一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌t7表达系统稳定性的方法
【专利摘要】一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，属于大肠杆菌表达调控领域。本发明利用基因工程技术，以细菌来源的普鲁兰酶为表达蛋白，构建了表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌。通过使用含有lac操纵子和阻遏物基因lacI的pET表达载体pET-22b(+)和pET-28a(+)，构建了重组菌E.coliBL21/pET-22b(+)-pul和E.coliBL21/pET-28a(+)-PelB-pul，利用lac操纵子严谨的双阻遏调控策略，基本消除了毒性外源蛋白的本底表达，提高了冷冻甘油菌种的表达稳定性和乳糖自诱导后的目标蛋白表达量，增强了大肠杆菌表达系统稳定性。本发明解决了大肠杆菌T7表达系统中常见的系统稳定性问题，开发了增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法。
【专利说明】—种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法
【技术领域】
[0001]—种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法,属于大肠杆菌表达调控领域。
【背景技术】
[0002]重组技术已广泛用于目标蛋白的高水平表达。在多种可用于异源蛋白表达的系统中，大肠杆菌系统始终是最常用的表达宿主。与其他表达宿主相比，大肠杆菌具有众多优势，如遗传背景清楚、生长迅速、可在价格低廉的培养基中达到高密度和拥有过量表达目标蛋白的能力。基于T7 RNA聚合酶的T7系统表达的目标蛋白量可高达细胞总蛋白量的50%，因此显示了与其他大肠杆菌系统的优势。
[0003]T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度是大肠杆菌自身RNA聚合酶的5倍，其高活力赋予了 T7系统强大的合成重组蛋白的能力。但T7 RNA聚合酶的高活力已被证明了对表达系统存在一些负面作用，主要表现为:虽然T7 RNA聚合酶的编码基因，位于大肠杆菌宿主BL21(DE3)染色体上的T7基因受到7acUV5启动子和Iac操纵子序列的调控，只有极少量的T7RNA聚合酶“渗漏”表达，但由于T7 RNA聚合酶活力过高，即使没有诱导物存在，目标基因的转录也能被引发，产生本底表达。如果目标蛋白对大肠杆菌细胞有毒性，这种本底表达将会影响表达系统的稳定性和目标蛋白的正常表达，甚至表达菌株可能不稳定或积累有害突变。
[0004]已有一些研究致力于减少大肠杆菌T7表达系统的本底表达。一种减少本底表达的方法是使用含有与PET载体兼容的pLysS或pLysE质粒的宿主菌。这两种载体表达的T7溶菌酶，是T7 RNA聚合酶的天然抑制剂，能与T7 RNA聚合酶结合并抑制后者的活性。然而，虽然BL21 (DE3) pLysS菌株的本底表达水平几乎只有BL21 (DE3)菌株的十分之一，但前者的本底表达依然存在，并且依然可能引起系统不稳定的问题。而且，T7溶菌酶是一种双功能的蛋白，它对大肠杆菌细胞壁具有破坏作用，因此含有PLysS或pLysE质粒的菌株生长较慢。另外诱导后，T7溶菌酶将减弱表达，使目标蛋白表达量很低。向培养基中添加0.5-1%葡萄糖，产生的代谢阻遏效应也能够降低T7 RNA聚合酶的本底表达。
[0005]以上的方法都是直接针对T7 RNA聚合酶的本底表达而设计的，目标都是减少T7RNA聚合酶的本底表达。本发明开发出一种不直接减弱T7 RNA聚合酶的本底表达，但可以阻止T7 RNA聚合酶引发表达质粒上外源基因转录的方法。在pET载体的T7启动子下游插入Iac操纵子，形成TJ-1ac启动子，能有效地降低目标蛋白的本底表达。'l-lac启动子可提供一个he阻遏物的结合位点，当体系中不存在诱导物时，Iac阻遏物可紧紧地结合于Π-lac启动子的Iac操纵子序列上，阻止由本底表达产生的T7 RNA聚合酶通过，干扰了mRNA链的延伸，从而减少 外源基因在未诱导状态下的本底转录。如果系统中存在足够量的he阻遏物以占据细胞中所有的操纵子位点，未诱导细胞中目标蛋白的本底表达将几乎被完全地消除，表达系统也将获得稳定。
【发明内容】
[0006](一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法。本发明以细菌来源的普鲁兰酶为表达蛋白，使用了含有he操纵子和阻遏物基因IeicI的pET表达载体，利用Iac操纵子严谨的双阻遏调控策略，基本消除了毒性报道蛋白的本底表达，提高了大肠杆菌表达系统稳定性，从而开发了增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法。
[0007](二)技术方案
