专利名称：一种可调控表达的叶绿体转基因表达载体的构建的制作方法
技术领域：
本发明可调控表达的叶绿体转基因表达载体的构建涉及植物叶绿体可诱导表达载体及其用途，属于基因工程技术领域。具体涉及植物核基因组转化的植物核转化表达载体和利用植物叶绿体基因组转化的植物叶绿体转化表达载体。
背景技术：
叶绿体(Chloroplast)是一个独特的可以将光能转化为化学能的细胞器，起源于大家熟知的原生质体。植物细胞中含有500-10000个拷贝数的叶绿体环状基因组(120-160kb)，每个基因组中含有一个大的颠倒重复区，这样，通过遗传工程技术可以使一些具有潜在价值的目的基因在细胞中的数量达到20000个拷贝数，从而使外源基因的表达量提高到一个极高的水平。因此，植物叶绿体是一个具有吸引力的遗传工程靶标。
现在分子生物学和生物化学研究表明叶绿体基因的转录和翻译机制以及起始信号与原核生物有极高的相似性。此外，叶绿体基因经常以多顺反子基因簇的形式排列，这一点也与原核生物极为相似。尽管叶绿体和原核生物的遗传机制具有明显的相似性，但是在控制叶绿体基因表达方法上与原核生物有着本质的不同。与原核生物典型的转录调控机制不同，叶绿体基因的表达主要是通过核编码的蛋白在翻译水平和mRNA的稳定性上进行调控。
目前已实现了植物叶绿体稳定遗传转化，主要依赖于同源重组将外源基因定向整合到叶绿体的基因组中，从而可获得含有重组DNA构建的同质化或基本同质化的转基因植物。然而，叶绿体遗传工程表达外源基因的关键不足是缺乏组织特异性表达和发育调控机制来控制外源基因的时空表达。这种表达量极高的组成型表达可能对表达宿主的健康和代谢带来潜在的负面影响，尤其是当表达一种具有毒性或代谢活性的蛋白时将影响转化阶段的组织的分化，从而进一步影响同质化，或者导致转化植物不能正常生长而死亡。
因此，控制叶绿体基因表达的调控机制将对改变叶绿体基因表达途径具有重要的意义。如通过组织特异性表达启动子表达调控元件实现叶绿体转基因植物的组织特异性表达，和在发育的特殊阶段进行诱导调控实现外源基因的时序表达，来避开对生长发育的不利影响，从而获得大量外源基因表达产物，使植物叶绿体遗传工程技术在植物生物反应器应用中发挥全部的能量。
发明内容
本发明的目的在于创建一种新的叶绿体基因的可调控表达技术，提供两个叶绿体基因可调控表达的表达载体，通过其可以实现外源基因在植物叶绿体中时空表达，克服现有叶绿体表达载体的不足，为利用植物叶绿体遗传工程技术实现外源基因的高效表达提供技术支撑。
本发明是通过以下技术方案实现的通过一个核转化的诱导元件，包含叶绿体转运信号肽，Gal4 DNA结合域，VP16转录激活域和雌性激素受体(ER)的嵌合的顺式转录因子，与叶绿体转化的被调控元件相互作用，实现外源基因的时序表达。
提取烟草基因组总DNA，以总DNA为模板，采用引物1(SEQ IDNO.1)和引物2(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增获得叶绿体转运信号肽的编码序列的扩增产物，为372bp.将叶绿体转运信号肽的编码序列与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得含绿体转运信号肽的编码序列的大肠杆菌克隆pRUB。以抽提大肠杆菌的质粒pRUB为底物，用限制性内切酶EcoR V和Spe I酶切，获得372bp的片段与用限制性内切酶EcoR V和Spe I酶切后的pBSK载体，进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得获得含绿体转运信号肽的编码序列的大肠杆菌克pBSKRUB。
以含有Gal4 DNA结合域，VP16转录激活域的质粒pIN2为模板，采用以引物3(核苷酸序列与SEQ ID NO3相同)和引物4(核苷酸序列与SEQ ID NO4相同)进行PCR扩增，获得Gal4 DNA结合域，VP16转录激活域的编码核苷酸序列，为526bp。将叶绿体转运信号肽的编码序列与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得含Gal4DNA结合域，VP16转录激活域的编码核苷酸序列的大肠杆菌克隆pTGV。以抽提的大肠杆菌克隆pTGV为底物，用Spe I和Not I酶切，获得526bp的片段与采用Spe I和Not I酶切后的pBSKRUB载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有绿体转运信号肽、Gal4 DNA结合域和VP16转录激活域的编码核苷酸序列的大肠杆菌克隆pRGV。
