一种碱性过氧化氢酶高产菌及该菌株发酵法生产工艺的制作方法
【专利摘要】本发明一种碱性过氧化氢酶高产菌及该菌株发酵法生产工艺，属于生物工程【技术领域】。本发明公开了碱性过氧化氢酶高产菌，经鉴定其属于节杆菌Arthrobactersp.，保藏编号为CGMCCNO.8181。本发明还公开了所述的碱性过氧化氢酶高产菌生产碱性过氧化氢酶的方法，本发明提出了一种碱性过氧化氢酶的高产菌，用该菌株经摇瓶液体深层发酵可制备碱性过氧化氢酶，酶活达到49706U/mL，可用于棉纺织品的染整处理过程，能改善产品品质，有效地改进现有棉纺织品染整处理工艺，使得生产过程更加绿色环保。
【专利说明】一种碱性过氧化氢酶高产菌及该菌株发酵法生产工艺【技术领域】[0001]一种碱性过氧化氢酶高产菌及用该菌株发酵法生产碱性过氧化氢酶，特别是一株高产碱性过氧化氢酶的菌株，属于生物工程【技术领域】。【背景技术】[0002]在众多行业中，纺织业是我国的传统产业和支柱产业。在纺织行业上，近些年来对于过氧化氢酶能够在纺织的过程中发挥作用的研究报道也是屡见不鲜，并且将过氧化氢酶作为一种在纱线过程中经济的除去剩余过氧化氢的物质，同样也在织物的漂白这一工序中发挥作用，与之相比，传统的水清洗方式是有较大的弊端的:例如过氧化氢作为漂白剂使用之后清除不是很容易而且残余的还原剂对于纤维也将有一些不良的影响，而改用过氧化氢酶清洗之后，不仅节约用水还能提高工作效率。过氧化氢酶生物净洗工艺的优势具体表现为:1)显著降低水耗，能耗和废水量；2)高效催化，减少生产时间，提高生产能力，增加产值；3)酶剂用量少，降低生产成本；4)织物的质量更好，强度更高，柔软度更好；5)提升染色的准确性和安全性；6)操作更加安全和简便；7)产物是氧气和水，有利于环保。[0003]在织物漂白工艺中运用过氧化氢酶实现漂白虽具有良好的经济和环保效益，但是就目前来看，实现这一工艺的主要问题是高温和强碱性条件下过氧化氢酶的稳定性问题， 包括过氧化氢酶保存稳定性问题和反应稳定性问题，但是大多产品仍没有达到纺织工业强碱性(pH>10)的要求，同时在国内外的文献中节杆菌产过氧化氢酶酶活很低，远没有达到工业化的要求。过氧化氢酶来源丰富，几乎存在于所有好养生物中，随着细菌细胞壁破碎技术的成熟，过氧化氢酶应用将更为广泛。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种碱性过氧化氢酶高产菌及用该菌株发酵法生产碱性过氧化氢酶，所制备的碱性过氧化氢酶用于棉纺织品的染整处理过程。[0005]本发明的技术方案:从造纸厂土壤中分离得到一株菌LHM7719，经鉴定其属于节杆菌sp.,并于2013年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC N0.8181。[0006]碱性过氧化氢酶高`产菌生产碱性过氧化氢酶的方法，按照下述步骤进行:采用CGMCC NO:8181为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵制得碱性过氧化氢酶， 种子培养基是LB培养基:以g/L计，葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉浸膏5，氯化钠5，pH7.2 ;培养条件:培养时间为12~16小时，温度为29~32°C，摇床转速为160转/分钟。[0007]发酵培养基是LB培养基:以g/L计，木薯淀粉15~20，豆柏粉50~70，磷酸二氢钾0.5，初始pH为7.0;发酵条件:发酵时间为35~45小时，接种量为1%~8% (v/v)，装液量为40ml/250 ml,培养温度为30~40°C，摇床转速为200~250转/分钟。[0008]取15ml发酵液，12000转/分钟离心20分钟，然后加入15ml磷酸缓冲液混匀后， 超声波破碎取，12000转/分钟离心15分钟，取上清液得到碱性过氧化氢酶。[0009]中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号CGMCC NO:8181发酵所得过氧化氢酶的应用:所制备的碱性过氧化氢酶酶活达到49706U /mL，可用于棉纺织品的染整处理过程。[0010]本发明的有益效果:提出了一种碱性过氧化氢酶的高产菌，用该菌株经摇瓶液体深层发酵可制备碱性过氧化氢酶，酶活达到49706U /mL，可用于棉纺织品的染整处理过程， 能改善产品品质，有效地改进传统棉纺织品染整处理工艺，使得生产过程绿色环保。