一种人源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白2FliC融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白 2FliC融合蛋白，通过构建人源肠毒素大肠杆菌的鞭毛基因f liC重组质粒pRSET-B-2f liC， 表达2FliC融合蛋白，利用其制备的卵黄抗体可有效抑制大肠杆菌在体内和体外的粘附作 用。
【背景技术】
[0002] 产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起腹泻 的主要致病菌（Blackl990;Ericsson2003)。据统计每年ETEC可在5岁以下儿童中引 起2. 8-4亿次腹泻，病情轻重不等，可以仅有轻微腹泻，也可呈重症霍乱样，导致每年约 30-50万婴幼儿死亡（WH02004)。它还与诸多患儿的营养不良以及发育迟缓相关（Qadri et al2007;Petri et al2008)。ETEC腹泻在非洲、亚洲及拉丁美洲的旅行者腹泻中也占 到1/3-1/2 (WH02004)。ETEC腹泻的致病机理是通过粘附素，首先粘附到宿主的小肠粘膜 刷状缘上皮细胞的受体上，抵抗肠道蠕动及内容物的清洗，实现定殖后并释放一种或两种 肠毒素（enterotoxin)，引起细胞内水和电解质平衡失调，从而产生水样腹泻（Natro and Kaperl998;Sackl980)。粘附素和肠毒素是传统ETEC疫苗研究中不可或缺的重要抗原 (Svennerholm and Tobias2008)〇
[0003] 过去认为粘附素主要指菌毛粘附素即菌体表面菌毛抗原CFAs或CS。目前人源 ￡丁￡(：中已鉴定超过22种0?六8，常见的有0?六/1，051-〇57,0514,0517,0521(〇3(11^6七 al2005)，但异源菌毛间无交叉保护作用（Qadri et al2006)。另外研究发现粘附过程也 需要非菌毛粘附素的参与。大肠杆菌包括ETEC均会在周身或两端生出鞭毛，数量较菌毛 少，但长度是菌体的若干倍。近年来研究表明除了遍布菌体表面的菌毛外，端生的鞭毛不 仅可以作为运动器官，而且这种运动性（motility)在一些革兰氏阴性菌定植、入侵及促炎 反应等致病过程起作用，如沙门氏菌（Allen-Vercoe et all999)、鸡致病性大肠杆菌（La Ragione et al2000)〇
[0004]Roy等（2006)以转座质粒发现了 ETEC分泌的一种蛋白EtpA，是双伴侣分泌素 (TPS)的成员之一，为ETEC所特有。分布在59%的CFAI、56%的CFA II、75%的CS14或CS17 的ETEC菌株中，而这几种菌毛类型占据约60%的ETEC( Wolf 1997)。研究阐明了 EtpA在细 菌粘附中是通过在胞外与鞭毛蛋白（FliC)的保守区互作，介导鞭毛与宿主细胞的桥梁作用 发挥的（Roy et al2009a)。细胞试验通过缺失和重组证实这种互作对于ETEC的有效定植 具有关键作用，即etpA或fliC缺失菌株粘附细胞能力相比野生型大大降低，或在培养基中 添加二者的抗体也会减少粘附的细菌数，而外源添加重组蛋白或同源重组该基因可使缺失 株重新获得粘附细胞的功能（Roy et al2009a)。
[0005] 通常鞭毛蛋白的保守区隐藏于鞭毛颈部，但它可以瞬间暴露在鞭毛顶端，捕捉 EtpA分子用于识别真核细胞表面受体。鞭毛介导粘附没有血清型限制，如在flic (H11)突 变株中重组flic (H48)可以重新获得运动及粘附能力。在小鼠模型中，用rEtpA与rFliC 鼻饲免疫小鼠，获得了与体外试验相似的结果，且二者同时使用的抑粘附效果优于单独使 用（Roy et al2008,2009b)。这种新型粘附机制存在于多数ETEC中，并且其他与EtpA同源 的蛋白分子在各自的革兰氏阴性菌中也可能采用这一类似的作用方式，虽然具体的介导过 程尚不清楚，但推测两种蛋白可以作为新型广谱疫苗研制的候选抗原。
[0006] 大量的试验结果表明，通过给幼龄动物提供外源抗体(包括血液抗体和卵黄抗体） 提高其被动免疫水平，来预防和治疗细菌和病毒的感染(特别是肠道腹泻）是行之有效的途 径（Hatta et all993b;王吉力2007)。卵黄免疫球蛋白（Egg yolk immunoglobulin, IgY)成 为一种颇具潜力的抗生素替代品。美国FDA将其列入"一般公认安全物质"(Colemanl996)。 目前针对各种胃肠道疾病的IgY开发已有广泛研究。研究者以菌毛作为抗原制备IgY治疗 ETEC腹泻（Yokoyama et al 1992; Ikemori et al 1992; Marquardt et al 1999)。最早的报道 来源于口服抗菌毛卵黄抗体可防止K88、K99和987P ETEC感染（Yokoyama et all992)。