采用限制性内切酶BamH I和Sac I酶切质粒pER8和质粒pBI121，分别回收950bp片段(核苷酸序列与SEQ ID NO5相同)和载体并将两者进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有雌性激素受体的核苷酸编码序列的大肠杆菌克隆pBIER。
采用限制性内切酶BamH I和EcoR I酶切质粒pBIER和质粒pET30a，分别回收1.2kb片段和载体并将两者进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有雌性激素受体和NOS终止子的核苷酸编码序列的大肠杆菌克隆pERNOS。
采用限制性内切酶EcoR V和BamH I酶切质粒pERNOS和质粒pRGV，分别回收载体和950bp的片段，并将两者进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有绿体转运信号肽、Gal4 DNA结合域、VP16转录激活域、雌性激素受体和NOS终止子的核苷酸编码序列的大肠杆菌克隆pRGVEN。
采用限制性内切酶EcoR V和EcoR I酶切质粒pRGVER，回收2.2kb的片段；采用限制性内切酶Sma I和EcoR I酶切质粒pBI121，回收载体并与2.2kb的片段进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有35S启动子、叶绿体转运信号肽、Gal4 DNA结合域、VP16转录激活域、雌性激素受体和NOS终止子的调控元件表达盒，以及抗性筛选基因NPT-II的表达盒植物双元表达载体的大肠杆菌克隆pIN-I。见图1用于烟草核转化的植物双元表达载体pIN-I结构示意图。
利用ovlapping PCR技术，采用引物6(核苷酸序列与SEQ ID NO6)相同和引物7(核苷酸序列与SEQ ID NO7相同)，合成一个含有4个拷贝重复的Gal4 DNA结合位点和截短的含有主要转录调控元件的嵌合启动子的核苷酸序列(核苷酸序列与SEQ ID NO8相同)。PCR产物采用限制性内切酶用Hind III和BamH I酶切，获得115bp的片段；采用限制性内切酶Hind III和BamH I酶切质粒pBSK，回收载体并与115bp的片段连接，连接转化大肠杆菌DH5α，获得含有嵌合启动子的大肠杆菌克隆pCIND；提取烟草基因组总DNA，以总DNA为模板，采用引物9(SEQ IDNO.11)和引物10(SEQ ID NO.12)进行PCR扩增获得Ribusco大亚基的3’-UTR的编码序列的扩增产物(SEQ ID NO.13)，PCR产物采用限制性内切酶用BamH I和Not I酶切，获得的片段；采用限制性内切酶BamH I和Not I酶切质粒pCIND，回收载体并与---连接，连接转化大肠杆菌DH5α，获得含有嵌合启动子和Ribusco大亚基的3’-UTR的核苷酸编码序列的大肠杆菌克隆pCDUTR；以含有GUS基因的质粒pBI121为模板，采用引物11(SEQ IDNO.14)和引物12(SEQ ID NO.15)进行PCR扩增，获得GUS的cDNA序列((SEQ ID NO.16)，大小为1840bp。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得含GUS的编码序列的大肠杆菌克隆pTGUS。
采用限制性内切酶用BamH I和Sac I酶切质粒pTGUS和质粒pCDUTR，回收1.8kb的片段和载体，并将两者连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有嵌合启动子、报告基因GUS和Ribusco大亚基的3’-UTR表达盒的大肠杆菌克隆pCGR。
采用限制性内切酶Eco I和Not I酶切含有壮观霉素的抗性基因aadA表达盒的质粒pPAP和质粒pCGR，回收载体和2.1kb片段并将两者连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有嵌合启动子、报告基因GUS和Ribusco大亚基的3’-UTR表达盒和壮观霉素的抗性基因aadA表达盒的大肠杆菌克隆pPAPCGR。
