专利名称：一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明设计一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)穿梭表达载体及
其应用，属于遗传工程领域。
背景技术：
在食品工业用酶的表达研究和工业发酵生产中，用微生物表达系统重组表达食品 用酶，具有广泛的应用前景。目前大肠杆菌表达系统和酵母表达系统具有方便的来源，多年 来很多研究机构开发了多种系列的表达载体和表达宿主菌，而且在多方向对大肠杆菌表达 系统和酵母表达系统进行改造。但是大肠杆菌表达系统的许多问题依然存在，如包含体的 形成，大肠杆菌表达宿主菌的毒性问题。酵母表达系统表达系统因为能解决部分真核来源 异源蛋白表达的翻译后修饰问题，具有独特的优越性，但酵母表达系统低表达效率的问题 是其主要的缺陷。枯草芽孢杆菌表达系统的主要的优点是1)与革兰氏阴性菌相比，无内毒素，是 GRAS，具有安全性。2)它有很多分泌信号肽，枯草杆菌作为表达系统宿主菌可为重组蛋白的 分泌提供充分的可选择的分泌信号肽，使得目的蛋白的胞外表达成功效率更高，同时可以 降低胞内包涵体的形成概率，提高重组酶正确折叠的效率。3)芽孢杆菌是很多食品用酶的 来源菌，该类酶在芽孢杆菌表达系统中的表达效果应该更好，许多同源蛋白重组胞外表达 的成功效率可以达到25g/L以上。但目前枯草芽孢杆菌表达系统尚存在许多问题( I )虽然许多枯草芽孢杆菌表达载体，已经被构建、改造和使用，但目前可供选 择的和可以高效率表达的载体和宿主细胞种类仍然是有限的，可改造性差，其可选择性远 低于大肠杆菌表达载体和酵母表达载体。( II )启动子的序列优化，RBS序列的优化，RBS序列和ATG之间的距离待于进一
步改进。(III )质粒稳定性差，相对于大肠杆菌表达系统，枯草芽孢杆菌细胞在复制中容易 丢失质粒。(IV )信号肽对于重组蛋白的有效分泌，起着非常重要的作用，需要发现更加有效 的信号肽和发现新的启动子与信号肽组合，使得分泌功能更强，降低包涵体的形成。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体。本发明提供的表达载体，包括如下元件人工设计的表达调控元件、枯草芽孢杆菌 信号肽的编码序列、大肠杆菌的复制起始序列、抗生素抗性基因。所述表达载体具有以下1)或2)所示的DNA序列；DDNA序列为SEQ ID NO 1所示核苷酸序列；2)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性。
所述人工设计的表达调控元件由枯草芽孢杆菌P43启动子、枯草芽孢杆菌脱乙酰 几丁质酶信号肽的编码序列CSN、Fl噬菌体的终止子序列，人工设计的能被枯草芽孢识别 的核糖体结合序列序列RSB、人工设计的枯草芽孢杆菌信号肽酶的酶切位点、人工设计的多 克隆位点MCS组成。所述表达调控元件DNA序列如以下3)或4)或5)所示；3)其DNA序列为SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列；4)在严格条件下与3)限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的 DNA序列；5)与3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且能促进目的基因转录和翻 译的DNA序列。所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。所述表达载体的出发载体为pMA5。本发明所要解决的另一个技术问题是提供所述表达的载体的应用。所述表达载体在构建转基因细胞系中的应用。所述表达载体在构建基因工程菌株中的应用。所述表达载体促进在目的基因转录和翻译中的应用。本发明提供的载体既能在大肠杆菌中复制，又能在枯草芽孢杆菌中复制并表达， 丰富了可用于枯草芽孢杆菌表达系统的载体；该载体首次使用B. subtilis脱乙酰几丁质 酶信号肽，其引导分泌胞外蛋白的能力较强，报告基因为构巢曲霉果胶酸裂解酶基因，其胞 外表达量达到600U/mL，远高于果胶酸裂解酶基因使用其它载体时的表达水平。
图1表达调控元件模型(P43/CSN/F1T)图 2P43PCR 电泳 3RBS-CSN-MCS-6Hi s-TAATAA (B)合成电泳 4P43-RBS-CSN-MCS-6Hi s-TAATAA 合成电泳5pBSCWZ表达载体物理图谱
具体实施例方式实施例1表达调控元件的设计选用B. subtilis P43 启动子，来自 B. subtilis chitosanase 的信号肽(CSN)Ji 用来自Fl噬菌体的终止子序列，根据B. subtilis核糖体序列设计的RBS序列，通过比较分 析多种蛋白中的B. subtilis信号肽酶切位点特征设计信号肽酶酶切位点，选用五种酶切 位点构成MCS。该套表达调控元件全序列见SEQ ID No. 2，该序列组成模型见图1。实施例2表达载体的构建1、表达调控元件的合成由于该表达调控元件不是连续来自于一个模板，而且其部分序列是完全人工设 计，故采用人工重叠PCR技术。首先提取B. subtilis的基因组DNA，通过PCRl程序(用 zqxP43S和zqxP43AS做引物，B. subtilis的基因组DNA为模板，Tm = 55°C )，合成P43启