仔 猪出生后4h即感染ETEC，治疗组（口服IgY)基本全部存活，且表现出剂量依赖效应，安慰剂 和对照组死亡率大于75%，在体外加入IgY也同样抑制了ETEC对猪肠细胞粘附。Marquardt 等（1999)也用提纯K88菌毛蛋白免疫蛋鸡制备卵黄抗体，对出生3日龄和21日龄断奶仔 猪进行攻毒治疗，其中3日龄组仔猪的腹泻在口服IgY24h后全被治愈，而普通IgY组的腹 泻持续且死亡率达62. 5% ;断奶仔猪在攻毒后口服IgY出现了短暂腹泻，全部存活且体重增 加，而对照组也出现严重腹泻和脱水，且感染48h后即出现死亡病例。王劼（2007)口服抗 ETEC菌毛亚单位卵黄抗体可以对仔猪提供有效的被动免疫保护，抵抗肠道病菌的感染。
[0007] 基于以上研究背景，本研究以鞭毛蛋白FliC为候选抗原，利用基因工程方法克隆 表达在细菌粘附上皮细胞过程中的关键基因fliC，获得大量目的蛋白。结合IgY技术，即通 过免疫蛋鸡来生产针对FliC抗原的特异性卵黄抗体，旨在开发出一种成本低廉的具有抗 腹泻功能的保健蛋食品。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种含有人源ETEC fliC基因的重组质粒 pRSET-B-2fliC，其序列为 SEQ ID NO. 1 所示。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供了一种含有重组质粒pRSET-B_2fliC的基因工程 菌 BL21 (DE3)/pRSET-B-2fliC。将重组质粒 pRSET-B-2fliC 转化入大肠杆菌（Escherichia coli)BL21 (DE3)，获得的基因工程菌能够表达鞭毛蛋白2FliC融合蛋白。
[0010] 本发明的还有一个目的在于提供了一种人源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白2FliC 融合蛋白，其序列为SEQ ID NO. 2所示。该蛋白免疫原性好，生产成本低，将该蛋白免疫蛋 鸡后，可获得具有抗ETEC的鸡蛋。
[0011] 本发明还有一个目的在于提供了一种人源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白2FliC融 合蛋白的复性方法，方法简单，易行，采用SKL，氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽对表达的 目的蛋白进行复性，在后期免疫过程中获得了较高效价的卵黄抗体。
[0012] 本发明还有一个目的在于提供了一种利用2FliC融合蛋白制备的卵黄抗体。该卵 黄抗体具有广谱性抑制ETEC粘附的作用。
[0013] 本发明最后一个目的在于提供了一种卵黄抗体在制备抗人源肠毒素大肠杆菌免 疫疫苗中的应用。
[0014] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
[0015] 一种含有人源ETEC flic基因的重组质粒pRSET-B-2fliC的制备方法（图1、2)，其 具体步骤如下：
[0016] 在NCBI的GenBank中查找鞭毛蛋白fliC(序列号为AY906918)全长1464,保守区 是5'端的519bp。以人源肠毒素大肠杆菌标准株H10407为试验材料，设计引物，将PCR扩 增后的目的片段连接至表达载体，成功构建了在细菌粘附上皮细胞过程中的关键基因鞭毛 基因fliC重组表达质粒，其中两个重复序列之间以杂合的酶切位点做连接。对重组质粒进 行酶切鉴定和测序，结果显示构建正确，将其命名为pRSET-B-2fliC，其序列为SEQ ID NO. 1 所示。
[0017] 一种人源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白2FliC融合蛋白，其制备步骤如下：
[0018] 将重组质粒pRSET-B-2fliC转化入大肠杆菌BL21 (DE3)，以诱导物异丙 基-0 -d_硫代半乳糖苷（Isopropyl- 0 -d-Thiogalactoside，IPTG)做诱导表达。以不同 的诱导温度和诱导剂浓度逐步优化原核表达条件，得到最佳诱导表达条件为：37°C摇床培 养至0D600达到0. 5-1. 0,加入IPTG至适宜浓度（0.1 mM)，继续培养3-4h，最终表达量均在 约50%，以包涵体的形式存在。将包涵体经压力破碎、变性和复性浓缩后得到的包涵体蛋白 2FliC融合蛋白，其序列为SEQ ID N0. 2所示，以Bradford法测定蛋白质浓度。
[0019] 一种人源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白2FliC融合蛋白的复性方法，其步骤如下：