专利名称：一种提高液体氨肽酶稳定性的方法及该酶的应用的制作方法
技术领域：
—种提高食品级枯草芽孢杆菌液体氨肽酶稳定性的方法及其酶的应用。利用枯草
芽孢杆菌的发酵液，经离心、澄清、超滤浓縮、脱盐、醇沉后溶解获得液体氨肽酶，通过添加 稳定剂或辅因子提高稳定性，研究在食品，添加剂中的应用。属于酶制剂、食品添加剂技术 领域。
背景技术：
酶制剂已广泛应用在食品、酿造、制药、有机酸、淀粉糖、饲料工业、纺织、皮革、洗 涤剂及保健品等各个领域，应用领域越来越广泛。食品与人们的生活密切相关，因此酶在食 品工业中的应用价值越来越重要，目前在烘焙、奶制品、肉类加工、新型营养食品和蛋白质 的水解中得到很大的体现。 如非专一性蛋白酶可将蛋白质水解成氨基酸而不生成苦味肽，酶解蛋白质生产多 肽已成为当今热门研究，通过不同的酶切方式可以获得不同功能的活性多肽，尤其是开发 一些寡肽物质，成为蛋白质研究中的一个新领域。在酶解植物蛋白中(如大豆蛋白、玉米蛋 白)体现了很大的价值，功能性寡肽不仅具有比氨基酸更容易吸收同化为机体的特性，还 具有多种功能，如降血压，抗氧化性等。本实验室生产的氨肽酶为外肽酶，可以从多肽链的 N端解离氨基酸，经本实验室研究该氨肽酶与中性蛋白酶协同水解大豆分离蛋白，制备的大 豆多肽无苦味，且二肽三肽等寡肽含量较高，能占到63. 76%，并且水解后的游离氨基酸含 量较高，此外，通过对该枯草芽孢杆菌所产酶系的研究发现，它主要有外切型蛋白酶，内切 型蛋白酶的活性很低。 蛋白质水解产生肽类物质和少量氨基酸，其溶解性、热稳定性以及营养特性有很 大的提高，但水解液中含有苦味肽，这种苦味肽一般是氨端带有单个或多个疏水氨基酸的 多肽链，有时也可能是羧端带疏水氨基酸，苦味限制了蛋白质水解物的应用。蛋白酶氨肽 酶，羧肽酶在蛋白质水解过程中能消除其苦味。另外，氨肽酶还可广泛用于肉制品加工、乳 品业等，减少苦味增加游离氨基酸，提高食品营养价值。氨肽酶还可用作蛋白序列测定的分 子工具及重组蛋白或融合产物的固化剂。
发明内容
本发明目的是对枯草芽孢杆菌发酵液提取工艺的改良，发酵液经冷冻离心、澄 清、超滤浓縮、脱盐和醇沉再溶解，添加稳定剂工艺，最终获得液体氨肽酶，整个工艺流程 的收率45% 55%，酶的比活为6Xl(fU/mL，最适温度50。C，温度稳定范围45 70°C， 最适pH8. 5，液体酶的稳定pH范围4. 5 6. 5，添加0. 2 y moL/LCo2+， pH5. 0、4。C保藏一个 月酶活保存率90% ;以大豆分离蛋白为底物，氨肽酶在温度5(TC， pH8.5，加酶量E/S = 3. 25X 1()SU/g，底物浓度6%条件下，水解4h后，水解液中游离氨基酸含量为107. 0375mg/ mL。多肽分子量在6000D以上的几乎没有，在5000左右约占0. 87% ，分子量600D左右的约 占28 % ，三肽二肽约占63. 76 % 。甲醛法测定水解度达50 % 。
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提取液体氨肽酶工艺的回收率统计如下
澄清 88% 92%
超滤浓縮2. 5倍 85 % 90 %
脱盐 75% 78%
醇沉 82% 85%
总回收率 45% 55% 本发明的技术方案一种提高液体氨肽酶稳定性的方法，枯草芽孢杆菌ZJ016的 发酵液经离心、澄清、超滤浓縮、脱盐、醇沉、复溶、控制PH和/或添加稳定剂或辅因子提高 稳定性，得食品级液体氨肽酶，工艺为
A枯草芽孢杆菌ZJ016发酵液中氨肽酶的提取 所述枯草芽孢杆菌Zj016的发酵液，详见食品与发酵工业2006年第32巻第3
期p7-10。 (1)发酵液经10000rpm，4。C离心10min后，取上清，弃沉淀； (2)向收集的上清液中加入(NH》^(V边加边搅拌，至(NH》^04质量分数达 16% -20%，以10000rpm，4。C离心10min后，弃沉淀，收集澄清液； (3)将收集到的澄清液进行超滤浓縮，浓縮2. 5-3倍，所选用超滤膜截留分子量为 50kDa ;室温，操作压0. 1Mpa， pH自然，流速30 35mL/min ;弃透过液;
