专利名称：光敏剂和及其生产方法
描述本发明涉及药物领域，尤其是使用生物活性化合物进行的光动力学疗法(PDT)领域。
光敏剂(PS)在PDT时用作治疗剂，在光动力学诊断(PDD)时用作荧光标记物。
单-L-天冬偶酰二氢卟酚e6四钠盐“Npe6”被认为是PS(美国专利第4,977,177号) 这个PS在PDT时是有活性的。
它的缺点是生产麻烦，太高速的肿瘤积聚和排泄动力学，它会减少对肿瘤有效暴露的时间，并且由于高度亲水性而相对的降低在恶性肿瘤形成中积聚的程度，这仅激活在PDT过程中一些可能的肿瘤破坏机制中的一个，即血管病变。
赖氨偶二氢卟酚酰p6三钠盐“LCP”被认为是PS(美国专利第5,330,741号) 这个PS在PDT时是有活性的。
它的缺点是生产麻烦和事实是它是在13位和15位上比例为10∶1的两种单酰胺的混合物，这种混合物会导致不明确的生物分布和排泄。
脱镁叶绿酸α钠盐被认为是PS(美国专利5,378,835) 这种PS能够选择性地在恶性肿瘤中积聚，并在PDT对是有活性的。
它的缺点是在作为溶液保存时易于被氧化(化学不稳定性)，作为固体保存后不能完全溶解在水中，疏水性以及结果减慢了它从机体排泄出来，导致皮肤覆盖物的光敏感性延长。
二氢卟酚e6衍化物也被认为是PS(美国专利第5,002,962号) 其中R＝疏水的烃取代基、饱和或不饱和、直链或支链的，含有4到25个碳原子。
PS，其中R是六硝基二苯胺时，是亲恶性肿瘤的，并且是PDT的有效药剂。
它的缺点是制备性生产和纯化麻烦，高度疏水以及结果减慢了在肿瘤中的积聚和降低了存储时药物水溶液的的稳定性。
已知有一个生产PS的方法，即氯的组合物作为盐和碱金属结合，用于医学实践。这个方法包括下面用2∶1至8∶1的包含6-12个碳原子的烃与包含2-10个碳原子的乙醇混合物来提取植物(花)生物量，在大气压下蒸发所得的叶绿素溶液，然后加入包含比提取乙醇碳原子少的乙醇，在大气压下从混合物中完全蒸馏出烃，在乙醇沸点温度下将乙醇碱溶液慢慢地(逐渐地)加入到酒精叶绿素溶液中，但温度低于120℃，直到pH值为11.5-11.8，冷却混合物，温育4小时，过滤，用包含6-12个碳原子的烃提取，将含有氯和镁络合物的乙醇相分离，在大气压下蒸发乙醇，在残余物中加入盐酸到pH值为3.5，将混合物温育直至氯沉淀结束并过滤，将沉淀物溶解在甲醇中，加入乙醇碱溶液直至pH值为8.5，将PS溶液过滤并在真空中蒸发(美国专利第3,102,891号)。
这个方法的缺点是在从提取物中除去溶剂时要使用高温度，使用乙醇，尤其是甲醇，会导致E环外的叶绿素酊的氧化和形成脱镁叶绿素和脱镁叶绿酸的许多不同的氧化产物(K.Hyvarinen，J.Helaja，P.Kurchen，I.Kipelainen，P.H.Hynninen.13(2)-R-叶绿素α的甲醇叶绿素酊的氧化产物的H-1和C-13核磁共振(NMR)谱<化学中的磁共振>-1996.-V.33.-N8.-p.646-656)，这导致了复杂的混合物，它的组成还没有明确并且很难复制。
已知一种生产PS的方法，即二氢卟酚e6钠盐，的方法包含如下在四氢呋喃的二氢卟酚e6三甲基乙醚溶液中加入1N NaOH溶液，将混合物在氮气下室温搅拌2天，混合物中加入水，用二氯甲烷提取有机溶剂，后者的痕量可以通过使得二氢卟酚e6盐溶液中的氮起泡而消除(美国专利第5,002,962号)。
这个方法的缺点是足够数量的起始二氢卟酚e6三甲基乙醚的利用率低，生产PS的时间长，这是由于四吡咯大环第13位的酯基不活泼所造成的，还有以水溶液的形式保存时PS药品形态的不稳定性，这是由于大环第13位的酯基不完全皂化所造成的。
已知一个生产PS的方法，即“LCP”用来进行光动力学疗法的光敏剂(赖氨偶酰-二氢卟酚p6三钠盐)，包括以下生物量用丙酮处理2-3次以提取叶绿素α，将生物量过滤或离心，蒸发提取物，用酸处理以便从叶绿素分子中除镁离子，并且水解叶绿酯基，加入甲醇用来同时酯化，用水处理反应物，用亚氯的亚甲基提取脱镁叶绿酸α衍生物，将提取物中和，用水洗，蒸发，在氧化铝上进行层析，甲基脱镁叶绿酸α从亚氯的亚甲基和甲醇的混合物中结晶出来，所得的脱镁叶绿酸α衍生物在嘧啶-乙醚-n-丙醇中的氧存在时和强无机碱反应，反应物用水处理，水相酸化至pH4，“不稳定的二氯卟酚”用亚氯的亚甲基提取，蒸发提取物，“不稳定的二氢卟酚”重新溶解在四氢呋喃中，将溶液蒸发，重复此步骤直到在700nm处吸收停止增加，所得的紫色素18溶解在四氢呋喃中，用重氮甲烷酯化，在嘧啶存在下紫色素18甲酯和赖氨酸水溶液在亚氯的亚甲基氯中混合，在室温下将混合物搅拌12小时，在高度真空中将溶剂去除，然后将所得的粗产品用反相高效液相层析(HPLC)纯化，用冻干法去除溶剂，将PS溶解在磷酸盐缓冲液中以便获得PDT的注射液，加入0.1N NaOH溶液，用0.1N盐酸将pH调节到生理值pH7.35，并通过微孔滤器过滤溶液。(美国专利第5,330,741号)。
这个方法的缺点是复制率低，费力(使用高真空、结晶、柱层析和HPLC，和赖氨酸的长时间反应)，使用高毒性和易燃试剂(重氮甲烷、嘧啶、甲醇、四氢呋喃、乙醚)。这些缺点使得此方法不适合制药工业。另外，所得的水溶性的目标产物在4℃黑暗条件下以水溶液的形式只能稳定24小时，固体形式在4℃黑暗条件只能稳定4个月，然而根据药典的要求，它的稳定不应该少于6个月(Leach M.W.，HigginsR.J.，Boggan J.E.，Lee S.-J.，Autry S.，Smith K.M.赖氨偶酰二氢卟酚p6/二氢卟酚p6混合物在光动力学治疗大鼠皮下9L胶质瘤中的效果。<肿瘤研究>1992，V.52，1235-1239)。而且，关于化学组成，这种PS代表了在第13位和第15位的单酰胺以10∶1的合适比例的混合物，这会导致其不明确的生物分布和从有机体中排泄出来。
本项发明的目的是获得PS，它其特征是容易制备性分离和纯化，平衡的疏水-亲水性，结果是有最佳的肿瘤积聚速度和从肿瘤及整个有机体中排泄出来，以及在保存时药物形式水溶液的高稳定性。
这个目的的完成是通过产生一种PS，这种PS包含碱金属盐形式的二氢卟酚，这种二氢卟酚由二氢卟酚e6(13-羧基-17-[2-羧乙基]-15-羧甲基-17，18-反-二氢-3-乙烯基-8-乙基-2，7，12，18-四甲基卟啉)组成 占80％-90％，和紫色素5(13-羧基-17-[2-羧乙基]-15-甲酰基-17，18-反-二氢-3-乙烯基-8-乙基-2，7，12，18-四甲基卟啉) 占5-20％，和紫色素18-二氢卟酚p6(13-羧基-17-[2-羧乙基]-15-羧基-17，18-反-二氢-3-乙烯基-8-乙基-2，7，12，18-四甲基卟啉) 组成剩余部分，这样提及的成分形成组合物，钠和钾可以用作碱金属。