采用限制性内切酶Xba I和Not I酶切质粒pPAPCGR回收3.8kb的片段；采用限制性内切酶Spe I和Not I酶切含有叶绿体同源重组片段质粒pTYAB，回收载体并与3.8kb的片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有同源重组基因片断、壮观霉素的抗性基因aadA表达盒和可调控表达的报告基因GUS表达盒的叶绿体转化载体pIN-II。见图2用于烟草叶绿体转化的植物双元表达载体pIN-II结构示意图。
通过农杆菌感染法，将含有pIN-I表达载体转化烟草，通过T-DNA的插入将诱导元件整合到烟草核基因组中，通过抗生素的抗性筛选获得转化植株，经过鉴定获得转基因植株。然后通过基因枪转化方法，将pIN-II表达载体转化获得转基因植株通过雌性激素诱导，使诱导复合体与细胞质中的Hsp90蛋白分离，通过叶绿体信号肽作用转运到叶绿体中，与Gal4 DNA结合域结合，在VP16的激活下，启动报告基因的表达；作用机制见图3诱导机制示意图。
图1用于烟草核转化的植物双元表达载体pIN-I结构示意图示意图说明通过农杆菌感染的方法，经过载体上的T-DNA的插入，将抗性基因表达盒和诱导元件表达盒整合到烟草的和基因组中，通过抗生素卡那霉素的筛选获得转基因植株，在启动子35S的启动下顺式调控元件可以被组成型表达。
图2用于烟草叶绿体转化的植物双元表达载体pIN-II结构示意图。示意图说明通过基因枪轰击的方法，经过载体上的与叶绿体基因组同源的基因片段，通过同源重组将抗性筛选基因表达盒和诱导表达的报告基因表达盒整合到整合到叶绿体基因组中，在雌二醇存在的状态下Gal4∷VP16∷ER在叶绿体转运肽的作用下进入叶绿体，通过Gal4结合到诱导启动子上游的Gal4结合域，在VP16的激活下启动报告基因GUS的表达。
图3诱导机制途径示意图。
示意图说明在核中表达的调控元件Gal4∷VP16∷ER与细胞质中的热激蛋白Hsp90结合，使转录激活域失活，阻抑了其与诱导启动子上游结合域的结合，从而不能启动报告基因GUS表达；当加入化学诱导物质雌二醇时，雌二醇可与调控元件Gal4∷VP16∷ER中的雌性激素受体ER结合改变诱导元件构象，从而使其与热激蛋白HSP90分离，在叶绿体转运肽的作用下进入叶绿体，通过Gal4结合到诱导启动子上游的Gal4结合域，在VP16的激活下启动报告基因GUS的表达。
Estradiol，雌二醇；cytoplasm，细胞质；nucleus，细胞核；Hsp90，热激蛋白90；chloroplast，叶绿体；GVER，Gal4∷VP16∷ER顺式调控元件复合体；GBD，Gal4 Binding Domain，Gal4结合域。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明的实施方式作出详细具体的描述1.实验材料1.1烟草烟草(Nicotiana tabacum cv科星一号)，为公共植物材料。
1.2菌株与质粒大肠杆菌DH5α购自上海农科院生物中心基因工程实验室提供。
含有烟草叶绿体DNA的同源重组片段的质粒pTYAB和含有壮观霉素抗性基因aadA表达盒的质粒pPAP由上海农科院生物中心基因工程实验室提供，大肠杆菌载体pMD18-T购自日本TAKARA公司；pET30a购自novagen公司，pBSK购自stratagene公司。
1.3引物、酶与试剂PCR引物由上海博亚生物公司合成，详细序列信息见SEQ ID NO1-10；限制性内切酶、Pfu DNA聚合酶、T4DNA连接酶等购自日本TAKARA公司；
DNA凝胶回收试剂盒购自杭州V-gene生物技术公司；山梨醇、甘油、各种氨基酸等生化试剂均为国产分析纯或进口分装。
2.操作过程2.1提取烟草总DNA采用CTAB方法提取总DNA。
2.2PCR扩增在无菌PCR管中加入5μl 10×Pfu PCR缓冲液，5μl 2mM4dNTPs，20μM上游及下游引物各1μl，模板DNA，5U Pfu DNA聚合酶，加水至50μl总体积，最后加适量矿物油以防止蒸发。反应条件如下94℃，5min；94℃ 30sec，56℃ 30Sec，72℃ 2min(退火温度及延伸时间根据引物及扩增产物长度不同作相应改变)，30个循环；终延伸72℃ 10min。
反应结束后，在PCR体系中加入1U Taq DNA聚合酶，72℃ 1h。