一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，首先构建了表达长野芽胞杆菌naganoensis^ CCTCC M 2012388普鲁兰酶的重组大肠杆菌万.BL21 (DE3) / pET-20b (+) -pul，该重组菌携带的表达载体pET_20b (+)不含有Iac操纵子和阻遏物基因IacI。在诱导表达过程中发现报道蛋白存在本底表达，并且重组菌的冷冻甘油管在冻存过程中表达水平不断下降，表明表达系统存在不稳定的现象。因此使用含有Iac操纵子和阻遏物基因IacI的载体pET_22b (+)及pET_28a (+)，利用Iac操纵子严谨的双阻遏调控策略，构建了重组菌万.co7iBL21/ pET-22b (+)-pul和万.co7iBL21/pET-28a(+)-PelB- pul。比较了三株重组大肠杆菌的本底表达水平、冷冻甘油管表达量稳定性和乳糖自诱导后的目标蛋白表达量。
[0008]( I)普鲁兰酶基因的获得
长野芽孢杆菌naganoensis) CCTCC M 2012388 培养基:CaCl2 0.25 g/L,MgSO4.7Η20 0.5 g/L, (NH4)2SO4 0.2 g/L，酵母提取物 2 g/L，无水葡萄糖 5 g/L, KH2PO4 3g/L,无机盐溶液I mL/L, pH 5.0,双蒸水配制。
[0009]无机盐溶液=ZnSO4.7H20 0.1 g/L, MnCl2.H2O 0.03 g/L, H3BO3 0.3 g/L,CoCl2.6H20 0.2 g/L, CuCl2.2H20 0.01 g/L, NiCl2.6H20 0.02 g/L, Na2MoO4.2H20 0.03g/L,双蒸水配制。
[0010]将长野芽孢杆菌UaciBw1S naganoensis) CCTCC M 2012388菌种接种于含有25mL培养基的250 mL摇瓶中，于37°C、200 rpm振荡培养72小时。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗漆两次，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA ExtractionMiniprep System (VIOGENE 公司)提取基因组。
[0011]引物1:5，- gaacaGGATCCagatgggaacaccacaaaC _3，，
引物 2:5，- attccctcgagtttaccatcagatgggct _3，。
[0012]引物I含有BamHl限制性酶切位点，引物2含有Xho I限制性酶切位点。
[0013]PCR 反应体系:ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L, dNTP(25 mmol/L)0.5yL，引物 I (50 pmol/μ L) I yL，引物 2 (50 pmol/μ L) I μ L，基因组 DNA 5 μ L，TaqDNA polymerase (5 U/μ L) 0.5 μ L。
[0014]以长野芽孢杆菌naganoensis') CCTCC M 2012388基因组为模板,米用PCR方法扩增普鲁兰酶基因。PCR反应过程:95°C预变性5 min ；95°C I min,60°C 0.5 min、72°C 2 min，进行 30 个循环；72°C延伸 10 min。
[0015]利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。[0016]DNA溶液中加入1/10体积的乙酸钠溶液(3 mol/L, pH 5.2)和2倍体积无水乙醇，-20°C沉淀I小时。12000 rpm于4°C离心30 min。加入75%乙醇500 μ L洗涤，12000rpm于4°C离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或_20°C保存。
[0017](2)含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建 a> pET-20b (+) -pul 的构建
利用质粒提取试剂盒Min1-Plasmid Rapid Isolation Kit (北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pET20b (+)。
[0018]按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2秒钟使液体集中于管底，37°C水浴3小时，在管中加入1/10体积的Loading Buffer或将管置于65°C保温10分钟，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。
[0019]反应体系组成:10XHBuffer 4 μ L，DNA 10 μ L, BamHl 2 μ L, Xhol 2 μ L,ddH20将体系补足40 μ L0