本发明的另一目的是使得生产PS的方法达到高的复制能力，PS药物形式的化学稳定性不少于1年，同时还使得PS的物理化学和生物性质达到整体，这样就能在PDT时提供PS的效果，还避免了毒性试剂的使用。
下面是所提出的生产PS方法的实质螺旋藻属(Spirulina)生物量用丙酮处理直至叶绿素α完全提取，将生物量滤出或离心，用酸处理提取物以便去除叶绿素分子中的镁离子，中和提取物，滤出沉淀的脱镁叶绿素α，然后在盐酸-丙酮-己烷混合液中水解，6-16ml丙酮，0.6-6ml己烷和每1g粗脱镁叶绿素α使用5-10ml浓盐酸，混合物加热至40-60℃，搅拌20分钟-1小时，然后加入己烷(6-16ml)，有机相用丙酮和盐酸(2-10∶1)的混合物洗涤，用己烷洗涤水相，然后用过量的柠檬酸钠(3-，2-或单取代)水溶液中和含脱镁叶绿酸α的水相，滤出沉淀的脱镁叶绿酸α，用水洗涤，在丙酮-水混合液中重结晶，在空气中干燥直至其重量变得恒定，然后将脱镁叶绿酸α溶解在丙酮中，以浓度为0.05-1.00％的水溶液形式加入强无机碱，在30-60℃下搅拌5-30分钟，以浓度为1-50％的水溶液形式加入额外体积的强无机碱，混合物在40-60℃下加热20-90分钟，用稀释过的盐酸中和，二氢卟酚e6沉淀物通过离心分离，用蒸馏水洗涤直至酸反应消失，获得55-80％的二氢卟酚e6，然后为了分离线状的四吡咯将二氢卟酚e6从丙酮中重结晶出来，滤出二氢卟酚e6并用蒸馏水洗涤，二氢卟酚e6在40-100℃下在密封容器中加热1小时-30天，然后冷却，加入强碱溶液直至pH值为7.5-8.5，然后用供注射用的无热原水调整溶液使得光敏剂浓度为6.5-7.5％物质。
而且，在生产PS的方法中，在加入强碱直至pH值为7.5-8.5后，混合物可以通过凝胶过滤使得二氢卟酚e6的百分比达80-90％，紫色素5达5-20％和剩余的紫色素18，然后加入稀盐酸溶液直至光敏剂沉淀，用供注射用的不致热的水调整溶液使得光敏剂的浓度为6.5-7.5％物质，这样就获得了“二氢卟酚的液态提取物”。
另外，在生产PS的方法中，在凝胶过滤后，在光敏剂溶液中加入稀盐酸溶液直至光敏剂沉淀，然后过滤出沉淀物或用离心分离，加入由RF国家药典认可的添加剂直至pH值为7.5-8.5，加入用于注射的无热原水使得光敏剂浓度为0.1-1％物质，然后滤出细菌。
同样，在生产PS的方法中，在凝胶过滤后，在混合物中加入稀盐酸溶液直至光敏剂沉淀，然后过滤出沉淀物或用离心分离，用供注射用的无热原水调整溶液使得光敏剂的浓度为6.5-7.5％物质，根据以下比例在凝胶基质中分散“二氢卟酚的液态提取物”0.5-12％物质的“二氢卟酚的液态提取物”，5-20％的二甲亚砜，剩下的是水，由RF国家药典认可的添加剂以及凝胶基质。
另外，在生产PS的方法中，在凝胶过滤后，在混合物中加入稀盐酸溶液直至光敏剂沉淀，然后过滤出沉淀物或用离心分离，用供注射用的不致热的水调整溶液使得光敏剂的浓度为6.5-7.5％物质，然后所得的“二氢卟酚的液态提取物”根据以下比例溶解在二甲亚砜中0.5-12％物质的“二氢卟酚的液态提取物”，剩余部分是二甲亚砜。
使用标准的实验室化学中试设备实现了这种方法生物量在10-50L装备机械搅拌器的铝质容器中处理，生物量用油真空泵和液态氮冷阱通过5-20上下真空的过滤器进行过滤，生物量在落地式冷冻离心机中离心，这种离心机具有4×1L筒以及6000rpm的旋转速度，提取物在20L玻璃瓶中酸化，沉淀的脱镁叶绿素α用油真空泵和液态氮冷阱通过5-10上下真空过滤器进行过滤，脱镁叶绿素α在0.1-0.5L加热的三颈圆底烧瓶中水解，这种烧瓶装有搅拌器，回流冷凝器和带有塞子的流入口，在2L分离漏斗中洗涤溶液，在2-5L化学烧杯中中和，脱镁叶绿酸α用油真空泵和液态氮冷阱通过2-5L上下真空过滤器进行过滤，在0.25-1L化学平底烧瓶中重结晶，将脱镁叶绿酸α溶解在丙酮中，并在0.5-2L加热的三颈圆底的烧瓶中与强无机碱反应，这种烧瓶装有搅拌器、回流冷凝器和带有塞子的流入口，二氯卟酚e6沉淀物在落地式冷冻离心机中分离，这种离心机具有4×0.5L筒以及6000rpm的旋转速度，二氢卟酚e6在0.25-0.5L，2-5L化学平底烧瓶中重结晶，然后用油真空泵和液态氮冷阱通过1-2L上下真空过滤器进行过滤，并在0.05-0.1L耐热玻璃圆底化学烧瓶中加热，它和强碱溶液反应，使用标准的pH计和分光光度计在0.1-1L化学烧杯中校准，混合物在直径为5-10mm，高为100-150mm的柱上进行凝胶过滤，通过标准的0.22μm Millipore型微孔过滤器将细菌滤出，使用切割器或珠均浆器将“二氢卟酚的液态提取物”分散在凝胶基质中，并且用0.01-10L带塞子的锥形瓶、0.005-2L量筒、0.05-2L烧杯、20L瓶子，1-1000g范围的称重计和磁性搅拌器来配制样品和溶液；用带有温度计和直流水冷凝器的5L圆底烧瓶来再生丙酮和己烷；在低温时用旋转式真空蒸发器来快速去除溶剂。
根据生产PS的方法，浓盐酸溶液被认为是在20℃时的饱和的氯化氢水溶液，它通常含有36-37％物质的氯化氢。
在脱镁叶绿素α转化为脱镁叶绿酸α的阶段，丙酮和己烷的体积范围(6-16ml的丙酮及0.6-6ml的己烷)通过事实来解释，就是如果使用较少体积的溶剂，那么脱镁叶绿素α的溶解就不完全，如果体积较大，溶液将不足够浓缩用于快速水解。盐酸的体积范围(5-10ml)通过事实来解释，那就是如果体积较小，脱镁叶绿酸α产量降低，如果体积较大，反应选择性就降低，这是由于形成了副产品焦脱镁叶绿酸α。温度的范围是40-60℃通过事实来解释，就是如果温度较低，脱镁叶绿酸α的产量就降低，如果温度较高，反应选择性由于形成了副产品焦脱镁叶绿酸α而降低。时间的范围是20分钟-1小时通过事实来解释，就是如果时间较短，脱镁叶绿酸α的产量就降低，如果时间较长、反应选择性由于形成了副产品焦脱镁叶绿酸α而降低。加入的己烷体积(6-16ml)，通过事实来解释，就是如果此体积较小，反应产物之一叶绿醇从反应混合物中分离是无效的，使用较大体积的己烷是不合理。
在脱镁叶绿酸α纯化阶段，用比例为2∶1至10∶1的丙酮和浓盐酸的混合物洗涤有机相。如果比例低于2∶1，形成片状的混合沉淀物，它不易从含目标脱镁叶绿酸α的水相中分离。如果比例大于10∶1，水相随丙酮变得过饱和，混合物从己烷相进入其中污染了目标脱镁叶绿酸α。