2.3TBE-琼脂糖凝胶电泳和回收PCR产物用1％琼脂糖凝胶(含10ng/ml EB)电泳分离PCR产物，电泳结束，将凝胶置于紫外分析仪内，切取含PCR产物的胶块，用DNA凝胶回收试剂盒回收，PCR产物最终溶于20-30μl的洗脱缓冲液中。
2.4DNA连接反应在无菌Eppendorf管中加入1μl 10×T4DNA连接酶缓冲液，8μl回收的PCR产物，0.25μl pMD18-T载体，1μl T4 DNA连接酶，总体积为10μl。将各组分混匀，4℃中连接16h。当PCR产物与载体DNA片段通过酶切形成的互补粘端相连时，两者之间的质量比为5∶1。
2.5制备大肠杆菌感受态细胞在LB平板上划线接种大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。用接种环挑取10-12个单菌落(2-3mm直径)，接种于250mL的SOB培养液中。振荡培养(18℃，200-250rpm)，至OD600＝0.6。菌液置于冰上10min。离心(4℃，3000rpm，10min)，收集细胞。用80ml预冷的TB溶液重悬细胞，冰浴10min。离心(4℃，3000rpm，10min)，收集细胞。用20ml预冷的TB轻轻地重悬细胞，加入二甲基亚砜(DMSO)至终浓度7％，轻轻混匀，置于冰上。10min后，按每管500μl分装细胞悬液于无菌的1.5ml离心管中。用液氮快速冷冻，储存于-70℃。
2.6DNA连接产物转化大肠杆菌在1.5ml eppendorf管中加入200μl的感受态细胞与10μl的DNA连接产物，手指轻弹管壁，混匀混合物。冰浴30min。42℃，温育混合物90sec。迅速放回冰上，冰浴10min。加入800μl SOC培养液，37℃，剧烈振荡混合液1h。将混合液涂布在选择性培养基上，37℃培养过夜。
2.7DNA序列分析采用ABI377型测序仪(购自美国ABI公司)测定DNA序列，用PCGENE软件分析序列，由上海博亚生物公司完成。
2.8小量制备质粒DNA
从培养基平板上挑取含目的质粒的单菌落，接种于3ml含相应抗生素的LB液体培养基中，振荡培养过夜(37℃，200rpm，)。在1.5ml离心管中，倒入1.5ml菌液，离心(4℃，13000rpm，30sec)，倒去上清，收集菌体，将离心管倒扣在纸巾上，晾干管壁上的残余液滴。加入100μl预冷的溶液I，剧烈震荡，悬浮菌体；加入200μl新鲜的溶液II，将盖关闭，迅速颠倒5次，混匀混合物，注意不要旋转离心管；加入150μl溶液III，将盖关闭，颠倒数次，使溶液III均匀分散在粘稠的菌裂解液中，冰浴3-5min。离心(4℃，13000rpm，5min)，将上清转移到新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀，常温放置10min，离心(4℃，13000rpm，5min)，倒去上清，加入1ml 70％乙醇，将盖关闭，颠倒数次，离心(4℃，13000rpm，2min)。倒去上清，将离心管倒扣在纸巾上，室温放置数分钟，待管壁上的残余乙醇液滴完全挥发，用30μl TE(pH8.0，含20μg/ml无DNA酶污染的RNA酶A)溶解DNA沉淀，37℃保温30min，DNA保存于-20℃备用。
2.9限制性内切酶酶切DNA酶切反应参照限制性内切酶试剂盒(购自TAKARA公司)说明书中的具体操作进行。反应结束，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收操作与PCR产物回收相同。
2.10农杆菌介导的烟草的核转化通过三亲杂交法将核表达的双元表达载体pIN-I转化入农杆菌LB4404，方法参照(J Bacteriol 1984，1581115-1121.)
转基因烟草通过农杆菌介导法转染叶盘，然后在抗生素卡那霉素的筛选下获得抗性植株，通过PCR检测获得转基因植株。方法参照(Science(1985)2271229-1232)2.11烟草叶绿体转化---基因枪法核转化的转基因植株通过基因枪法实行叶绿体的转化，方法参照(Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90913-917)这样使烟草和基因组中含有35S∷SSUTP∷GVER∷Tnos的同时其叶绿体基因组中含有6*Gal4BD-miniPrrn∷GUS∷TrbcL.