4动子(记为A，图2)。然后化学合成7个34_65bp长的寡核苷酸序列(见表1)，通过重叠PCR2程序(以 zqxrsmSl, zqxrsmS2、zqxrsmS3、zqxrsmAsl、zqxrsmAs2> zqxrsmAs3> zqxrsmAs4 为模板， zqxrsmSl 和 zqxrsmAs4 做引物，Tm = 50°C )，得到 RSB-CSN-MCS_6His tag-TAATGA 片段(记 为B，图3)。最后，通过PCR3程序(以A和B为模板，以zqxP43S和zqxrsmAs4为引物，Tm = 68°C )，得到完整的表达调控元件P43/CSN/F1T中的P43/CSN(图4)片段。切胶回收P43/ CSN DNA与pMD18T载体连接，转化JM109，转化产物涂布含100ug/mL氨苄青霉素的LB平 板，经过37°C培养过夜，挑选单克隆转化子，经过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定和测序鉴定， 表明合成预期表达调控元件DNA的全长为454bp，测定的序列和设计序列完全相同。表1合成的寡核苷酸序列和引物
权利要求
1.一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，包括如下元件人工设计的表达调控 元件、枯草芽孢杆菌信号肽的编码序列、大肠杆菌的复制起始序列、抗生素抗性基因。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于其DNA序列如以下1)或2)所示；1)DNA序列为SEQID NO=I所示核苷酸序列；2)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述人工设计的表达调控元件由枯草 芽孢杆菌P43启动子、枯草芽孢杆菌脱乙酰几丁质酶信号肽的编码序列CSN、F1噬菌体的终 止子序列，人工设计的能被枯草芽孢识别的核糖体结合序列序列RSB、人工设计的枯草芽孢 杆菌信号肽酶的酶切位点、人工设计的多克隆位点MCS组成。
4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述表达调控元件DNA序列如以下3) 或4)或5)所示；3)其DNA序列为SEQID NO. 2所示核苷酸序列；4)在严格条件下与3)限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA 序列；5)与3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且能促进目的基因转录和翻译的 DNA序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的表达载体，其特征在于所述抗生素抗性基因为卡那霉 素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
6.根据权利要求1-4任一所述的表达载体，其特征在于所述表达载体的出发载体为 pMA5。
7.含有权利要求1-4任一所述表达载体的转基因细胞系。
8.含有权利要求1-4任一所述表达载体的基因工程菌株。
9.权利要求1-4任一所述表达载体在促进在目的基因转录和翻译中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用，属于遗传工程领域。该大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，包含如下元件枯草芽孢杆菌启动子序列、枯草芽孢杆菌信号肽的编码序列、人工设计的能被枯草芽孢识别的核糖体结合序列序列、人工设计的枯草芽孢杆菌信号肽酶的酶切位点、人工设计的多克隆位点、噬菌体终止子序列、枯草芽孢杆菌的复制起始序列、大肠杆菌的复制起始序列。本发明提供的载体既能在大肠杆菌中复制，又能在枯草芽孢杆菌中复制并表达，丰富了可用于枯草芽孢杆菌表达系统的载体；该载体首次使用B.subtilis脱乙酰几丁质酶信号肽，其引导分泌胞外蛋白的能力较强，报告基因为构巢曲霉果胶酸裂解酶基因，其胞外表达量达到600U/mL，高于果胶酸裂解酶基因使用其它载体时的表达水平。
文档编号C12N1/15GK102002509SQ20101018134
公开日2011年4月6日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者吴敬, 赵庆新, 陈坚 申请人:江南大学