在脱镁叶绿素α转化为二氢卟酚e6的阶段，强碱性的浓度范围是0.05-1.00％，它较低的界限最小值对于脱镁叶绿酸α环戊酮环(E环)的打开反应是必需的，如果它的碱性浓度大于1％，E环叶绿素酊的氧化反应就会发生而导致“不稳定的二氢卟酚”代替目标二氢卟酚e6，然后产生紫色素18，进一步产生二氢卟酚p6。
然后，根据本方法，加入额外体积的浓度为1-50％的无机强碱水溶液。如果此浓度低于1％，第13位或第15位上的酯基就发生不完全皂化。如果碱浓度大于50％，在一些情况下PS的四吡咯大环就打开了。
然后，在30-60℃下将反应物搅拌5-30分钟，较低温度有利于E环叶绿素酊的氧化过程，较高温度有利于二氢卟酚e6分解成二氢卟酚e4。当加入额外量的无机强碱时，温度范围是40-60℃时间范围是20-90分钟。如果时间和温度低于规定的，在第152位的甲基酯就没有时间水解，如果时间和温度大于规定的，副产物基e4的产量就降低。
当基e6转化为“基的液态提取物”时，就发生了氧化过程以及接下来的PS脱水和脱羧的热分解过程，将151位上的亚甲基氧化成紫色素5 当二氢卟酚e6转化为“氯的液态提取物”时，使用低于40℃的温度就需要长的反应时间，这在技术上是不合理的。使用高于100℃的温度就导致物质分解的加速。
过程的持续时间少于1小时就需要使用高于100℃的温度，或导致物质的生物活性低。
过程的持续时间大于30天时就会伴随物质的不可逆的变化(分解)。
最佳的过程温度是45-70℃(
图1)。
最佳的过程持续时间是在70℃下2-9天(图2)或在100℃下1-48小时(图3)，导致混合物中有5-20％的紫色素5。
在活性剂(PS)的组合物中含5-20％的紫色素5和80-95％的二氯卟酚e6的物质适合生产水溶性的注射药物。如果些物质所含的紫色素5少于5％，它的生物活性就低。如果此物质所含的紫色素5大于20％，它的水溶性就变坏了，这就不利地影响了药物在保存时的稳定性，并损坏了它通过微孔过滤器的过滤能力。最后一个特性对于药物杀菌是必需的，因为四吡咯药物不能通过加热或UV照射来杀菌，因为不理想的化学变化的机率高。
这种物质中含有80-95％二氯卟酚e6对于保持紫色素5的水溶性状态是必需的。
pH值的范围基于的事实是，它的下限-pH7.5-是氯在水溶液中溶解性的下限，使得浓缩液适合药物使用。上限-pH8.5-是氢氧化物离子[OH-]的生物耐受性的限制。
二氯卟酚e6浓度在6.5-7.5％范围是基于在分离二氢卟酚e6沉淀物时使用离心或过滤的技术方法，这些方法在此浓度范围内给出产物。
本发明通过图来阐明，图1涉及方法，并显示了紫色素5的形成依赖于温育30天的温度；图2显示了紫色素5内含物在70℃时所要依靠的温育时间；图3显示了紫色素5内含物在100℃时所要依靠的温育时间；图4阐明了“二氢卟酚的液态提取物”的药物动力学，用作药物以20mg/kg的剂量对长肿瘤的小鼠静脉内给药“Radachlorin，注射用0.5％溶液”(“Photochlorin”)；图5a显示了血液中二氢卟酚e6代谢物的存在(式I)即紫色素5(式II)，标记为“1”的曲线表示PS的pH9.18的0.01M硼酸盐缓冲液，标记为“2”的曲线表示血液中的PS；图5b证明了二氢卟酚e6(式I)在肝脏中代谢为紫色素5(式II)；图6显示了实施例2中所获得的“二氢卟酚的液态提取物”的PMR谱；图7显示实施例2中所获得的“二氢卟酚的液态提取物”的质谱图；图8显示了实施例2中所获得的“二氢卟酚的液态提取物”的吸收可见光谱，光谱是在乙醇中取得的，物质浓度是5mkg/ml；图9显示了二氢卟酚e6的PMR谱；图10表明了二氢卟酚e6的质谱图；图11表明了二氢卟酚e6的吸收可见光谱，光谱是在乙醇中取得的，二氢卟酚e6浓度是15mkg/ml(Sore带-5mkg/ml)；图12显示了紫色素5的PMR谱；图13显示了紫色素5的质谱图；图14显示了紫色素5的吸收可见光谱，光谱是在乙醇中取得的，紫色素5浓度是15mkg/ml(Sore带-5mkg/ml)；图15显示了紫色素5二甲基酯的PMR谱；图16显示了紫色素5二甲基酯的质谱图；图17显示了紫色素5二甲基酯的吸收可见光谱，光谱是在乙醇中取得的，紫色素5DME是15mkg/ml(Sore带-5mkg/ml)。
实施例1阐明了PS，实施例2，3中给出了实现方法的例子，实施例4-9阐明了实现方法的特例。
就化学而论，PS包含三个具有氯性质的环状四吡咯(具有氢化的D环)-二氢卟酚e6(式I)，紫色素5(式II，实施例10)和紫色素18，它在碱性介质中逐渐转变为二氢卟酚p6(存储时)(式III)。
就物理而论，PS具有吸收可见光谱的能力，结果使得PS光敏化以及接着发生的兴奋状态的松弛，随着能量转移给氧分子和有机底物溶解在组织中。这个转移导致生物组织中的氧化和自由基作用，它们的破坏以及接着发生的毁灭(坏死)。对于PDT来说，最可能的兴奋带是长波长带(表1)因为生物组织中的光穿透能力随着波长的增加而提高。这样，PS在被波长为654-670mm的光兴奋后，能够破坏生物物质的深度达到10mm。
就制药学而论，PS是“二氢卟酚的液态提取物”(如果有效剂浓度小于20％，提取物被认为是液体的)。给出的物质被认为是提取物，因为必须用有机溶剂将它从生物量中提取出来。
表1在不同介质中长波带的“二氢卟酚的液态提取物”的最大吸收值位置和吸收值的分子消光。
式II的化合物具有选择性地聚集在恶性肿瘤和感染病灶中的能力，但它的水溶性弱，式I的化合物除了表达光动力学活性外，对于式II的化合物来说是一种增溶剂。
就药理学而论(图4，实施例11)，药物动力学参数的独特性通过事实来获得，那就是在有机体中式(I)的PS慢慢转变为式(II)的PS，这一过程使得后者的浓度保持在恒定水平从给药入有机体的时刻直到从肿瘤中排泄出来的时刻，这一段时间对于实现有效的PDT来说是足够的。在所建议的PS组合物给予肿瘤小鼠的机体后，它就进入血流，由于主要是式I化合物的血液循环，在肿瘤部位给药后的开始3个小时中得到了高和稳定的PS浓度0.27-0.32μM，对于0.5-4小时中有效的PDT来说是足够的。在此期间内由于在组合物中存在5-20％的式I化合物而获得了高对比度，此化合物具有在肿瘤中高对比度积聚的能力，积聚的最大值在动物机体给予PS的3小时后下降(皮肤的对比度指数是14.5，肌肉是2.9)。在注射3-5小时时间段内肿瘤部位中出现高而稳定的PS浓度，在这一时间内式(I)的化合物在有机体中就转化为式(II)的化合物，此浓度逐渐降低，足够使治疗保持在注射后18小时。然后，式II的化合物就在有机体中分解为无毒产物，它通过肝脏排泄出来。