[0020]目的基因与质粒pET20b(+)的连接
将普鲁兰酶基因与质粒pET20b(+)连接，反应体系组成如下:质粒pET-20b(+) 0.8μ L，普鲁兰酶基因4.2 μ L, Ligation Solution 5 μ L0混合连接液，将其置于16°C培养箱中连接反应12小时。
[0021 ] 重组质粒转化大肠杆菌
在100 μ L大肠杆菌万.coli BL21 (DE3)感受态细胞悬液中加入10 μ L连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30分钟。转入42°C水浴中，热击90秒。快速转移至冰浴中，冷却2分钟。加入700 μ L的LB液体培养基，37°C、100 rpm摇床温育培养I小时。培养后菌液3000rpm离心2分钟，弃上清600 μ L，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μ g/mL氨苄抗生素的LB平板上，37°C倒置培养。获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌疋coli BL21 (DE3)/pET-20b (+) -pul。
[0022]b、pET-22b (+) -pul 和 pET_28a (+) -PelB- pul 的构建
将重组质粒pET-20b (+)-/^/7和表达载体pET-28a(+)、pET_22b (+)分别用限制性内切酶油al和通ol分步单酶切。按照水、缓冲液、质粒、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2秒使液体集中于管底，37°C水浴3小时，在管中加入1/10体积的Loading Buffer或将管置于65°C保温10分钟，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。反应体系组成:10XH Buffer 4μ L, DNA 10 μ I, IbaI 2 μ Ι,Ι?οΙ 2 μ L，ddH20 将体系补足 40 μ L。
[0023]将胶回收线性化的目标片段分别与pET_28a(+)及pET_22b (+)载体连接，反应体系组成如下:质粒载体I μ L,目标片段4 μ L, Ligation Solution 5 μ L。混合连接液,将其置于16°C培养箱中连接反应12小时。
[0024]重组质粒转化大肠杆菌
在100 μ L大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)感受态细胞悬液中加入10 μ L连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30分钟。转入42°C水浴中，热击90秒。快速转移至冰浴中，冷却2分钟。加入700 μ L的LB液体培养基，37°C、100 rpm摇床温育培养I小时。培养后菌液3000rpm离心2分钟，弃上清600 μ L，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培养。获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌万.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-PelB-/w/7 及疋 coli BL21 (DE3)/pET_22b (+)-/?/人
[0025]双阻遏效应基本上消除了重组大肠杆菌的本底表达现象，重组大肠杆菌冷冻甘油管的表达显示双阻遏效应可维持表达系统的稳定性，及重组大肠杆菌自诱导表达的稳定性得到提闻。
[0026]( 3 )、重组大肠杆菌的本底表达比较
LB培养基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L，pH7.0，双蒸水配制。需要时使用前加入氨节青霉素(100 μ g/mL)或卡那霉素(50 μ g/mL),固体培养基添加15 g/L琼脂粉。
[0027]挑取新转化的重组大肠杆菌单菌落接种于3 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养过夜。取0.5 mL培养液转接于50 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养至OD6tltl约为1.2。培养液转入20°C中继续培养12小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟，菌体沉淀超声破碎，破碎液于12000rpm离心20分钟，取上清液用于胞内普鲁兰酶酶活测定。