用包裹有pIN-II质粒DNA的直径为1.0um的金粉，采用基因枪Bio-Rad PDS 1000/He进行轰击放置在ROMP培养基(MS盐，加上0.2M/L山梨醇和0.2M/L的甘露醇，30g/L的蔗糖，0.7％琼脂，PH5.8)上的成熟的pIN-I核转化的转基因植株叶片，轰击压力1,100psi；轰击距离9cm.轰击后的叶片移至到MS培养基上(MS盐，30g/L的蔗糖，0.7％琼脂，PH5.8)光培养4天后，将叶片剪成5mm见方的小块放置到上选培养基(MS盐，1.5mg/L 6BA，0.15mg/L IAA，500mg/L壮观霉素30g/L的蔗糖，0.7％琼脂，PH5.8)上进行分化培养，每2周更换一次分化培养基；待长出绿色小苗时，移栽至生根培养基(MS盐，500mg/L壮观霉素30g/L的蔗糖，0.7％琼脂，PH5.8)上进行生根培养。
序列表<110>上海市瑞丰农业科技有限公司张大兵，钱炳俊，贾军伟，武爱波，潘爱虎，王荣谈<120>一种可调控表达的叶绿体转基因表达载体的构建<130>技术专利<160>序列数量16<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>31<212>DNA<213>烟草<400>1aaagatatca tattggaagt taaaggaaaa g31<210>2<211>30<212>DNA<213>烟草<400>2aaaactagtg tacttcttct tgttaattgg 30<210>3<211>36<212>DNA<213>酵母<400>3aaaactagtg gaggaatgaa gctactgtct tctatc 36
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权利要求
1.一种可调控表达的叶绿体转基因表达载体的构建，包括植物核转化表达载体和叶绿体转化表达载体的构建，其中，植物核转化表达载体中的诱导元件，为包含叶绿体转运信号肽，Gal4 DNA结合域，VP16转录激活域和雌性激素受体(ER)的嵌合的顺式转录因子，即与叶绿体转化的被调控元件相互作用，实现叶绿体中外源基因的时序表达。
2.根据权利要求1所述的一种可调控表达的叶绿体转基因表达载体的构建中的核转化表达载体构建，其特征在于，所述的激活转录元件的表达构建，其序列与SEQ No.9和SEQ No.10相同。
3.根据权利1所述的一种可调控表达的叶绿体转基因表达载体的构建中的叶绿体表达载体构建，其特征在于获得含有嵌合启动子的步骤利用overlapping PCR技术，采用核苷酸序列分别为SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的引物6、引物7，合成一个含有4个拷贝重复的Gal4DNA结合位点和截短的含有核苷酸序列为SEQ ID NO8的转录调控元件的嵌合启动子。
4.根据权利1所述的一种可调控表达的叶绿体转基因表达载体的构建中的叶绿体表达载体构建，其特征在于获得含有嵌合启动子、报告基因GUS和Ribusco大亚基的3’-UTR表达盒和壮观霉素的抗性基因aadA表达盒，同源重组基因片段的叶绿体转化载体pIN-II。
5.利用权利要求1和4生产的转基因植物的方法，通过农杆菌感染法，第一，将含有pIN-I表达载体转化烟草，通过T-DNA的插入将诱导元件整合到烟草核基因组中，通过抗生素的抗性筛选获得转化植株，经过鉴定获得转基因植株；第二，通过基因枪转化方法，将pIN-II表达载体转化获得转基因植株通过雌性激素诱导，使诱导复合体与细胞质中的Hsp90蛋白分离，通过叶绿体信号肽作用转运到叶绿体中，与Gal4DNA结合域结合，在VP16的激活下，启动报告基因的表达。
全文摘要
本发明一种可调控表达的叶绿体转基因表达载体的构建涉及植物叶绿体可诱导表达载体，属于基因工程技术领域。本发明获得的植物核转化表达载体和叶绿体转化表达载体，对克服传统的叶绿体遗传工程的关键缺陷，可解除其高效组成型表达带来的对植物的发育和新陈代谢带来的负担，以及解决某些对植物具有毒害和致死作用的蛋白，具有很大的实际应用价值。
文档编号C12N15/66GK1800407SQ20051011186
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月23日 优先权日2005年12月23日
发明者张大兵, 钱炳俊, 贾军伟, 武爱波, 潘爱虎, 王荣谈 申请人:上海瑞丰农业科技公司, 张大兵, 钱炳俊, 贾军伟, 武爱波, 潘爱虎, 王荣谈