通过实验动物器官和组织标本的荧光光谱证实了式(I)的二氢卟酚e6转化为式(II)的紫色素5(图5)。当将药物“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)以10μM的浓度加入到血匀浆中，接下来进行分光光度分析，观察到荧光光谱宽了1.2倍以及荧光密度最大值移动8nm到长波长光谱区域。当加入较小浓度(C＝1μM)的“Photochlorin”时，只能观察到光谱的移位而没有变宽，表明了代谢物形成中的剂量效应。[图5a，(2)]。
图5a，(3)显示了血匀浆分析的结果，在给予小鼠“Photochlorin”3小时后得到此结果。这里最明确的参数是在最大值移到长波长光谱区域4nm处1.5倍的光谱宽，这表明在接受分析的血样中存在“Photochlorin”和代谢物的混合物。
当将浓度为10μM的“Photochlorin”加入到有肝匀浆的试管中[图5b，(1)]光谱特征的变化首先表现在荧光密度最大值移动9nm到长波长光谱区域。未观察到光谱变宽。
当以较小浓度C＝1μM加入“Photochlorin”时，观察到了相似的图[图5b，(2)]。当分析给于动物的制剂后3小时获得的肝组织匀浆时，样品的分光光度图和前两个是相似的[图5b，(3)]。
因此得到的数据显示了肝匀浆中存在“Photochlorin”代谢物。
在静脉内给药或腹膜内给药后3-18小时这段时间内，观察到紫色素5在实验动物肿瘤中积聚，根据选择性这对于光动力学效应是最佳的。例如还需要使二氢卟酚物质能够在血流中循环，照射的最佳时间是在静脉内给药后0.5-4个小时。通常为了用“二氢卟酚的液态提取物”实现PDT，给予制剂和照射的之间的间隔是0,5-18小时。
药物“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)的生物活性是在体内和体外估计的，这种药物包含0.5％的无水“二氢卟酚的液态提取物”。
根据两亲性通过体外标准实验来证明PS平衡(Kessel D.Biochemistry.1997.V.16.p.3443-3449)(表2，实施例12)。PS在1-辛醇/磷酸盐缓冲液pH7.(Cd)4中的分布系数是1.40。意味着权利要求提出的PS在水中和在脂质相中的溶解性同样好，并且证明了PS的亲脂性，这就使得此化合物通过转运蛋白和脂蛋白从水重新分布到复合物中。快速渗透入细胞并在细胞质内膜和微粒体中积聚，或通过这些细胞的原生质膜的扩散渗透入细胞。在激光照射后以这样方式沉淀的化合物在细胞内部放出单氧，且杀死细胞。
在体外实验中得到的结果证明了PS对于不同类型的癌细胞的抗肿瘤活性，实验中使用了3系的培养肿瘤细胞鼠嗜铬细胞瘤PC12，鼠加塞氏神经节神经鞘瘤RGGN1和鼠肝瘤27(Hep27)(表2，例13)下面的方法用来研究PS剂量依赖的细胞光毒性(激光照射后)和生物“黑色”活性1.MTT试验能够精确定细胞在经过PS处理和激光照射后的存活数量，以便计算出PS细胞毒性和细胞光毒性的指数。同样的试验能够估计PS剂量依赖的细胞毒性和生物“黑色”活性(Andrei V.Reshetnickov，Gelii V.Ponomarev，AndreiV.Ivanov，Olga Yu.Abakumova，Tatyana A.Tsvetkova，Artashes V.Karmenyan，Aleksei G.Rebeko，Rudolf Ph.Baum.二氢卟酚e6的新型药物肿瘤治疗和检测的光学方法光动力学疗法的机制和技术)IX.-T.J.Dougherty，编.，Vol.3909，124-129(2000))。
在实验结束时细胞单层染用结晶紫染色后，测定细胞的数量。此方法不太费力但比MTT试验贵，还能够计算出PS的细胞毒性和细胞光毒性的指数(A.E.Medvedev等.，Biomed.Science，1990，v.l，p.261)，但是它不大精确因为结晶紫也染死细胞。
PS比较的基因毒性和基因光毒性作用可以通过细胞中DNA合成的抑制程度来估计。DNA合成是通过DNA中掺入14C胸苷的水平来估计的，使用标准的放射分析方法(O.Yu.Abakumova，等.，J.Neural.Transm.Suppl.3，1998，V.52，p.87)。
所有这三组研究的细胞系在PS处理过后对于激光照射是高度敏感的(MTT试验的数据)。根据对于激光照射的敏感性，以下列出了细胞系的次序RGGN1＞PC12＞Hep27。
5μM浓度的PS对于黑暗中的细胞有延长效应，存活率PC12是96.5-86.2％，RGGN1是103.7-93.0％，Hep27是109.7-87.9％(对应于MTT-试验-结晶紫)。在相同的条件下，PC12细胞中的DNA合成实际上不受影响，而Hep27和RGGN1细胞中相应的分别降低了21.2％和22.2％。在5μMPS对于黑暗中的细胞的作用下可以观察到RGGN1和Hep27细胞的数量上升，这很可能与PS诱导细胞增殖活性有关。通常，PS的细胞毒活性在缺少照射时比诱导增殖活性时更典型。
在激光照射用PS处理的细胞后，观察到细胞的死亡。检测到制剂的剂量依赖的细胞光毒性，它使得能够计算EC50，即测定在50％细胞死亡时的PS浓度。表2给出了这些数据。应该注意的是EC50小于20μM的PS被认为有效抑制肿瘤生长。
在基因光毒性测定时，在用5μMPS和激光照射处理细胞过后PC12细胞中的DNA合成大大下降了(与照射对照比较下降96.5％)。在低PS浓度的激光照射后观察到在Hep27和RGGN1细胞中DNA合成的刺激。这种合成在5μMRC存在时显著地减少了。可观察到的DNA合成的刺激可以用事实来解释，就是在低PS浓度存活的转化的肝和神经胶质细胞具有很高的合成DNA和再生群体的能力。
因此，PS是对于不同类型的肿瘤细胞有高度细胞光毒性的制剂。在高浓度(＞5μM)时甚至不需要照射，它是肿瘤生长的中等抑制剂。由于高的基因光毒性PS在照射时被认为是强的肿瘤生长抑制剂。
在体外实验中研究了PS的毒性性质(实施例14)。考虑到平均的LD50是210.53±22.2mg/kg称量系数，导致10％的实验动物的死亡剂量(LD10)是169.87mg/kg。这些实验使得PS是“低毒性的物质”。
在体内实验中研究了PS的生物分布(实施例11)。当PS腹膜内给予后腿肌肉中接种了T36胚胎癌的小鼠时，观察到化合物分布的以下机制。当PS注入血液后，然后它重新分配入动物的器官和组织(表3)。
从表3中可以看到，以40mg/kg的剂量腹膜内注射后5小时内肿瘤积聚达到最大值(0.70μM)，它会持续长时间(18-24小时)。在注射18小时后肿瘤的浓度是0.48M，少于在高选择性积聚时的积聚绝对最大值的1.5倍。肿瘤/肌肉的比是32，肿瘤/皮肤的比是44。