[0028]经酶活检测，厶coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-/w7的胞内组分酶活约为1.9 U/mL，而万.BL21 (DE3)/pET28a(+)-Pe 1B-/W/7 及万.coli BL21(DE3) /pET-22b (+) -pul的胞内组分则没有测到酶活，表明由于表达载体pET-22b(+)和pET-28a(+)中的Iac操纵子和阻遏物基因IeicI的存在，阻遏物可同时结合于大肠杆菌染色体上T7基因上游的Iac操纵子和表达载体的Iac操纵子上，这种双阻遏效应基本上消除了本底表达现象。
[0029]普鲁兰酶测定方法` 取100 μ L用100 mM、pH 5.0的醋酸缓冲液适当稀释的酶液与等体积的溶于100 mM、pH 5.0醋酸缓冲液中的10 g/L普鲁兰相混合于50 °C水浴中保温30分钟。加入DNS试剂300 μ L摇匀，置于沸水中煮沸15分钟，取出以流动水迅速冷却后，于540 nm波长处，以0.5 cm比色杯，测定反应液的吸光度值。
[0030]酶活单位定义:在上述指定的条件下，每分钟催化分解普鲁兰多糖生成相当于Iμ mo I葡萄糖的还原糖所需的酶为I个酶活单位(U)。
[0031](4)、重组大肠杆菌冷冻甘油管的表达稳定性比较
三种重组表达质粒转化万.co7i BL21(DE3)感受态细胞，转化子长出后立刻接种于3 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养过夜。取0.5 mL培养液转接于50 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养至OD6tltl约为1.2。培养液转入20°C中继续培养12小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟，上清留样为胞外组分。菌体沉淀超声破碎，破碎液于12000 rpm离心20分钟，取上清液为胞内组分。测定胞内外酶活结果为第一批的IPTG诱导表达结果。剩余试管种子液用于保存冷冻甘油管，于_70°C中冷冻保存。分别在冻存2天及4天后取出用于第二、第三批诱导表达。测定比较各工程菌的胞内外总酶活。
[0032]比较不同发酵批次的酶活结果发现，随着在-70°C中冻存天数的增加，E.coliBL21(DE3)/pET-20b {+)~pul的产酶能力不断下降。菌种在_70°C中冻存4天，在LB培养基中发酵后胞内酶活下降到新转化菌种发酵酶活的38%，说明该工程菌在冻存状态下性能不稳定，目标蛋白的表达能力会迅速下降。而万.coli BL21 (DE3)/pET_22b (+)和疋coliBL21 (DE3) /pET-28a (+) -PelB- /^/7的酶活水平则一直约为15 U/mL，即一直保持着最初的产酶能力，说明载体中Iac操纵子产生的双阻遏效应可维持表达系统的稳定性，使这两株工程菌在冻存状态下可保持正常的产酶性能。
[0033]( 5 )、重组大肠杆菌自诱导表达的比较
自诱导培养基(g/L):β_乳糖I~50，无水葡萄糖0.5，甘油5，KH2PO4 6.8，MgSO4 0.24，胰蛋白胨10，酵母提取物5，Na2HPO4 7.LNa2SO4 0.71，NH4Cl 2.67，痕量元素溶液400 μ L/L, pH 7.5^8.0,双蒸水配制。
[0034]痕量元素溶液(g/L)=FeCl3 8.125，CaCl2 2.22, MnCl2 2.52, ZnSO4 1.61, CoCl20.26，CuCl2 0.27，NiCl2 0.26，Na2MoO4 0.41，Na2SeO3 0.346，H3BO3 0.124，HCl 2.19，双蒸水配制。
[0035]三种重组表达质粒转化万.coli BL21感受态细胞，转化子长出后立刻接种于3 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养过夜。取2mL培养液接种于50mL含相应抗生素的自诱导培养基中，37°C、200rpm下培养2小时后转入20°C中继续培养70小时。分别测定胞内外酶活水平。
[0036]发酵结束后，厶coli BL21(DE3)/pET-20M+)-/^7的胞内外总酶活为23 U/mL,而厶 coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-/w7 及万.coli BL21(DE3)/ pET_28a (+)-PelB-/w7 的总酶活均为550 U/mL，表明由于载体中Iac操纵子的双阻遏效应消除了目标蛋白的本底表达，表达系统的稳定性得到提高，使菌种在发酵过程中也能保持目标蛋白的表达能力，不会发生退化。
[0037](三)有益效果
成功克隆了长野芽孢杆菌naganoensis ) CCTCC NO:M 2012388普鲁兰酶编码基因，该基因全长2781 bp，编码926个氨基酸残基，其基因的核苷酸序列为:SEQ ID NO:1，其氨基酸组成为SEQ ID NO:2。利用不含有操纵子和阻遏物基因hc/的载体pET-20b(+)构建了含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌疋coli BL21(DE3) /pET-20b (+) -pul，利用含有Iac操纵子和阻遏物基因IacI的载体pET_28a (+)和pET-22b⑴分别构建了含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌疋coli BL21 (DE3) /pET-28a(+)-PelB-/w/7 和万.coli BL21 (DE3)/pET_22b (+)-/?/人
