一种包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物制剂领域，涉及包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒。
【背景技术】
[0002]细胞转染是将外源性DNA或RNA导入细胞内的一种技术。随着技术的发展，已经成为研宄和控制真核细胞基因功能的重要手段，常用于基因的功能分析，基因表达，蛋白质表达等实验中。常见的转染技术有阳离子脂质体转染，电穿孔转染，病毒感染等。现在实验室最常用的是利用阳离子脂质体转染，是通过带正电荷的脂质体与核酸的磷酸根通过静电作用结合，复合物能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过内吞进入细胞。这种方法的效率较高，但通过内吞进入细胞内的复合物有较大一部分会被溶酶体捕获降解，如果能帮助这一部分的DNA从溶酶体中逃逸出去，能大大提高转染效率。
[0003]现有的研宄发现，用一些阳离子供体对白蛋白进行修饰，带正电的白蛋白通过一定的比例与DNA混合，可以通过静电作用形成纳米粒，这种纳米粒粒径均一，而且较为稳定，能被细胞内吞进入细胞内，用于转染DNA。通过调节白蛋白和DNA比例，能使形成的纳米粒粒径不一，带电量不同，转染效率不同。通过这种方法转染质粒DNA，具有阳离子脂质体的大部分优点，降低了成本，但是没有解决同样的难题，有大量的质粒DNA被溶酶体捕获，不能进行扩增。
[0004]近期有研宄发现，通过一些方法使得光敏剂和DNA —起进入溶酶体，经过特定波长的激光照射，光敏剂能产生单线态氧，可以有效的破坏溶酶体，增强转染效率，这种现象称为PCI效应。要实现PCI效应，需要光敏剂具有高单线态氧量子产率，在较弱功率的激光照射下，产生单线态氧，破坏溶酶体而不杀死细胞。
[0005]二氢卩卜吩e6(Ce6)是一种被广泛应用的光敏剂。其分子量为596.67KD，分子式为C34H36N4O6，是叶绿素家族中的一员。Ce6是一种两亲性(水溶性和脂溶性)分子，在400nm和660nm左右都有吸收峰。660nm的激光相比光卟啉等一些传统的光敏剂，组织穿透性更强，另一方面Ce6有很高的单线态氧量子产生率，在光动力学治疗上有比较好的应用。但由于其两亲性，用常见的纳米粒制备方法很难将其包裹，制成稳定的纳米粒，比如常见的载体白蛋白，难以用常见的方法包裹Ce6。
[0006]本发明的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，一方面能和阳离子白蛋白DNA纳米粒一样，粒径均一，稳定性强，带有一定的正电，能被细胞膜吸附，并内吞进入细胞，实现转染DNA的目的。另一方面，本发明的纳米粒中包裹的Ce6，能通过PCI效应，破坏溶酶体，实现DNA的溶酶体逃逸，增强转染效率。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术的缺陷与不足，提供一种包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，能用于细胞转染技术。与现有的最好的阳离子转染技术相比，本发明中将光敏剂Ce6包裹到纳米粒中，形成的纳米粒均一稳定，通过660nm的激光照射，能将被溶酶体捕获的纳米粒释放出来，增强转染效率。
[0008]具体而言，本发明的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，其步骤如下:以EDCI作为催化剂，乙二胺作为阳离子供体与白蛋白反应，制备带正电的白蛋白；将&6溶于DMSO,正电白蛋白溶于PBS，相互混合，游祸震荡20秒制备成白蛋白Ce6混合物；用匍聚糖凝胶层析纯化白蛋白Ce6混合物；将白蛋白Ce6混合物与质粒DNA混合，漩涡震荡20秒，得到包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒。
[0009]本发明中所述的白蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白，优选是人血清白蛋白。
[0010]本发明中所述的正电白蛋白合成步骤为:将PH4.75，1.4M的乙二胺作为阳离子供体加入到10 %的白蛋白溶液中，加入100?150mg的EDCI，室温反应2小时，加入PH4.75的乙酸缓冲液终止，水中透析24小时，冷冻干燥。
[0011]本发明中，将合成好的正电白蛋白用时间飞行质谱检测分子量，比正常白蛋白多了 44个带电氨基。