以20mg/kg的剂量静脉内注射后0.5小时内肿瘤积聚达到最大值(0.32μM)，它也会持续长时间(达到5小时)。在3小时内获得了静脉注射的积聚的最大比值，肿瘤/肌肉组织是3，肿瘤/皮肤是4。一天98％的PS排泄出和体外。
表2亲酯系数和“Radachlorin，0.5％注射溶液”(“Photochlorin”)的体外活性。
除了基因光毒性在PDT治疗体内实验小鼠癌症时，制剂效率估计的结果(实施例15)能说明“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)和“Radachlorin，0.05％凝胶”具有所表述的光动力学活性。
“二氢卟酚的液态提取物”药物物质包括二氢卟酚的钠盐(或二氢卟酚的盐和其他的强无机碱)用来通过补充RF国家药典所批准的不同的添加剂生产药物碳酸钙，蔗糖，葡萄糖，淀粉，硬脂酸镁，聚乙烯吡咯酮，多葡聚糖，甲基葡糖胺，等渗溶液，二甲亚砜，凝胶和水乳胶基质等(实施例4-9)。
软膏剂、搽剂、凝胶、油基础的制剂作为外用，这些剂型包含了RF国家药典所批准的基质，5-20％的二甲亚砜和0.5-12％的“二氢卟酚的液态提取物”物质或0.8-14％的“二氢卟酚的液态提取物”物质和86-99.2％的二甲亚砜(实施例8，9)。
和基质结合的二甲亚砜的浓度范围可以通过事实来解释，就是在浓度小于5％时物质的组织渗透性低，减少了PDT的效率。如果二甲亚砜的浓度高于20％，其他基础上的药物剂型存储时就失去了稳定性。物质的浓度范围用事实来解释，就是如果浓度低于0.5％，组织中的物质浓度对于有效的PDT是不足的。如果物质浓度高于12％，组织就失去了光照的透明度，所有的光都被组织的上层所吸收导致在PDT步骤的较低效率时发生灼伤。
表3主要的药物代谢动力学参数
在照射之前皮肤上的物质暴露是0.5-24小时(外用)。时间少于0.5小时的话，这种物质就没有时间渗透入组织达到必需的深度。如果时间间隔大于24小时观察到制剂绝对积聚值的下降，这是由于它的重分布和排泄造成的。另外，在皮肤上长时间暴露外用药物从临床的观点来讲是不方便的。
这种制剂以0.1-1％溶液的形式静脉内逐滴或流注给药，使用RF国家药典批准的任何介质(用于注射的无热原的水、二甲亚砜、盐溶液等)。考虑到导入有机体的液体体积，使用的此物质的溶液浓度小于0.1％是不合理的。使用溶液的浓度高于1％是不可能的，因为这样的溶液在杀菌阶段穿过抗菌过滤器的过滤性低。由ZAO“MYLON”(Saint Peterburg)和OOO“SIGM PLUS”(Moscow)设计的用于光动力学治疗的半导体激光二极管组件用来激活PS“二氢卟酚的液态提取物”物质。此组件有以下输出数据(俄罗斯卫生部的证书，Reg.No.29/10-679-96)--200微米孔径为0.22的纤维功率为2.5-3W--“Polaroid”公司(美国)和OOO“SIGM PLUS”的合作产品，高强度的激光二极管，最大照射波长为662±3nm。
功率较低的组件(具有较少量的二极管)，最大照射波长为662±3nm，可以用来激活PS物质，固态激光抽吸钇-铝石榴石的第二谐波YAG:Nd3+，也可使用最大照射波长670nm。
给予能量的等级可以从30至3000J不等。在光剂量少于30J时，PDT程序就变的过长，因为应在极小的范围中实现扫描以便达到最佳效果。在光剂量大于3000J时，在临床实践中经常发生肿瘤大小的变化，能观察到健康组织的明显破坏，导致再生时间的延长。
给予能量的表面密度可以从50变化至2500J/cm2不等。在表面光剂量小于50J/cm2时，观察不到效果。在表面光剂量大于2500J/cm2时，能观察到健康组织的明显破坏，导致再生时间的延长。
激励照射的波长范围与使用的激光(662±3nm)的技术特征有关，制剂吸收最大值的变化依赖于介质的极性(654-662nm)以及物质中的紫色素5内含物(5-20％，在663-670nm处的长波吸收带的一半宽度)(表1)。
实施例1PS的物理化学性质的描述PS代表稠密的黑色物质，在薄层中有绿色的阴影，带有海藻的气味。
为了证明PS性质的真实性，7.5％的“二氢卟酚的液态提取物”被充分搅拌，提取物的一部分(1mg)溶解在10ml的药物或95％的最纯化精制的乙醇中，在662nm(D)处测定光密度。值是0.23。根据公式ε＝D*597/(0.004)来计算分子消光值ε(M-1cm-1)。所得的结果应该在33300-35100的范围内。代入后，ε＝0.23*597/(0.004)＝34328。这样，“二氢卟酚的液态提取物”含有7.5％PS。
乙醇中的PS溶液有黄绿色。如果从医用蓝灯MDS 220-75(技术规格16.535.376-79)射出的光线要在光防护的地方通过溶液层，那么溶液就需要宝石红着色。
为了进行定量测定，“二氢卟酚的液态提取物”被充分搅拌，提取物的一部分(5mg)溶解在10ml的药物或95％的最纯化精制的乙醇中，在662nm(D)处测定光密度。值是2.15。根据公式c，％＝(D*597*10*100)/(34230*5)来计算PS内含物。所得的值应和规定的相一致。代入后，c％＝(2.15*597*10*100)/(34230*5)＝7.5％(和规定的相一致)。
为了进一步分析，在100mg的“二氢卟酚的液态提取物”中加入的盐酸溶液直至PS沉淀，滤出沉淀物，在真空中用五氧化磷干燥12小时，在360-720nm的波长范围中取得PMR-，质谱和吸收光谱。
PS PMR光谱(图6)(在DMSO-D6，浓.溶液中)9.64，9.55，9.52，9.39，8.90，8.79(s，二氢卟酚e6和紫色素5的内消旋-H)，8.09，8.04，7.97，7.92(2d，二氢卟酚e6和紫色素5的CH＝CH2)，6.84(s，紫色素5的γ-内消旋-CHO)，6.37，6.32，6.13，6.10(2d，CH＝CH2)，5.43(2s，γ-内消旋-CH2COOH)，4.60(m，7-H)，4.45(m，8-H)，3.80，3.56(qx2，4-CH2CH3)3.75，3.64，3.51，3.46，3.29，3.23，(c，二氢卟酚e6和紫色素5的核CH3)2.38，2.32(2m，7-CH2CH2COOH)，2.71，2.20(2m，7-CH2CH2COOH)，1.76(d，8-CH3)，1.72(t，4-CH2CH3)，-1.63，-1.91(2s，2NH)ppm.PS质谱(图7)e.i.，M+(％)，596(16.0)，566(9.4)，508(100.0)，494(7.3)，447(9.4)，435(50.6)，42/(12.8)，405(6.9)，254(7.4)。
