专利名称：：一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法
技术领域：
：—种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术：
：棒状杆菌是一类革兰氏阳性菌，属于具有中度到高GC含量的放线菌。自人们首次分离谷氨酸棒状杆菌生产L-谷氨酸以来(Kinoshita等，1957年)，棒状杆菌的三个主要代表谷氨酸棒状杆菌，黄色短杆菌，和乳糖发酵短杆菌，已经被广泛用于生产氨基酸。这里特别指出，通过DNA-DNA杂交实验发现，这三个不同物种之间只有很小的差别(Liebl等，1991)。由于已累计了大量的关于谷氨酸棒状杆菌生理学，生物化学和遗传学知识(EggelingandBott，2005;Burkovski，2008)，代谢工程已经取代经典的随机突变，成为棒状杆菌菌种改良的主要策略。可应用于棒状杆菌的载体系统的构建，是生产菌株的代谢工程改良以及棒状杆菌基础研究的基础。目前，已经有一些可以应用于棒状杆菌的表达载体(EggelingandBott，2005)。根据不同的棒状杆菌复制子，我们把这些表达载体分为四组。第一组包括pEKExl和pXMJ19，其复制子来自质粒pBLl;第二组包括pVWExl和pZ8_l，其复制子来自质粒pHM1519;第三组包括pECTAC-K99，pECTAC-XK99E，pECTAC-XC99E和pECTAC-XT99A，其复制子来自质粒pHM1519;第四组包括pAPE12，其复制子来自质粒pNG2。所有这些载体都有两个缺点一是在多克隆位点处含有较少的单限制酶酶切位点，另一是基因组成型表达或在laclq的控制下进行诱导表达。应用代谢工程进行菌种改良时，我们将经常要共表达来自同一个生物合成或降解途径的多个基因。携带许多限制性内切酶的多基因大片段DNA可能不能被克隆到含较少单限制酶酶切位点的多克隆位点处(Radmacher等，2002)。此外，在棒状杆菌中，lacP启动子不能很有效地行使转录功能，从而导致tac启动子不能被严谨控制(Billman-Jacobe等，1994)。在本发明中，我们构建了新型棒状杆菌表达载体pDXW-8，新的载体改善了多克隆位点的切点数目，并且用laclP，取代了lacP，能对基因的表达进行严谨控制。作为一个引用例子，我们在黄色短杆菌中成功地应用pDXW-8表达了编码透明颤菌血红蛋白(VHb)的vhb基因(KhoslaandBailey，1988)。
发明内容本发明的目的是构建一种在大肠杆菌和棒状杆菌中能表达外源基因的表达载体，最终能使外源基因在此载体相关元件的控制下，在大肠杆菌和棒状杆菌中实现诱导表达。本发明的技术方案一种大肠杆菌_棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8，其核苷酸序列为:SEQIDNO:1。4表达载体pDXW-8，含有一个在大肠杆菌和棒状杆菌中具有转录启动功能的tac启动子；从79位到18位；含有在大肠杆菌和棒状杆菌中具有转录终止功能的终止子rrnBTlT2，分别从9272到9229位，及从9097到9070位;含有用于棒状杆菌转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因，从413位到1228位；含有使质粒能在棒状杆菌宿主中复制并稳定存在的r印片段，从1635位到4320位。含有用于严谨控制tac启动子表达的负调控基因lacIPF1°4，从6985到5903位，其携带的外源启动子PF104及SD序列，PF104及SD序列核苷酸序列为ttgaccgatccggacacctgggataatgtgtgg￡tttttgtcg_gjg^g.gga;tggtgaat，其中，戈lj线部分为启动子PF104序列，加框部分为SD序列。含有用于克隆外源基因的人工合成的74bp多克隆位点MCS，从9546位到9478位，包含如下11个单一的限制性内切酶切点EcoRI，Nhel，Sacl，Ncol，Notl，Xhol，Kpnl，BglII，SaclI，AflII，禾口HindIII，其核苷酸序列为gaattcgctagcgagctcccatgggcggccgcctcgagggtaccagatctccgcggcttaagctgcagaagctt。表达载体pDXW-8的构建方法首先，以质粒pET-28a为模板，kan-F和kan-R为引物，通过PCR扩增1023bp的卡那霉素抗性基因。在扩增产物的5'和3'末端引入限制酶SgrAI酶切位点。PCR产物用SgrAI酶切，pKK223-3同样用SgrAI酶切，用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化；两者连接，由此产生的质粒大小为5617bp，命名为pDXW-5。第二步，以质粒pC2为模板，r印-F和r印-R为引物，通过PCR扩增2686bp的r印片段。