[0038]使用不含操纵子和阻遏物基因的pET载体系统疋coli BL21(DE3)/pET-20b (+) -pul表达毒性报道蛋白时，发现存在明显的本底表达和随之引起的表达系统不稳定的现象。表达系统的不稳定引起了重组菌冷冻甘油管的表达水平下降和在自诱导培养基中表达量偏低的问题。通过使用含有he操纵子和阻遏物基因的pET载体系统疋coliBL21 (DE3) /pET-22b (+) -pul 和万.coli BL21 (DE3)/pET-28a(+)-PelB-/w7，毒性报道蛋白的本底表达基本被消除，重组菌冷冻甘油管的蛋白表达能力得到稳定，在自诱导培养基中的蛋白表达量大幅提高。表明Iac操纵子严谨的双阻遏调控策略，增强了大肠杆菌表达系统的稳定性。这些工作为增强重组大肠杆菌的系统稳定性提供了有效策略，对高效表达目标蛋白具有重要意义。
[0039]该长野芽抱杆菌naganoensis)CCTCC M 2012388 ;保藏单位:中国典型培养物保藏中心，简写CCTCC，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M 2012388，保藏日期为2012年9月28日。在以前专利申请中已用过，“一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法”，申请号201210481749.3，申请日2012年11月24日。
【具体实施方式】
[0040]实施例1
LB培养基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L，pH7.0，双蒸水配制。需要时使用前加入氨节青霉素(100 μ g/mL)或卡那霉素(50 μ g/mL),固体培养基添加15 g/L琼脂粉。
[0041]挑取新转化的疋coli BL21(DE3)/pET-20b (+)-/^/7单菌落接种于3 mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养过夜。取0.5 mL培养液转接于50 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养至0D_约为1.2。培养液转入20°C中继续培养12小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟，菌体沉淀超声破碎，破碎液于12000 rpm离心20分钟，取上清液为胞内组分，普鲁兰酶酶活为 1.9 U/mL ο 而万.coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-PelB-/w7 及疋 coli BL21(DE3) /pET-22b (+) -pul的胞内组分则没有测到酶活。
[0042]实施例2
LB培养基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L，pH7.0，双蒸水配制。需要时使用前加入氨节青霉素(100 μ g/mL)或卡那霉素(50 μ g/mL),固体培养基添加15 g/L琼脂粉。
[0043]重组质粒pET_20b (+) -pul转化万.coli BL21感受态细胞，转化子长出后立刻接种于3 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养过夜。取0.5 mL培养液转接于50 mL含相应抗 生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养至0D_约为1.2。培养液转入20°C中继续培养12小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟，上清留样为胞外组分。菌体沉淀超声破碎，破碎液于12000 rpm离心20分钟，取上清液为胞内组分。胞内外总酶活为15 U/mL，作为第一批的IPTG诱导表达结果。剩余试管种子液用于保存冷冻甘油管，于_70°C中冷冻保存。分别在冻存2天和4天后取出用于第二、第三批诱导表达，酶活结果分别为8.6 U/mL和5.1 U/mL。而万.coli BL21(DE3)/pET-22b (+) -pul 和万.coli BL21 (DE3) /pET_28a (+) -PelB- pul 的酶活水平则一直约为 15U/mL ο
[0044]实施例3
自诱导培养基(g/L):β_乳糖I~50，无水葡萄糖0.5，甘油5，KH2PO4 6.8，MgSO4 0.24，胰蛋白胨10，酵母提取物5，Na2HPO4 7.LNa2SO4 0.71，NH4Cl 2.67，痕量元素溶液400 μ L/L, pH 7.5^8.0,双蒸水配制。