[0012]本发明所述的白蛋白Ce6复合物的制备方法，特征在于将5ul的Ce6加入到ImL的白蛋白中，Ce6与白蛋白的质量比为3: 20到3: 50。
[0013]本发明中，所述的白蛋白Ce6复合物中，白蛋白浓度为白蛋白浓度为500ug/ml到1250ug/ml，DNA 浓度为 10ug/ml 到 25ug/ml，Ce6 浓度为 30ug/ml 到 75ug/ml。DMSO 含量为0.5%。利用葡糖糖凝胶层析的方法对复合物进行纯化，所用的凝胶为Sephadex G_25。对纯化后的复合物，进行蛋白浓度定量，Ce6浓度定量。
[0014]本发明中，所述的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒中所述的DNA为绿色荧光蛋白EGFP质粒。
[0015]本发明中，将纯化后白蛋白Ce6复合物与DNA进行混合时，所用的白蛋白与DNA的质量比为20: I到50: 1
[0016]本发明中，所述的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒带正电。容易被细胞摄取，可用于质粒DNA的转染。
[0017]本发明中，将制备好的裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒用于CT26细胞转染，转染效率在50%到80%。
[0018]本发明的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒具有以下显著优点:选用阳离子白蛋白作为载体，价格低廉，容易制备；解决了 Ce6由于两亲性，难以被包裹成纳米粒的问题；白蛋白与Ce6的结合，复合物与DNA的结合都是利用静电作用，操作方便简单；纳米粒中包裹着光敏剂Ce6，具有光动力学效应，可以帮助DNA从溶酶体中逃脱，增强转染效率。
【附图说明】
[0019]图1为本发明制备的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒的TEM图；
[0020]图2为本发明制备的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒的粒径分布图
[0021]图3显不了本发明制备的包裹DNA利光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒的粒径稳定性
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进一步说明。
[0023]实施例1
[0024]用去离子水稀释乙二胺至1.4M，调节PH至4.75，取40ml慢慢加入到5ml的10%人血清白蛋白溶液中。不停搅拌，加入120mg EDCI，在室温下反应2小时，加入400ul的4M，PH为4.75的乙酸缓冲液终止反应。将产物在水中透析24小时后，冷冻干燥，得到带正电的白蛋白粉末。
[0025]精密称量12.5mg阳离子白蛋白溶于1ml PBS中，15mg Ce6溶于Iml DMSO中。将5ul Ce6加入到Iml阳离子白蛋白中，漩涡震荡20秒，使分散均匀，静置10分钟，形成白蛋白Ce6复合物，检测粒径，发现没有纳米级粒子，不能形成纳米粒。用葡聚糖凝胶SephadexG-25装20cm长的柱子，将Iml的白蛋白Ce6复合物过柱子纯化，洗脱液为PBS，收集管每管Iml，收集20管，利用考马斯亮蓝测每管的蛋白浓度，发现蛋白集中在7，8，9三管中，第8管中浓度最高为400ug/ml，选用第8管继续试验，利用紫外分光光度计对第8管中的Ce6进行定量为34ug/ml。
[0026]根据定量后的蛋白浓度，按照白蛋白和DNA浓度比为50: 1，用PBS配置8ug/ml的EGFP质粒DNA溶液，取500ul纯化后的白蛋白Ce6复合物加入到500ul DNA溶液中，漩涡震荡20秒，静置10分钟，得到包裹着DNA利光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，表面电位在27mv左右。用于细胞转染，转染效率为70%左右。
[0027]如图1图2所示，本发明实施例1制备的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，粒径在160nm左右。
[0028]如图3所示，本发明实施例1制备的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒在24小时内比较稳定。
[0029]实施例2