r印片段与质粒的复制相关，最初来源于乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)隐蔽质粒pBLI(Fernandez-Gonzalezetal.，1994)。在扩增产物的5'和3'末端引入限制酶PshAI酶切位点。PCR产物用PshAI酶切，并连接到同样用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-5。由此产生的质粒大小为8313bp，命名为为pDXW-6。为了证明r印片段和卡那基因片段在棒状杆菌中的功能，我们用质粒pDXW-6转化黄色短杆菌B.flavum，并选择卡那霉素抗性克隆。第三步，以质粒pET-28a为模板，携带PF104序列正向引物Iacl-F，反向引物Iacl-R为引物，通过PCR扩增1191bp的laclP，基因。在扩增产物的5'和3'末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位点。PCR产物用EcoRI和HindIII双切，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切后的pDXW-6。由此产生的质粒大小为9510bp命名为pDXW-7。第四步，人工合成了74bp的多克隆位点MCS的DNA片段5'gaattcgctegcgagctcccatgggcggccgcctcgagggtaccagatctccgcggctteagctgcagaagctt3'，它包含有11个单一的限制性内切酶切点(EcoRI，Nhel，Sacl，Ncol，Notl，Xhol，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII)，用EcoRI和HindIII双切74bp的多克隆位点MCS片段，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切的pDXW-7上，以取代pDXW-7原有的多克隆位点。对新构建的质粒MCS及其两翼进行测序，以验证MCS是否正确连接到pDXW-7上。构建的质粒大小为9548bp，并命名为pDXW-8。最后，以质粒pDXW-8为模板，分别用引物对Kan/r印-D/kan-F，Kan/r印-D/Kan-R，Kan/r印-D/r印-F，Kan/r印-D/r印-R，lacI_D/lacI_F，禾口lacI_D/lacI_R进行DNA片段的PCR扩增，鉴定了质粒pDXW-8上kan插入方向为正向插入，r印和lacIPF1°4片段的插入方向均为反向插入。以上所述的扩增引物，扩增条件详见实施例1。本发明的有益效果1、本发明表达载体在大肠杆菌和棒状杆菌中皆具有表达外源基因的能力。2、本发明的表达载体，它的MCS包含多达11个单限制性内切酶切点，能有效地克隆大片段DNA。3、本发明的表达载体，控制基因应用了laclPF，，使外源基因无论是在大肠杆菌，还是在棒状杆菌中的表达，都受到严谨调控。4、本发明的表达载体pDXW-8，其tac启动子在棒状杆菌中活性相对较低，尤其适用与棒状杆菌生产次生代谢产物的代谢工程研究。生物材料样品保藏大肠杆菌JM109(pDXW-8){EscherichiacoliJM109(pDXW-8)}已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号CCTCCNO:M209199，保藏日期2009年9月11日。图1表达载体pDXW-8的构建过程图。图2表达载体pDXW-8的物理图谱。具体实施例方式实施例1表达载体pDXW-8的构建表达载体pDXW-8的构建过程如图1所示。我们用大肠杆菌表达载体pKK-223-3作为构建目的载体的母质粒，pKK-223-3携带tac启动子，rrnBTlT2终止子，二者在棒状杆菌中都能有效地行使功能(SrivastavaandDeb，2005)。在大肠杆菌JM109和棒状杆菌中，在诱导剂IPTG存在的情况下，可失活Lacl阻遏蛋白，pKK-223-3携带的靶基因可进行诱导表达。由于棒状杆菌对氨苄青霉素不敏感，我们向pKK223-3上引进了卡那霉素抗性基因kan作为选择标记在棒状杆菌对。以质粒pET-28a为模板，kan-F和kan-R为引物，通过PCR扩增1023bp的卡那霉素抗性基因。在扩增产物的5'和3'末端引入限制酶SgrAI酶切位点。PCR产物用SgrAI酶切，并连接到同样用SgrAI酶切，且用CIAP去磷酸化后的pKK223-3。由此产生的质粒大小为5617bp，命名为pDXW-5。以质粒pC2为模板，r印-F和r印-R为引物，通过PCR扩增2686bp的r印片段。r印片段与质粒的复制相关，最初来源于乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)隐蔽质粒pBLI(Fernandez-Gonzalezetal.，1994)。