[0045]痕量元素溶液(g/L)=FeCl3 8.125，CaCl2 2.22, MnCl2 2.52, ZnSO4 1.61, CoCl20.26，CuCl2 0.27，NiCl2 0.26，Na2MoO4 0.41，Na2SeO3 0.346，H3BO3 0.124，HCl 2.19，双蒸水配制。
[0046]重组质粒pET_22b (+) -pul转化万.coli BL21感受态细胞，转化子长出后立刻接种于3 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养过夜。取2mL培养液接种于50mL含相应抗生素的自诱导培养基中，37°C、200rpm下培养2小时后转入20°C中继续培养70小时。测得胞内外总酶活为23 U/mL。而疋coli BL21 (DE3) /pET-22b (+) -pulRE.coli BL21(DE3)/ pET-2 8a(+)-PelB-/7?7 的总酶活均为 550 U/mL。
【权利要求】
1.一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，其特征在于:以来源于长野芽孢杆菌心naganoensis) CCTCC M 2012388的普鲁兰酶为表达蛋白，使用含有操纵子和阻遏物基因IacI的pET表达载体pET_22b (+)及pET_28a (+)，利用Iac操纵子严谨的双阻遏调控策略，构建了重组菌万.co7iBL21/pET-22b (+) -pul RE.co7iBL21/pET-28a(+)-PelB- /^/7，作为对照，构建了不含有操纵子和阻遏物基因IacI的表达系统万.coli BL21(DE3)/ pET-20b (+) -pul ;步骤为: (1)普鲁兰酶基因的获得
长野芽孢杆菌naganoensis) CCTCC M 2012388 培养基:CaCl2 0.25 g/L,MgSO4.7Η20 0.5 g/L, (NH4)2SO4 0.2 g/L，酵母提取物 2 g/L，无水葡萄糖 5 g/L, KH2PO4 3g/L,无机盐溶液I mL/L, pH 5.0,双蒸水配制；
无机盐溶液=ZnSO4.7H20 0.1 g/L, MnCl2.H2O 0.03 g/L, H3BO3 0.3 g/L, CoCl2.6H20.0.2 g/L, CuCl2.2H20 0.01 g/L, NiCl2.6H20 0.02 g/L, Na2MoO4.2H20 0.03 g/L，双蒸水配制； 将长野芽孢杆菌UaciBm naganoensis ) CCTCC M 2012388菌种接种于含有25 mL培养基的250 mL摇瓶中，于37°C、200 rpm振荡培养72小时，培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用V10GENE公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNAExtraction Miniprep System 提取基因组； 引物1:5’ -gaa caG GAT CCa gat ggg aac acc aca aaC _3，，
弓丨物2:5，- att ccc tcg agt tta cca tea gat ggg ct _3’ ； 引物I含韦BamHl限制性酶切位点，引物2含有通ο I限制性酶切位点； PCR 反应体系:ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 0.5μ L,50 pmol/yL 的引物 I I yL，50 pmol/yL 的引物 2 I μ L，基因组 DNA 5 yL,5 U/μ L 白勺 Taq DNA polymerase 0.5 μ L ； 以长野芽孢杆菌CCTCC M 2012388基因组为模板，采用PCR方法扩增普鲁兰酶基因，PCR反应过程:95°C预变性5 min ；95°C I min,60°C 0.5 min、72°C 2 min，进行30个循环；72°C延伸 10 min ； 利用上海申能博彩生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit纯化DNA片断； DNA溶液中加入1/10体积的pH 5.2,3 mol/L的乙酸钠溶液和2倍体积无水乙醇，-20°C沉淀I小时，12000 rpm于4°C离心30 min，加入75%乙醇500 μ L洗涤，12000rpm于4°C离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或_20°C保存； (2)含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建 a> pET-20b (+) -pul 的构建 