PS可见的吸收光谱λ(ε)(乙醇)，386(22310)，406(113040)，506(14870)，536(8925)，608(7437)，662(34220)。
根据PMR的光谱，这种物质含80％的二氢卟酚e6，15％的紫色素5和5％的紫色素18(在9.25，9.10，8.71，7.84，3.55，3.32，3.04ppm处有较小的信号)，与获专利的组合物一致。根据质谱图，有二氢卟酚e6596和紫色素5的566分子离子的峰。在吸收光谱中在662nm处有一条带，它的吸收值与PS波前测定仪(34230)的分子消光值很好匹配。
因此，所研究的样品是7.5％的“二氢卟酚的液态提取物”。
实施例2生产PS作为6.5％的“二氢卟酚的液态提取物”。
螺旋藻生物质(2kg)用丙酮(3×2L)处理直至叶绿素α被完全提取，滤出生物量，将提取物用盐酸(30m1)处理这样以便将镁离子从叶绿素分子中去除，中和提取物并滤出沉淀的脱镁叶绿素α(8g)，然后脱镁叶绿素α在盐酸-丙酮-己烷的混合液中水解，为了这个目的，将脱镁叶绿素α溶解在50ml丙酮，5ml己烷，40ml 37％的盐酸混合液中，将混合液加热至40C并搅拌1小时，然后加入己烷(50ml)，有机相用丙酮和盐酸的混合液(2∶1，3×50ml)洗涤，水相用己烷(5×40ml)洗涤，然后含脱镁叶绿酸α的水相用过量的柠檬酸钠(三-，二-或单-取代)水溶液中和，过滤出沉淀的脱镁叶绿酸α，用水洗涤(3×50ml)，从丙酮-水混合液中重结晶出来，空气干燥直至它的质量变得恒定(脱镁叶绿酸α的产量是4.2g，7.1mM，77％)，然后脱镁叶绿酸α(2.7g，4.56mM)溶解在丙酮(100ml)中，在水溶液(0.05％，25ml)中加入无机强碱，在60℃搅拌5分钟，在水溶液中加入额外体积的无机碱(20％，25ml)，混合液在40℃加热90分钟，用稀盐酸(2％，约250ml)中和，通过离心分离出二氢卟酚e6沉淀，用蒸馏水(5×10ml)洗涤直到酸反应消失，得到1.85g(2.96mM，65％)二氢卟酚e6，然后为了分离线状的四吡咯，从丙酮中重结晶出二氢卟酚e6，滤出，并用蒸馏水洗涤3次，二氢卟酚e6在密封的容器中40℃下加热30天，然后冷却，加入1％氢氧化钠溶液直至pH值为7.5，所得的PS含15％的紫色素5，80％的二氢卟酚e6和5％的紫色素18(二氢卟酚p6)，然后PS溶液用蒸馏水调整使得光敏剂的浓度为6.5％，给出14.2g(50％)的PS以6.5％的“二氢卟酚的液态提取物”形式存在。
所得的“二氢卟酚的液态提取物”的PMR质谱图(图6)(在DMSO-D6，浓溶液中)9.64，9.55，9.52，9.39，8.90，8.79，(s，二氢卟酚e6和紫色素5的内消旋-H)，8.09，8.04，7.97，7.92(2d，二氢卟酚e6和紫色素5的CH＝CH2)，6.84(s，紫色素5的γ-内消旋-CHO)，6.37，6.32，6.13，6.10(2d，CH＝CH2)，5.43(2s，γ-内消旋-CH2COOH)，4.60(m，7-H)，4.45(m，8-H)，3.80，3.56(qx2，4-CH2CH3)，3.75，3.64，3.51，3.46，3.29，3.23，(s，氯e6和紫色素5的核CH3)2.38，2.32(2m，7-CH2CH2COOH)，2.71，2.20(2m，7-CH2CH2COOH)，1.76(d，8-CH3)，1.72(t，4-CH2CH3)，-1.63，-1.91(2s，2NH)ppm。
此物质含80％的二氢卟酚e6，15％的紫色素5和5％的紫色素18(二氢卟酚p6)(在9.25，9.10，8.71，7.84，3.55，3.32，3.04ppm处有信号)。
所得物质的质谱图(图7)e.i.，M+(％)，596(16.0)，566(9.4)，508(100.0)，494(7.3)，447(9.4)，435(50.6)，421(12.8)，405(6.9)，254(7.4)。
可见的吸收光谱(图8)λ(ε)(乙醇)，386(22320)，406(113110)，506(14880)，536(8930)，608(7440)，662(34230)。
实施例3生产PS作为7.5％的“二氢卟酚的液态提取物”。
螺旋藻生物质(2kg)用丙酮(3×2L)处理直至叶绿素α被完全提取，生物量被离心出，用盐酸(30ml)处理提取物以便将镁离子从叶绿素分子中去除，中和提取物并滤出沉淀的脱镁叶绿素α(8g)，然后脱镁叶绿素α在盐酸-丙酮-己烷的混合液中水解，为了这个目的，将脱镁叶绿素α溶解在100ml丙酮，50ml己烷和80ml 37％的盐酸混合液中，将混合物加热至60℃并搅拌20分钟，然后加入己烷(100ml)，有机相用丙酮和盐酸的混合液(5∶1，3×50ml)洗涤，水相用己烷(5×40ml)洗涤，然后含脱镁叶绿酸α的水相用过量的柠檬酸钠(三-，二-或单-取代)水溶液中和，滤出沉淀的脱镁叶绿酸α，用水洗涤(3×50ml)，从丙酮-水混合液中重结晶出来，空气干燥直至它的质量变得恒定(产量是3.8g，6.4mM，67％)，然后脱镁叶绿酸α(2.7g，4.56mM)溶解在丙酮(100ml)中，在水溶液(1％，25ml)中加入无机强碱，在30℃搅拌30分钟，在水溶液中加入额外体积的无机碱(20％，25ml)，混合液在60℃加热20分钟，用稀盐酸(2％，约250ml)中和，通过离心分离出二氢卟酚e6沉淀，用蒸馏水(5×10ml)洗涤直到酸反应消失，得到1.67g(2.67mM，55％)二氢卟酚e6，然后为了分离线状的四吡咯，从丙酮中重结晶出二氢卟酚e6，滤出二氢卟酚e6，并用蒸馏水洗涤3次，二氢卟酚e6在密封的容器中100℃加热1小时，然后冷却，加入1％氢氧化钾溶液直至pH值为8.5，所得的PS含2％的紫色素5，82％的二氢卟酚e6和16％的紫色素18(二氢卟酚p6)，然后PS溶液用蒸馏水调整使得光敏剂的浓度为7.5％，给出11.1g(50％)的PS以7.5％的糊剂形式存在。
所得物质的光谱和实施例2中所给出的相似，代表了二氢卟酚e6(图9-11)和紫色素5(图12-14)的光谱的重叠。
实施例4一种生产PS特殊情况—生产7.5％“二氢卟酚的液态提取物”。
含2％的紫色素5，82％的氯e6和16％的紫色素18(氯p6)的PS，以7.5％的糊剂形式，如前面实施例所描述的，是凝胶过滤所得的，使用SephadexG10柱，50mm直径，100mm高度，使用1％氢氧化钾溶液作为洗脱剂，直至二氢卟酚e6的内含物变为90％，紫色素5-为5％，紫色素18-为5％。加入稀盐酸溶液直至PS沉淀，然后用供注射使用的无热原的水调整PS使得光敏剂浓度为7.5％物质，给出6.8g75％“二氢卟酚的液态提取物”。产物的电子光谱见图8。