(4)将得到的超滤浓縮液进行超滤脱盐，所选用超滤膜截留分子量为30kDa，室 温，操作压0. 1Mpa，流速40 45mL/min ;弃透过液； (5)将脱盐后的液体，加乙醇进行沉析，乙醇预冷，醇沉在冰浴中进行，醇沉时pH 9，至乙醇终浓度达68% _70%时得氨肽酶沉淀，静止10min后，8000rpm，4"离心10min，弃 上清，取沉淀； (6)醇沉后把沉淀用pH9、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解成酶液，控制酶液为
6000U/mL，4。C低温保藏； B提高液体氨肽酶的稳定性 (l)pH对酶活的影响 考察液体氨肽酶在pH从4 8之间的稳定性，通过定期测定酶活可知，液体酶在 pH 5时稳定性最好，一个月后相对酶活为80%。 (2)研究乙醇、氯化钙、苯甲酸钠、甘油、硫代硫酸钠、对液体酶稳定性的影响，在酶 活为1500U/mL左右时，以上稳定剂对酶的稳定性有影响，以苯甲酸钠影响最显著，控制酶 液中苯甲酸钠质量浓度为0. 1%时，_201:保藏，一个月后相对酶活为80%左右。
(3)当酶活在6500U/mL左右时，添加0.2iimol/LCo"(辅因子)，4t:一个月后，相 对酶活保存率90%左右，没加Co"仅为60%左右。 采取如上措施之一项，或(1)和(2)两项，或(1)和(3)两项。
制得的高稳定性液体氨肽酶的应用，用于大豆分离蛋白深度水解，步骤为
(1)大豆分离蛋白配底物浓度为6%溶液后，在85t:恒温水浴15min ;
(2)冷却至室温，调pH8. 5 ; (3)调温到5(TC，加入氨肽酶量为E/S二 2. 5 3. 25Xl()5U/g，不断的搅拌，用 2mol/L NaOH滴定，维持反应pH值8. 5，精确到±0. 1 ;
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(4)反应4h后，使水解液迅速升温至9(TC加热10min，钝化水解液。 在优化的条件下，氨肽酶对大豆分离蛋白进行水解。将水解液分别进行水解度、游
离氨基酸、多肽分子量分布分析。 甲醛法测定水解度达50 % 。 水解液中游离氨基酸的测定使用氨基酸分析液相色谱仪(Agl100)进行测定，游 离氨基酸的含量为107. 0375mg/mL，结果如图1。 Waters 600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和Empower工作站)测多肽分 子量分布，水解液中已没有大分子物质，二肽三肽物质占63%左右。图谱如图2。
氨肽酶活性测定LNA法，测定时，首先加入一定数量的Tris-HCl缓冲液和底物 (L-亮氨酸对硝基苯胺L-leu-pNA)，然后再加入稀释一定倍数的粗酶液，在5(TC水浴反应 10min后，405nm比色测定酶活。 酶活力定义5(TC ，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1微摩尔的对硝基苯 胺所需酶量，定义为一个酶活单位。 本发明的有益效果液体氨肽酶的提取方法容易扩大生产，通过添加离子和稳定 剂使液体氨肽酶达到很好的稳定效果，为保藏和应用提供了基础，氨肽酶水解大豆分离蛋 白后，水解液中游离氨基酸的含量达到10%，在食品和饮料中具有很好的应用空间，寡肽物 质占60%以上，在制备抗血压、抗氧化性肽方面具有很好的应用前景。
图1氨肽酶水解大豆分离蛋白液中游离氨基酸图谱。
图2氨肽酶水解大豆分离蛋白液中多肽分子量分布。
图3枯草芽孢杆菌液体氨肽酶提取工艺示意图。
具体实例方式
实施例1 将枯草芽孢杆菌Zj016发酵液在4°C， 10000rpm离心10min收集3. 5L发酵液， 在4。C下加入(NH4)2S04670g(边加边搅拌)，4°C， 10000rpm离心10min收集澄清液3. 6L， 选用50kDa的超滤膜进行浓縮到1. 4L，流速30 35mL/min ;选用30kDa的超滤膜脱盐后 1. 4L，流速40mL/min ;向脱盐液中再加入预冷的无水乙醇3. 3L， 10min后，4°C ， 8000rpm离 心10min收集沉淀，将沉淀溶解，添加苯甲酸钠作为稳定剂，控制酶液中苯甲酸钠质量浓度 为0. 1%，得液体氨肽酶。大豆分离蛋白配底物浓度为6%溶液后，在85t:恒温水浴15min， 冷却调pH8. 5，加酶量E/S = 3. 25X 105U/g，在5(TC水解4h水解液中游离氨基酸含量为 107. 0375mg/mL。多肽分子量在6000D以上的几乎没有，在5000左右约占0. 87%，分子量 600D左右的约占28 % ，三肽二肽约占63. 76 % 。甲醛法测定水解度达50 % 。