利用北京博大泰克生物基因技术有限公司的质粒提取试剂盒Min1-Plasmid RapidIsolation Kit 提取质粒 pET_20b (+)； 按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2秒钟使液体集中于管底，37°C水浴3小时，在管中加入1/10体积的Loading Buffer或将管置于65°C保温10分钟，终止酶切反应，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；反应体系组成:10 XH Buffer 4 μ L,DNA 10 μ L,BamHl 2 μ L,Xhol 2 μ L，ddH20 将体系补足40 μ L ； 目的基因与质粒pET-20b (+)的连接 将普鲁兰酶基因与质粒pET-20b(+)连接，反应体系组成如下:质粒pET-20b(+) 0.8μ L，普鲁兰酶基因4.2 yL,Ligation Solution 5 μ L ;混合连接液，将其置于16°C培养箱中连接反应12小时； 重组质粒转化大肠杆菌 在100 μ L大肠杆菌疋BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μ L连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30分钟，转入42°C水浴中，热击90秒，快速转移至冰浴中，冷却2分钟，加入700 μ L的LB液体培养基，370C、100 rpm摇床温育培养I小时，培养后菌液3000rpm离心2分钟，弃上清600 μ L，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μ g/mL氨苄抗生素的LB平板上，37°C倒置培养，获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌疋coli BL21 (DE3)/pET-20b (+) -pul ；
b、pET-22b (+) -pul 和 pET_28a (+) -PelB- pul 的构建 将重组质粒pET-20b (+)-/^/7和表达载体pET-28a(+)、pET_22b (+)分别用限制性内切酶油al和通ol分步单酶切，按照水、缓冲液、质粒、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2秒使液体集中于管底，37°C水浴3小时，在管中加入1/10体积的Loading Buffer或将管置于65°C保温10分钟，终止酶切反应，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；反应体系组成:10XH Buffer 4μ L, DNA 10 μ I, IbaI 2 μ Ι,Ι?οΙ 2 μ L, ddH20 将体系补足 40 μ L ; 将胶回收线性化的目标片段分别与pET-28a(+)及pET-22b(+)载体连接，反应体系组成如下:质粒载体I μ L,目标片段4 μ L, Ligation Solution 5 μ L,混合连接液,将其置于16°C培养箱中连接反应12小时； 重组质粒转化大肠杆菌 在100 μ L大肠杆菌疋BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μ L连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30分钟，转入42°C水浴中，热击90秒:快速转移至冰浴中，冷却2分钟；加入700 μ L的LB液体培养基，370C、100 rpm摇床温育培养I小时，培养后菌液3000rpm离心2分钟，弃上清600 μ L，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培养，获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌万.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-PelB-/w/7 及疋 coli BL21 (DE3) /pET-22b (+) -pul ； 双阻遏效应基本上消除了重组大肠杆菌的本底表达现象，重组大肠杆菌冷冻甘油管的表达显示双阻遏效应可维持表达系统的稳定性，及重组大肠杆菌自诱导表达的稳定性得到提闻。