[0030]精密称量8.75mg阳离子白蛋白溶于1ml PBS中，15mg Ce6溶于Iml DMSO中。将5ul Ce6加入到Iml阳离子白蛋白中，漩涡震荡20秒，使分散均匀，静置10分钟，形成白蛋白Ce6复合物，检测粒径，发现没有纳米级粒子，不能形成纳米粒。用葡聚糖凝胶SephadexG-25装20cm长的柱子，将Iml的白蛋白Ce6复合物过柱子纯化，洗脱液为PBS，收集管每管Iml，收集20管，利用考马斯亮蓝测每管的蛋白浓度，发现蛋白集中在7，8，9三管中，第8管中浓度最高为300ug/ml，选用第8管继续试验，利用紫外分光光度计对第8管中的Ce6进行定量为25ug/ml。
[0031]根据定量后的蛋白浓度，按照白蛋白和DNA浓度比为35: 1，用PBS配置8.6ug/ml的EGFP质粒DNA溶液，取500ul纯化后的白蛋白Ce6复合物加入到500ul DNA溶液中，漩涡震荡20秒，静置10分钟，得到包裹着DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，表面电位在23mv左右。用于细胞转染，转染效率为75%。
[0032]实施例3
[0033]精密称量5mg阳离子白蛋白溶于1ml PBS中，15mg Ce6溶于Iml DMSO中。将5ul Ce6加入到Iml阳离子白蛋白中，漩涡震荡20秒，使分散均匀，静置10分钟，形成白蛋白Ce6复合物，检测粒径，发现没有纳米级粒子，不能形成纳米粒。用葡聚糖凝胶SephadexG-25装20cm长的柱子，将Iml的白蛋白Ce6复合物过柱子纯化，洗脱液为PBS，收集管每管Iml，收集20管，利用考马斯亮蓝测每管的蛋白浓度，发现蛋白集中在7，8，9三管中，第8管中浓度最高为170ug/ml，选用第8管继续试验，利用紫外分光光度计对第8管中的Ce6进行定量为16ug/ml。
[0034]根据定量后的蛋白浓度，按照白蛋白和DNA浓度比为20: 1，用PBS配置8.5ug/ml的EGFP质粒DNA溶液，取500ul纯化后的白蛋白Ce6复合物加入到500ul DNA溶液中，漩涡震荡20秒，静置10分钟，得到包裹着DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，表面电位在18mv左右。用于细胞转染，转染效率为50%。
【主权项】
1.一种包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，其特征在于具有光动力学效应，可用于质粒DNA的细胞转染。
2.根据权利要求1所述的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的白蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白，优选是人血清白蛋白。
3.根据权利要求1所述的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的正电白蛋白额外带有44个正电氨基。
4.根据权利要求1所述的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的DNA为载有绿色荧光蛋白的质粒。
5.根据权利要求1所述的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的白蛋白浓度为 500ug/ml 到 1250ug/ml，DNA 浓度为 10ug/ml 到 25ug/ml，Ce6 浓度为 30ug/ml 到 75ug/ml0
6.根据权利要求1所述的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的Ce6: HSA: DNA 质量比为 3: 20:1 到 3: 50:1。
7.根据权利要求1-7任意一项所述的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒带正电。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒转染效率为50%到80%。
【专利摘要】本发明公开了一种包裹DNA和光敏剂Ce6的白蛋白纳米粒。这种纳米粒是在静电作用下，DNA、Ce6和带正电的白蛋白以一定比例形成纳米级的复合物。此纳米粒分散性好，稳定性强，具有光动力学效应，可用于质粒DNA的细胞转染。
【IPC分类】C12N15-63
【公开号】CN104789581
【申请号】CN201510235906
【发明人】胡一桥, 朱友伟, 王庆泽, 吴锦慧
【申请人】南京大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月7日