实施例2 将枯草芽孢杆菌Zj016发酵液在4°C ， 10000rpm离心10min收集2. 5L发酵液，在 4"下加入(NH4)2S04470g(边加边搅拌)，4°C， 10000rpm离心10min收集澄清液2. 5L，选用 50kDa的超滤膜进行浓縮到0. 85L，流速30 35mL/min ;选用30kDa的超滤膜脱盐后0. 85L， 流速40mL/min，向脱盐液中再加入预冷的无水乙醇1. 8L， 10min后，4°C，8000rpm离心10min 收集沉淀，将沉淀溶解，添加0. 2 ii mol/L Co2+辅因子得液体氨肽酶。大豆分离蛋白配底物浓度为6%溶液后，在85"C恒温水浴15min，冷却调pH8. 5，加酶量E/S = 2. 5X 105U/g，在 5(TC水解4h蛋白水解液中游离氨基酸的含量为64. 72mg/mL，分子量从5000 12000D的大 分子约占2 % ，在600 5000D左右的多肽约占45. 77 % ，其中三肽二肽约占52. 3 % ，甲醛法 测得终水解度为35.3%。
权利要求
一种提高液体氨肽酶稳定性的方法，其特征是枯草芽孢杆菌Zj016的发酵液经离心、澄清、超滤浓缩、脱盐、醇沉、复溶、控制pH和/或添加稳定剂或辅因子提高稳定性，得食品级液体氨肽酶，工艺为A枯草芽孢杆菌Zj016发酵液中氨肽酶的提取(1)发酵液经10000rpm，4℃离心10min后，取上清，弃沉淀；(2)向收集的上清液中加入(NH4)2SO4，边加边搅拌，至(NH4)2SO4质量分数达16％-20％，以10000rpm，4℃离心10min后，弃沉淀，收集澄清液；(3)将收集到的澄清液进行超滤浓缩，浓缩2.5-3倍，所选用超滤膜截留分子量为50kDa；室温，操作压0.1Mpa，pH自然，流速30～35mL/min；弃透过液；(4)将得到的超滤浓缩液进行超滤脱盐，所选用超滤膜截留分子量为30kDa，室温，操作压0.1Mpa，流速40～45mL/min；弃透过液；(5)将脱盐后的液体，加乙醇进行沉析，乙醇预冷，醇沉在冰浴中进行，醇沉时pH 9，至乙醇终浓度达68％-70％时得氨肽酶沉淀，静止10min后，8000rpm，4℃离心10min，弃上清，取沉淀；(6)醇沉后把沉淀用pH9、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解成酶液，控制酶液为6000U/mL，4℃低温保藏；B提高液体氨肽酶的稳定性(1)控制酶液pH为5时稳定性最好，4℃一个月后相对酶活为80％；(2)添加苯甲酸钠作为稳定剂，控制酶液中苯甲酸钠质量浓度为0.1％时，-20℃保藏，一个月后相对酶活为80％；(3)添加0.2μmol/L Co2+辅因子，4℃一个月后，相对酶活保存率90％；采取以上措施之一项，或(1)和(2)两项，或(1)和(3)两项。
2. 用权利要求1所述方法制得的高稳定性液体氨肽酶的应用，其特征是用于大豆分离 蛋白深度水解，步骤为(1) 大豆分离蛋白配底物浓度为6%溶液后，在85t:恒温水浴15min ;(2) 冷却至室温，调pH8. 5 ;(3) 调温到50。C，加入氨肽酶量为E/S = 2. 5 3. 25 X 105U/g，不断的搅拌，用2mol/L NaOH滴定，维持反应pH值8. 5，精确到±0. 1 ;(4) 反应4h后，使水解液迅速升温至9(TC加热10min，钝化水解液。
全文摘要
一种提高液体氨肽酶稳定性的方法及该酶的应用，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。本发明涉及枯草芽孢杆菌Zj016液体氨肽酶的提取工艺，提高液体氨肽酶稳定性，氨肽酶在大豆分离蛋白深度水解的应用。枯草芽孢杆菌Zj016液体发酵液经过离心、澄清、浓缩、脱盐和乙醇沉淀、复溶操作得液体氨肽酶，通过控制pH条件和/或添加稳定剂可使液体氨肽酶保持稳定，氨肽酶可对大豆分离蛋白底物进行深度水解，产生较高含量的小肽和氨基酸，并有与许多内切酶组合应用的潜力，因而在蛋白原料的食品加工中具广泛的应用前景。
文档编号C12R1/125GK101717763SQ200910233288
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者吕广林, 李欣艳, 田亚平, 高新星 申请人:江南大学