2.根据权利要求1所述基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，其特征在于:重组大肠杆菌的本底表达比较； 挑取新转化的重组大肠杆菌单菌落接种 于3 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于370C >200 rpm振荡培养过夜；取0.5 mL培养液转接于50 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养至OD6tltlS 1.2 ;培养液转入20°C中继续培养12小时，培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟，菌体沉淀超声破碎，破碎液于12000 rpm离心20分钟，取上清液用于胞内普鲁兰酶酶活测定；经酶活检测，厶coli BL21 (DE3) /pET_20b (+) -pul的胞内组分酶活为1.9 U/mL，而E.coli BL21 (DE3) /pET_28a (+) -?el^>-pul RE.coli BL21 (DE3) / pET_22b (+) -pul 的胞内组分则没有测到酶活，表明由于表达载体pET-22b(+)及pET-28a(+)中的操纵子和阻遏物基因IacI的存在，阻遏物可同时结合于大肠杆菌染色体上T7基因上游的Iac操纵子和表达载体的Iac操纵子上，这种双阻遏效应基本上消除了本底表达现象。
3.根据权利要求1所述基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，其特征在于:重组大肠杆菌冷冻甘油管的表达稳定性比较； 三种重组表达质粒转化万.co7i BL21(DE3)感受态细胞，转化子长出后立刻接种于3 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养过夜；取0.5 mL培养液转接于50 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养至OD6tltl约为1.2 ;培养液转入20°C中继续培养12小时；培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟，上清留样为胞外组分；菌体沉淀超声破碎，破碎液于12000 rpm离心20分钟，取上清液为胞内组分；测定胞内外酶活结果为第一批的IPTG诱导表达结果，剩余试管种子液用于保存冷冻甘油管，于-70°C中冷冻保存，分别在冻存2天及4天后取出用于第二、第三批诱导表达，测定比较各工程菌的胞内外总酶活； 比较不同发酵批次的酶活结果发现，随着在-70°C中冻存天数的增加，疋coliBL21(DE3)/pET-20b {+)~pul的产酶能力不断下降，菌种在_70°C中冻存4天，在LB培养基中发酵后胞内酶活下降到新转化菌种发酵酶活的38%，说明该工程菌在冻存状态下性能不稳定，目标蛋白的表达能力会迅速下降；而万.coli BL21 (DE3)/pET-22b(+)-/w/7&i?.coliBL21 (DE3) /pET-28a (+) -PelB- /^/7的酶活水平则一直为15 U/mL，即一直保持着最初的产酶能力，说明载体中Iac操纵子产生的双阻遏效应可维持表达系统的稳定性，使这两株工程菌在冻存状态下可保持正常的产酶性能。
4.根据权利要求1所述基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，其特征在于:重组大肠杆菌自诱导表达的比较； 自诱导培养基g/L: β -乳糖I~50，无水葡萄糖0.5，甘油5，KH2PO4 6.8，MgSO4 0.24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7.1,Na2SO4 0.71 ,NH4Cl 2.67，痕量元素溶液 400 μ L/L，pH 7.5^8.0,双蒸水配制；
痕量元素溶液 g/L =FeCl3 8.125，CaCl2 2.22，MnCl2 2.52，ZnSO4 1.61，CoCl2 0.26，CuCl2 0.27，NiCl2 0.26，Na2MoO4 0.41，Na2SeO3 0.346，H3BO3 0.124，HCl 2.19，双蒸水配制； 三种重组表达质粒转化万.co7i BL21感受态细胞，转化子长出后立刻接种于3 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养过夜；取2mL培养液接种于50mL含相应抗生素的自诱导培养基中，37°C、200rpm下培养2小时后转入20°C中继续培养70小时，分别测定胞内外酶活水平； 发酵结束后，S coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-/?7的胞内外总酶活为23 U/mL，而S coliBL21 (DE3) /pET-22b (+) -pul RE.coli BL21 (DE3) / pET_28a (+) -?el^>-pul 的总酶活均为 550U/mL，表明由于载体中Iac操纵子的双阻遏效应消除了目标蛋白的本底表达，表达系统的稳定性得到提高，使菌种在发酵过程中也能保持目标蛋白的表达能力，不会发生退化。
【文档编号】C12R1/19GK103555751SQ201310505664
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】聂尧, 徐岩 申请人:江南大学