粒，基于自杀性质粒携带sacB基因，在含10%蔗糖的培养基平板上去除携带sacB的重组质粒，最后获得没有任何隐秘 质粒的Nisslel917大肠杆菌即Nisslel917 Λ pMUTl Λ pMUT2。
[0021]1.重组质粒载体 pMUTl-pRE112 和 pMUT2_pRE112 的构建
[0022]1.lNisslel917中2个隐秘质粒的提取
[0023]从LB平板上挑取大肠杆菌Nisslel917单菌落接种至LB液体培养基，37°C摇床震荡(150r/m)培养16-18小时，使用碱裂解法抽提质粒。使用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，切胶回收PMUTl和pMUT2质粒DNA。使用限制性内切酶Sph I消化pMUTl、pMUT2质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳观察和切胶回收质粒DNA后，分别将上述pMUTl和pMUT2质粒DNA单酶切片段去磷酸化。
[0024]1.2提取pRE112自杀性质粒DNA，同样使用Sph I酶切消化和切胶回收质粒DNA。
[0025]1.3使用T4DNA Ligase将去磷酸化pMUTl和pMUT2载体DNA分别与pRE112单酶切回收的线性质粒DNA片段连接。
[0026]1.4制备大肠杆菌DH5 α化学感受态，将连接体系转化后，加入ImL无抗性SOB培养基，37°C摇床震荡培养45分钟，涂布含氯霉素LB平板(30 μ g/mL)培养过夜。
[0027]1.5筛选阳性克隆，挑取单菌落接种液体LB (Cm, 30 μ g/mL), 37°C摇床培养16-18小时，提取质粒，使用Sph I酶切消化、电泳鉴定正确的重组质粒载体，分别切胶回收获取pMUTl-pRE112和pMUT2_pRE112重组质粒DNA。2个重组自杀质粒载体pMUTl_pRE112和pMUT2-pRE112的构建参见附图1。
[0028]2.Nisslel917 隐秘质粒 pMUTl 的去除
[0029]2.1制备Nisslel917大肠杆菌电转化感受态细胞，使用pMUTl_pRE112重组质粒DNA电转化该感受态细胞，加入ImL无抗性SOB培养基，37°C摇床震荡培养45分钟，涂布含氯霉素LB平板(30 μ g/mL)培养过夜。
[0030]2.2筛选阳性克隆，挑取单菌落接种液体LB (CnUOygAiUdTt:摇床震荡培养16-18小时，提取重组质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳观察到共含3个质粒(pMUTl、PMUT2和pMUTl-pRE112) DNA条带，大小为3177bp, 5552bp和8937bp,即为携带重组质粒pMUTl-pRE112 的 Nisslel917 (Nisslel917/pMUTl_pRE112)。
[0031]2.3 将 Nisslel917/pMUTl-pRE112 在液体 LB (Cm, 30 μ g/mL)培养 I 代后，在 LB 固体(Cm，30 μ g/mL)上盲传3代，重新挑单菌落扩大培养提取质粒DNA和电泳鉴定，发现原有的pMUTl质粒已经丢失，获得去除pMUTl质粒但携带重组质粒pMUTl-pRE112的Nisslel917菌(Nisslel917 Δ pMUTl/pMUTl_pRE112)。2.4 含 10%蔗糖 LB 液体培养Nisslel917 Δ pMUTl/pMUTl-pRE112，然后在含10%蔗糖LB平板上培养，盲传3代，温度均为30°C，挑取单菌落扩大培养提取质粒DNA和电泳鉴定pMUT 1-pRE 112丢失情况，获得已去除重组质粒pMUTl-pRE112 的 Nisslel917 菌(Nisslel917 Λ pMUTl )。Nisslel917 隐秘质粒 pMUTl 的去除参见附图2。
[0032]3.Nisslel917 隐秘质粒 pMUT2 的去除
[0033]3.1制备缺失pMUTl隐秘质粒的Nisslel917 (Nisslel917 Δ pMUTl)电转化感受态，将pMUT2-pRE112重组质粒DNA电转化该感受态，加入ImL无抗性SOB培养基，37°C摇床震荡培养45分钟，涂布氯霉素平板(30 μ g/mL)培养过夜。
[0034]3.2筛选阳性克隆，挑取单菌落接种液体LB (Cm，30 μ g/mL)，37°C摇床震荡培养16-18小时，提取质粒DNA和电泳鉴定观察到共含2个质粒(pMUT2和pMUT2_pRE112)DNA条带，大小为5552bp和11312bp,即为携带重组质粒pMUT2_pRE112的Nisslel917(Nisslel917ApMUTl/pMUT2-pRE112)。
[0035]3.3 将 Nisslel917 ApMUTl/pMUT2-pRE112 在液体 LB (Cm, 30 μ g/mL)培养 I 代后，在LB固体(Cm，30 μ g/mL)上盲传3代，重新挑单菌落扩大培养提取质粒DNA和电泳鉴定，发现原有的质粒PMUT2已经丢失，获得去除pMUT2质粒但携带重组质粒pMUT2-pRE112的Nisslel917 菌(Nisslel917ApMUTlApMUT2/pMUT2_pRE112)。
[0036]3.4 含 10% 蔗糖 LB 液体培养 Nisslel917 Δ pMUTl Δ pMUT2/pMUT2-pRE112,然后在含10%蔗糖LB平板上培养，盲传3代，温度均为30°C，挑取单菌落扩大培养提取质粒DNA和电泳鉴定检测pMUT2-pREl 12丢失情况，获得已去除重组质粒pMUTl-pREl 12的Nisslel917菌，即为完全去除两个隐秘质粒pMUTl和pMUT2的Nisslel917(Nisslel917 ApMUTl Λ pMUT2)。Nisslel917 隐秘质粒 pMUT2 的去除过程参见附图 3，Nisslel917两个隐秘质粒pMUTl和pMUT2去除前后的对比参见附图4。
【权利要求】
1.一种使用自杀性载体去除大肠杆菌NiSSle菌内隐秘质粒的方法，其特征在于其步骤如下:将自杀性载体与待去除的隐秘质粒构建成重组自杀质粒，所述自杀性载体具有抗性筛选标记和自杀载体特性；用构建的重组自杀质粒转化大肠杆菌Nissle，通过抗性筛选得到仅携带重组自杀质粒的大肠杆菌Nissle ;再利用自杀性载体的自杀特性筛选出丢失重组自杀质粒的大肠杆菌Nissle，从而获得去除了隐秘质粒的大肠杆菌Nissle。
2.根据权利要求1所述的使用自杀性载体去除细菌内隐秘质粒的方法，其特征在于，所述大肠杆菌Nissle是大肠杆菌Nisslel917，大肠杆菌Nisslel917中含有pMUTl、pMUT2两个隐秘质粒。
3.根据权利要求1所述的使用自杀性载体去除细菌内隐秘质粒的方法，其特征在于，所述自杀性载体是PRE112。`
【文档编号】C12N15/70GK103740747SQ201410045786
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年2月8日 优先权日:2014年2月8日
【发明者】朱国强, 朱军, 杨颖 , 夏芃芃, 羊扬, 周明旭, 朱晓芳 申请人:扬州大学