实施例5一种生产PS的特殊情况生产“Radachlorin，0.1％注射液”的药物形式在凝胶过滤后，在实施例4中所描述的PS溶液中加入稀盐酸溶液直至PS沉淀，将沉淀滤出，加入用于注射的无热原的水配制的浓氢氧化钠溶液直至pH到7.5，加入注射用无热原的水使得PS浓度为0.1％，然后通过孔径为0.22μm的抗菌“Millipore”微孔过滤器来除去溶液中的细菌。产量为500ml溶液。产物的电子光谱见图8。
实施例6一种生产PS的特殊情况—生产“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)的药物形式在凝胶过滤后，在实施例4中所描述的PS溶液中加入稀盐酸溶液直至PS沉淀，将沉淀滤出，加入浓氢氧化钾溶液直至pH为7，然后溶液在pH计的控制下，用N-甲基-D-葡糖胺将溶液的pH值调节至8.5，加入注射用的无热原的水使得光敏剂浓度为0.5％物质，然后通过孔径为0.22μm的抗菌“Millipore”微孔过滤器来除去溶液中的细菌。产量为100ml溶液。产物的电子光谱见图8。
实施例7一种生产PS的特殊情况—生产“Radachlorin，1％注射液”的药物形式在凝胶过滤后，在实施例4中所描述的PS溶液中加入稀盐酸溶液直至PS沉淀，将沉淀滤出，加入浓氢氧化钠溶液直至pH为8.5，加入注射用的无热原的水使得光敏剂浓度为1％物质，然后通过孔径为0.22μm的抗菌“Millipore”微孔过滤器来除去溶液中的细菌。产量为50ml溶液。产物的电子光谱见图8。
实施例8一种生产PS的特殊情况—生产“Radachlorin，凝胶”的药物形式。
在凝胶过滤后，在实施例4中所描述的PS溶液中加入稀盐酸溶液直至PS沉淀，将沉淀滤出，加入注射用的无热原的水调整使得光敏剂浓度为6.5％物质，然后获得了下面的变异体
变异体(a)在室温下将0.3g的Pemulen TR1或Carbopol 2020(BF Goodrich，UK)加入到75ml水和5g二甲亚砜中，并搅拌1/4-8小时。加入碱性水溶液直至pH为5。重置悬浮补充有6.5％的“二氢卟酚的液态提取物”和水的凝胶使得在所得凝胶中有0.05％浓度的二氢卟酚e6，以10-50mmHg将凝胶抽真空5分钟。产量为100g的凝胶。
变异体(b)在70ml的水中加入5g二甲亚砜和6.5％的“二氢卟酚的液态提取物”使得所得凝胶中有0.05％浓度的二氢卟酚e6，然后加入15g的Aculyn 33A(ISPUSA)。将该物质搅拌到均匀加入碱溶液直至pH为5。以10-50mmHg将凝胶抽真空持5分钟。产量为100g的凝胶。
在凝胶过滤后，在实施例4中所描述的PS溶液中加入稀盐酸溶液直至PS沉淀，将沉淀滤出，用注射用的无热原的水调整使得光敏剂浓度为7.5％物质，然后获得了下面的变异体就变异体(c)在室温下将0.7g的Pemulen TR1或Carbopol 2020(BF Goodrich，UK)加入到60ml水和20g二甲亚砜中，并搅拌1/4-8小时。加入三乙醇胺水溶液直至pH为8.5。重悬浮补充有7.5％的“二氢卟酚的液态提取物”和水的凝胶，使得在所得凝胶中有1％浓度的二氢卟酚e6，以10-50mmHg将凝胶抽真空5分钟。产量为100g的凝胶。
变异体(d)在55ml的水中加入20g二甲亚砜和7.5％的“二氢卟酚的液态提取物”使得所得凝胶中有1％浓度的二氢卟酚e6，然后加入15g的Aculyn 33A(ISPUSA)。将该物质搅拌到均匀加入三乙醇胺水溶液直至pH值为8.5。以10-50mmHg将凝胶抽真空5分钟。产量为100g的凝胶。
实施例9一种生产PS的特殊情况—生产“Radachlorin，二甲亚砜溶液作为外用”的药物形式。
变异体(a)在凝胶过滤后，在实施例4中所描述的混合液中加入稀盐酸溶液直至PS沉淀，将沉淀滤出，用注射用的无热原的水调整使得光敏剂浓度为7.5％物质，14g所得的“二氢卟酚的液态提取物”在室温下加入到86g的二甲亚砜中使所得溶液中有1％浓度的二氢卟酚e6，并搅拌至均匀。产量为100g溶液。
变异体(b)在凝胶过滤后，在实施例4中所描述的混合液中加入稀盐酸溶液直至PS沉淀，将沉淀滤出，用注射用的无热原的水调整使得光敏剂浓度为7.5％物质，0.8g所得的“二氢卟酚的液态提取物”在室温下加入到99.2g的二甲亚砜中使所得溶液中有0.05％浓度的二氢卟酚e6，并搅拌至均匀。产量为100g溶液。
实施例10为了识别紫色素5，实施例2中的反应混合物在SephadexG10柱上进行凝胶过滤，使用N-甲基-D-葡糖胺溶液作为洗脱剂产生3个部分，第一和第二部分含紫色素5。中和这些部分，滤出沉淀物，溶解在氯仿-甲醇1∶1的混合液中，并用重氮甲烷酯化。用水洗涤混合物，分离出有机相，用无水硫酸镁干燥，在真空中蒸发浓缩并在硅凝胶上色谱分析，Merck，Kieselgel，0.04-0.063，收集最后(移动最少的)部分。如果需要，将所得的紫色素5二甲酯(10，1％根据用于酯化的干燥反应物质计算)重复进行色谱分析。
PMR光谱(图15)(在DMSO-D6，浓溶液中)9.64，9.46，8.82，(s，内消旋-H)，8.06(2d，CH＝CH2)，6.82(s，γ-内消旋-CHO)，6.34，6.31，6.19，6.16(2d，CH＝CH2)，4.54(m，7-H)，4.46(m，8-H)，3.61(q，4-CH2CH3)，4.20，3.81，3.57，3.53，3.47，(5s，-COOHCH3和核CH3)，2.38，2.35(2m，7-CH2CH2COOH)，2.68，1.85，(2m，7-CH2CH2COOH)，1.73(d，8-CH3)，1.70(t，4-CH2CH3)ppm.质谱图(图16)e.i.，M+(％)，594(8.6)，566(100.0)，505(5.1)，491(9.8)，475(8.2)，463(1.7)，447(1.4)，433(1.7)，403(2.0)，262(5.0)。
可见的吸收光谱(图17)λ(ε)(氯仿)，408(117200)，501(11380)，542(9830)，617(6720)，668(35200)。
将紫色素5二甲酯溶解在丙酮中，以1∶2比例加入浓盐酸(37％)。在25℃将混合物搅拌2小时，中和，滤出紫色素5，用水洗涤，溶解在10％N-甲基-D-葡糖胺溶液中并在用1％N-甲基-D-葡糖胺溶液作为洗脱剂的SephadexG10柱上进行凝胶过滤，收集到第二部分，中和，滤出沉淀，用水洗涤，在五氧化磷上干燥直至重量恒定产生紫色素5(5，2％根据用于酯化的干燥反应物质计算)。