在扩增产物的5'和3'末端引入限制酶PshAI酶切位点。PCR产物用PshAI酶切，并连接到同样用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-5。由此产生的质粒大小为8313bp，命名为pDXW-6。为了证明r印片段和卡那基因片段在棒状杆菌中的功能，我们用质粒pDXW-6转化黄色短杆菌B.flavum，选择卡那霉素抗性克隆。6为了在棒状杆菌中调节耙基因的表达，我们向质粒pDXW-6中引进lacl基因。棒状杆菌中有关启动子功能的信息表明，革兰氏阴性菌启动子与棒状杆菌启动子可能略有不同(P6teketal.，2003)。载体pET-28a的lacl是laclq版本，在大肠杆菌中，其Lacl阻遏蛋白产量足以抑制tac启动子的表达；但在棒状杆菌中，laciq启动子不能非常有效的转录，从而导致在棒状杆菌中，tac启动子不能被严谨地控制(Billman-Jacobeetal.，1994)。分离自棒状杆菌噬菌体①GA1的启动子片段PF104(GenBank登录号X90367)可以在棒状杆菌中很好地工作(P(5teketal.，1996)。在这里，我们提出lacIPF1°4版的lacl，lacIPF1°4使用启动子PF104。以质粒pET-28a为模板，携带PF104序列正向引物Iacl-F，和反向引物Iacl-R为引物，通过PCR扩增1191bp的laclP，基因。在扩增产物的5'和3'末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位点。PCR产物用EcoRI和HindIII双切，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切后的pDXW_6。由此产生的质粒大小为9510bp命名为pDXW_7。插入kan，r印和lacIPF1°4片段后，pKK223_3上的多克隆位点只包含EcoRI和HindIII两个单限制酶切点。为了改善单限制性内切酶切点数，我们人工合成了74bp的多克隆位点DNA片段5'gaattcgctagcgagctcccatgggcggccgcctcgagggtaccagatctccgcggcttaagctgcagaagctt3'，它包含有11个单一的限制性内切酶切点(EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AfIII，和Hindi11)，用EcoRI和Hindi11双切74bp的多克隆位点MCS片段，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切的pDXW_7上，以取代pDXW-7原有的多克隆位点。我们对新构建的质粒MCS及其两翼进行测序，以验证MCS是否正确连接到pDXW-7上，构建的质粒大小为9548bp，并命名为pDXW-8。以质粒pDXW-8为模板，分别用引物对Kan/r印-D/kan-F，Kan/r印-D/Kan-R，Kan/r印-D/r印-F，Kan/r印-D/r印-R，lacI_D/lacI_F;禾口lacI-D/lacI-R进行DNA片段的PCR扩增，鉴定了质粒PDXW-8上kan插入方向为正向插入，r印和lacIPF1°4片段的插入方向均为反向插入。构建过程中使用的引物序列见表l，PCR反应条件见表2，表达载体pDXW-8的物理图谱见图2。表1.本发明所用引物及其序列(划线部分为酶切位点)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>441bpvhb基因的开放阅读框。在扩增产物的5'和3'末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位点。PCR产物用EcoRI和Hindi11双切，并连接到同样用EcoRI和Hindi11双切后的pDXW-8，产生的重组质粒pDXW-8-vhb。lmL过夜培养的大肠杆菌JM109接种到30mL的LB培养基中，JM109(pDXW_8)及JM109(pDXW-8-vhb)分别接种到30mL的含卡那霉素的LB培养基中。同样地，lmL过夜培养的黄色短杆菌B.flavum接种到30mL的LBG培养基中，黄色短杆菌B.flavum(pDXW-8)和黄色短杆菌B.flavum(pDXW-8-vhb)分别接种到补充卡那霉素的30mLLBG培养基中。上述30mL培养物生长到在600nm光密度为0.6时，加入终浓度为lmmol/L的诱导剂IPTG。4h后，离心收获细胞并悬浮在5mL磷酸盐缓冲液(100mmol/L、pH7.8)中。在1%的SDS条件下，细胞煮沸5分钟，裂解物用于SDS-PAGE分析。用ConstantCellDisruptionSystems(ConstantSystems,Daventry，UK)，在20KPSI条件下，破碎细胞，离心除去细胞碎片，粗提物用于VHb蛋白的生物活性分析。