【具体实施方式】[0011]一个标准酶活单位(Iu)定义为:在37°C下，I min内分解I umol H2O2 (消光系数为39.4L/mol/cm)所需的酶量。H2O2的分解速率用紫外可见光分光光度计S53在240 nm, 30°C条件下进行测定。反应总体积为3 mL,含0.1ml酶液和2.9ml含有120 mmol/L H2O2和 50 mmol/L的磷酸二氢钾、磷酸氢二钾缓冲液(pH 7.0)。[0012]本发明所采用菌株，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCC NO:8181o[0013]中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号CGMCC NO:8181的筛选方法是从造纸厂土壤中筛选并经平板培养，滴加产气泡情况再筛选，并比较过氧化氢酶活性大小而得到。造纸厂土壤经过两次LB培养基增值培养，涂平板，培养后滴加0.2ml3%过氧化氢于大小均匀的菌落上，选择产气泡迅速且持续时间久的菌落进行试管发酵培养，通过比较碱性过氧化氢酶分解H2O2能力的大小，最终确定菌株为LHM7719。经鉴定其属于节杆菌 Arthrobacter sp.,并于2013年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所， 邮编100101)，保藏编号为CGMCC N0.8181。[0014]LHM7719菌株部分生理生化特性鉴定如表1所示，细胞为杆状，革兰氏染色为阳性，并做该菌株16S rDNA鉴定。16SrDNA序列在核糖体数据库中通过比对与Arthrobacter sp.TM4_3 (DQ279376)最为接近,所以确定该菌株为节杆菌属(Arthrobacter)微生物。最终判定菌株LHM7719应属于节杆菌属的一种(Arthrobacter sp.),命名为Arthrobacter sp.LHM7719。[0015]实施例1从斜面上刮取两环菌种，置于装有30ml`种子培养基的250ml三角瓶中进行种子培养。 条件为:PH 7.2，培养时间为16小时，温度为30°C，摇床转速为160转/分钟。再以2%的接种量接入装有40ml发酵培养基的250ml三角瓶中进行发酵培养。条件为:pH为7.0，发酵时间为45小时，温度为30°C，摇床转速为250转/分钟，即可得到酶活49706U /mL的发酵液。[0016]实施例2从斜面上刮取两环菌种，置于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中进行种子培养。 条件为:PH 7.2，培养时间为16小时，温度为30°C，摇床转速为160转/分钟。再以2%的接种量接入装有40ml发酵培养基的250ml三角瓶中进行发酵培养。条件为:pH为7.0，发酵时间为36小时，温度为32°C，摇床转速为250转/分钟，即可得到酶活41000U /mL的发酵液。[0017]表1菌株LHM7719部分生理生化特性
【权利要求】
1.碱性过氧化氢酶高产菌，经鉴定其属于节杆菌Arthrobactersp.,保藏编号为CGMCC N0.8181。
2.权利要求1所述的碱性过氧化氢酶高产菌生产碱性过氧化氢酶的方法，按照下述步骤进行:采用CGMCC NO:8181为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵制得碱性过氧化氢酶， 种子培养基是LB培养基:以g/L计，葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉浸膏5，氯化钠5，pH 7.2 ;培养条件:培养时间为12~16小时，温度为29~32°C，摇床转速为160转/分钟； 发酵培养基是LB培养基:以g/L计，木薯淀粉15~20，豆柏粉50~70，磷酸二氢钾0.5，初始pH为7.0 ;发酵条件:发酵时间为35~45小时，接种量为1%~8%(v/v)，装液量为40ml/250 ml,培养温度30~40°C，摇床转速为200~250转/分钟；取15ml发酵液，12000转/分钟离心20分钟，然后加入15ml磷酸缓冲液混匀后，超声波破碎取，12000转/分钟离心15分钟，取上清液得到碱性过氧 化氢酶。
【文档编号】C12R1/06GK103555620SQ201310505522
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】刘焕民, 周颖, 王建, 张峰 申请人:常州大学