此外，为了检查tac启动子是否被lacIPF1°4严谨控制，在不添加诱导剂条件下，30mL黄色短杆菌B.flavum(pDXW-8-vhb)生长。收获细胞和制备粗提物方法同上。大肠杆菌JM109,JM109(pDXW-8)，JM109(pDXW-8-vhb)，黄色短杆菌B.flavum，B.flavum(pDXW-8)和B.flavum(pDXW-8-vhb)细胞裂解液分别进行SDS-PAGE分析(Ausubeletal.，1995)。大肠杆菌细胞裂解液SDS-PAGE分析结果表明，存在着一个特异性的蛋白带，其分子量约为16kD，这和据氨基酸序列预测的VHb分子量相一致。但在B.flavum(pDXW-8-vhb)的SDS-PAGE中，没有呈现出特异性的VHb蛋白条带。为了进一步证明vhb基因的表达，我们应用CO差光谱法(WebsterandLiu，1974)，分别对上述六个菌株粗提物进行了VHb的生物活性检测。对IPTG诱导的大肠杆菌JM109,大肠杆菌JM109(pDXW-8)，B.flavum和B.flavum(pDXW-8)粗提物的VHb活性进行CO差光谱分析，我们没有观察到VHb活性的CO差光谱。对IPTG诱导的大肠杆菌JM109(pDXW-8-vhb)和B.flavum(pDXW-8-vhb)粗提物的VHb活性进行CO差光谱分析，都观察到了VHb活性的CO差光谱，二者在420nm处都呈现出一个峰。峰值表明，在大肠杆菌JM109(pDXW-8)中，vhb基因诱导表达水平非常高，在所述测定条件，每mLlOOmg湿重菌体含量的细胞裂解液上清液在600nm条件下光吸收达0.522;在B.flavum(pDXW-8)中，vhb基因诱导表达水平相对较低，为0.012。对非IPTG诱导的B.flavum(pDXW-8-vhb)粗提物，我们没有观察到VHb活性的CO差光谱，这证明了在B.flavum(pDXW-8-vhb)中lacIPF1°4严格控制了tac启动子的表达。序列表〈210>SEQIDNO:1〈211>9548〈212>DNA〈213〉质粒pDXW-8全长DNA〈400〉1ttctgtttcctgtgtgaaattgttetccgctcacaattccacacattetecgagccgatg60atteattgtcaacagctcatttcagaatetttgccagaaccgttetgatgtcggcgcaaa120aaacattetccagaacgggagtgcgccttgagcgacacgaattetgcagtgatttecgac180ctgcacagccateccacagcttccgatggctgcctgacgccagaagcattggtgcaccgt240gcagtcgateagetceggatcctctecgccggaegcategtggceggcatcaccggcgct300ttgatcttttcteeggggtctgacgctcagtgg皿cga皿3ctcacgtte360ate^actgtctgettecat皿3C3gteatac皿ggggtgttetgagcca420tettcaacgggaaaegtettgctcteggccgcgatte皿ttcc皿catggatgctgattt■atetgggteta皿tgggctcgcgateatgtcgggc皿tcaggtgcgac皿tctetcgatt540gtetggg皿gcccgatgcgccagagttgtttctg皿3catggca皿ggtegcgttgccaa600tgatgttecagatg卿tggctggctgacggaatttetgcctcttccgac660catcaagcattttetccgtectcctgatgatgcatggttectcaccactgcgatccccgg720ttccaggtetttgttgatgc780gctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgteattgtcctttteacag840cgatcgcgtetttcgtctcgctcaggcgcaatc3cg皿tg皿teacggtttggttgatgc■gagtgattttgatgacgagcgt皿tggctggcctgttg皿c皿gtctgga960teaacttttgccattctcaceggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgatea1020ccttetttttgacg郷gga朋tteateggttgtettgatgttggacgagtcggaatcgc1080agaccgateccaggatcttgccatcctetggaactgcctcggtgagttttctccttcatt11403C3g皿3Cggctttttcaaatgat朋tcctgatetg皿teaattgcagtt1200tcatttgatgctcgatgagtttttctaagaatteattratgagcggatec1260ateggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctg1320acaccggcgcC3C3ggtgCggttgctggcgcctetatcgccgacatcaccgatgggg皿g1380atcgggctcgccacttcgggetcatgagegcttgtttcggcgtgggtetggtggcaggcc1440ccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcgg1500tgctcaacggcctcaacctectectgggctgcttccteatgcaggagtcgC3t朋ggg3g1560agcgtcgaccgatgeccttgagagectteaacccagtcagctccttccggtgggcgcggg1620gcatgactetcgtcgtctecgtctgatgetttgaatcggacggacttgccgatcttgtet1680gcggtgatttttccctcgtttgcccacttttt皿tggtggccggggtgagagetecgegg1740gcggcgacctgctgcgctgtgatccaatettcggggtcgttcactggttcccctttctga1800tttctggcatag皿g朋cccccgtgaactgtgtggttccgggggttgctgatttttgcga1860gacttctcgcgcaattccct賜ctteggtg皿皿c3cratg皿3cacteggg3朋C3CCC1920atgaleaeccattegggcagtegggeggettcttcgtctagggcttgcatttgggcggt1980gatctggtctttegcgtgtg皿agtgtgtcgteggtggcgtgctc^tgc3ctcg^cgt2040caegtcatttaccgggtcacggtggg咖agagaactegtgggttegacattgttttcct2100cgttgtcggtggtggtgagcttttctageegctcggteaacgcggcgatcatgaactctt2160ggaggttttcaccgttctgcatgcctgcgcgcttcatgtcctcacgtegtgccaaaggaa2220cgcgtgcggtgaccacgacgggcttegectttgcctgcgcttctagtgcttcgatggtgg2280cttgtgcctgcgcttgctgcgcctgtegtgcctgttgagcttcttgtegttgctgttcte2340gctgtgccttggttgccatgctttaagactctagtegctttcctgcgatetgtcatgcgc2400atgegtegeaaacattgtcctgcaactcattcattetgtgcagtgctcctgttectagtc2460gtacatactcatatttacctagtctgcatgcagtgcatgcacatgcagtcatgtcgtgct252010朋tgtgte朋acatgtacatgcagattgctgggggtgcagggggcggagccaccctgtcc25803tgCggggtgtggggcttgccccgccggtagcaccggggcacctagtcgc2640ggatacccccccteggtetcggacacgteaccctcccatgtcttteacat2700tgagtecgggteagctggcacgcategccaagcteggcggccactaaaaa2760ttaategtccca皿cccccgtgcgagctaccaactcatatgC3CgggggC2820cacateacccgaaggggtttccatagcact3CgggC3C朋2880C3CCCgC3C3aactcgcactgcgcaaccccgcacaacatcgggtctaggt2940teg朋gtg朋cacctcteagg33CCgC3ggt固tg郷gttctaaggtcactcgcgcte3000gggcgtggcgteggc朋朋cgtcatgtecategt皿ggctctggcggggt3060gccateggtggcgcagggacg啷ctgttgcggtgtcctggtcgtcteacggtgcttcgc3120agtttgagggtctgcaaaactctcactctcgctgggggtcacctctggctg￡l￡lttgg￡l￡lg3180tcatgggcgaacgccgcattgagctggctettgctectaagaatcacttggcggcgggtg3240gcgcgctcatgatgtttgtgggcactgttcgacac^ccgctcacagtcatttgcgcagg3300ttgaagcgggtettaagactgcgtactcttcgatggtg皿aacatctcagtgg朋g朋3g3360朋cgtgcacggtecggggtggagcacacctgactcttggg3420cg朋cggttggcacttgcaccgcaacatgctgttgttcttggatcgtccactgtctgacg34803tg朋ctc朋ggcgtttgaggattccatgttttcccgctggtctgctggtgtggttaagg3540ccggtetggacgcgccactgcgtgagcacggggtca皿cttgatraggtgtctecctggg3600gtgg卿cgctgcg朋朋tggcaacctecctcgcte郷gcatgtctcagg朋ctgactg3660gctccgctecte朋accgcgtcte郷ggtcgtecacgccgtttcagatgttggatatgt3720tggccgatca朋gcgacgccggcg郷atetggacgctgttttggtggctcggtggcgtg37803gtetg3ggttggttcteaaaacctgcgttcgtcctggtcacgtggggctaagcgtgctt3840tgggcattgattacatagacgctgatgtecgtcgtg皿atctgtacaagc3900tcgccggtctggaagcaccgg咖gggtcgaatcaacccgcgttgctgttgctttggtga3960agcccgatgattgg朋actgattcagtctgatttcgcggtteggcagtecgttctegatt4020gcgtgg3te3ggctaaggacgtggccgctgcgcaacgtgtcgct皿tgaggtgctgg固4080gtctgggtgtggattccaccccgtgcatgatcgttetggatgatgtggacttggacgcgg4140ttctgcctectcatggggacgctectaagcgtgatctg皿tgcggcggtgttcgcgggte42003tg3gC3g3Ctettcttcgcagcggcateaaccccgttcgatattttgtg4260cgatgaatttatggtc朋tgtcgcgggggc皿actetgatgggtcttgttgttgac朋tg4320gactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggaca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tatttgaccgatccggacacctgggataatgtgtggattttgtcggg朋3gg3tggtg朋tetg朋3cc3gt朋cg朋tclacI—R:gtatacggtgcctaatgagtgagctaacttPCR反应条件扩增kan基因PCR反应所用引物为kan-F，kan-R;退火温度57。C，延伸时间75s;扩增r印片段PCR反应所用引物为r印-F，r印-R，退火温度6rC，延伸时间165s;扩增lacf基因PCR反应所用引物为Iacl-F，Iacl-R，退火温度69°C，延伸时间75s;确定kan基因正向插入PCR反应所用引物为Kan/r印-D，Kan-R，退火温度57°C，延伸时间75s;确定kan基因反向插入PCR反应所用引物为Kan/r印-D，Kan-F，退火温度57°C，延伸时间75s;确定r印片段正向插入PCR反应所用引物为Kan/r印-D，r印-R，退火温度57。C，延伸时间255s;确定r印片段反向插入PCR反应所用引物为Kan/r印-D，r印-F，退火温度57。C，延伸时间255s;确定laclPF鹏基因正向插入PCR反应所用引物为Iacl-D，lacI-R，退火温度59。C，延伸时间105s;确定laclP"M基因反向插入PCR反应所用引物为Iacl-D，Iacl-F，退火温度59"，延伸时间105s。全文摘要一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法，属于基因工程
技术领域：
。本发明的表达载体pDXW-8，能在大肠杆菌和棒状杆菌中复制并稳定存在，含有一个在大肠杆菌和棒状杆菌中皆具有转录启动功能的tac启动子，及转录终止功能的终止子rrnBT1T2；含有一个用于棒状杆菌转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因；含有一个用于严谨控制tac启动子表达的负调控基因lacIPF104；含有一个包含11个单一的限制性内切酶切点的多克隆位点MCS。在棒状杆菌中，该载体表达外源蛋白的水平适中，尤其适用于棒状杆菌代谢工程的研究。文档编号C12N15/77GK101693901SQ200910233618公开日2010年4月14日申请日期2009年10月26日优先权日2009年10月26日发明者徐大庆,李烨,王小元,谭延振申请人:江南大学;