PMR光谱(图12)(在DMSO-D6，浓溶液中)9.55，9.39，8.79，(s，内消旋-H)，8.09，8.04，7.97，7.92(2d，CH＝CH2)，6.84(s，γ-内消旋-CHO)，6.37，6.32，6.13，6.10(2d，CH＝CH2)，4.60(m，7-H)，4.465(m，8-H)，3.55(q，4-CH2CH3)，3.75，3.46，3.23，(s，核-CH3)，2.38，2.32(2m，7-CH2CH2COOH)，2.71，2.20，(2m，7-CH2CH2COOH)，1.76(d，8-CH3)，1.72(t，4-CH2CH3)ppm。
质谱图(图13)e.i.，M+(％)，566(8.2)，494(100.0)，447(9.1)，435(49.6)，421(12.7).405(6.6).254(7.1)。
可见的吸收光谱(图14)λ(ε)(乙醇)，408(116900)，501(11320)，540(9790)，615(6710)，665(35090)。
实施例11“二氢卟酚的液态提取物”物质和“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)的药物形式的药代动力学和代谢的研究。
实施例2中769,2mg/kg的6.5％“二氢卟酚的液态提取物”(50mg/kg计算无水氯物质)腹膜内给与Balb/c系小鼠。小鼠在注射3小时后屠宰(每一组有3只小鼠)。肝、肾、脾、肺、小肠、肿瘤，周围肌肉组织以及血液、尿、来自大肠的粪便称重100mg，每一样都在玻璃均浆质器中彻底的均浆，均浆器中补充4ml的盐溶液。为了检查生物液(血液、尿)每种液体取出0.1ml接着溶解在4ml的盐溶液中。所得的均浆液在“Perkin-Elmer”分光荧光计(MPF-44a型)上进行研究。
用相似的方法研究“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)的药物形式，该方法使用小鼠器官和组织的均混液，以50mg/kg的剂量将制剂腹膜给予小鼠，在注射3小时后屠宰动物。
在两种情况下，在肝、小肠、脾、肾组织的荧光强度最大值的变化至670nm(和0.01M硼酸盐缓冲溶液(pH9.2)相比差10-12nm，带有1％人血清白蛋白的0.01M硼酸盐缓冲溶液(pH9.2)相比差5-6nm)，表明了“Radachlorin，0.5％注射液”的代谢(图5)。
在荧光光谱中此现象看上去不一样，不仅仅是由于介质的疏水效应(例如，在与蛋白质、脂蛋白的疏水相互作用后)而发生简单的光谱变宽和移向长波长范围。观察到强度最大值的变化而不带有或带有很少的带变宽，它是形成新化合物的特征。紫色素5在pH为9.2，带有1％的人血清白蛋白的0.01M硼酸盐缓冲溶液(pH9.2)中的荧光谱的特征是存在670nm带。
在血液中，肺实质像在皮肤和肿瘤中一样，在波长669nm处观察到1.4-1.5倍宽的光谱，表明“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)(其与蛋白质的络合物)以及均浆液的中代谢混合物的存在。
如果以0.5-1.0μM的浓度将“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)直接加入到含有完整动物组织均浆的试管中，在血液、小肠、肝、脾和肺中检测“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)的代谢产物(转移到长波长范围光谱没有变宽)，只有在皮肤均浆中，才观察到光谱半宽中有1.15倍的轻微升高，表明标本中存在“Photochlorin”-代谢物混合物。
如果器官均浆中的“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)浓度上升到5-10μM，几乎在所有的样品中都记录到二氢卟酚e6—紫色素5混合物的存在(光谱转移到长波长1.15处，光谱的半宽增加了1.05倍)。
因此，有可能认为形成的“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)的代谢物加入均浆中取决于制剂的浓度和均浆组织的酶的活性。
这些实验清楚地阐明了在体内和体外条件下二氢卟酚e6转化为紫色素5。这种转化与在加热时二氢卟酚e6转化为紫色素5是相似的。
实施例12N-辛醇/磷酸盐缓冲液，pH7.4，分配系数。
300ml的n-辛醇和300ml的磷酸盐缓冲液，pH7.4，旋转20秒钟，以10000rpm的速度离心10分钟。具有5mg/ml PS浓度的0.1ml PS等分溶解在配制的缓冲液(2ml)和n-辛醇(8ml)中，在406nm处测定吸收最大值。
获得了Doc和Dbc的值，其中o是n-辛醇，b是磷酸盐缓冲液，c是对照。N-辛醇/磷酸盐缓冲液分布的平衡可以通过在20℃下旋转2ml磷酸盐缓冲液和8mlN-辛醇(具有0.1ml的PS)的溶液20秒钟，接着在10000rpm离心10分钟。在406nm出测定每一相的光密度，给出Do和Db的值，其中o是n-辛醇，b是磷酸盐缓冲液。
根据公式来计算CdCd＝(DoVoDocVoc)/(DbVbDbcVbc)，其中Vo-测定平衡分布所用的辛醇体积(8ml)，Voc-用于对照测定等分吸收(8ml)的水饱和的辛醇体积，Vb-测定平衡分布所用的缓冲液体积(2ml)，Vbc-用来于对照测定等分吸收(2ml)测定的辛醇饱和的缓冲液体积。实验进行3次，获得的Cd值是平均的。
所得的值是1.4±0.3。
实施例13“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)药物形式的体外光毒性(生物活性)和细胞毒性(细胞毒性)的测定。
在这项工作中，使用了层式“FlowLab”(UK)，CO2-培养箱“Flow Lab”(UK)，多扫描的“Bio-Tek仪器”(USA)，介质和血清“PanEco”(俄罗斯)。
一个系的一个实验细胞在2个48-细胞平板中通过一个是用来激光照射的，一个是做“黑暗”实验的。第二天，将制剂加入到汇合状态的细胞中，平板在黑纸中保持恒温。研究的制剂浓度是0.1，0.5，2.0，5.0μM。在加入制剂3小时后，用激光照射细胞，暴露照射剂量是50J/cm2，39小时过后进行MTT-试验，及用14C-胸苷温育以测定DNA合成(也测试了“黑暗”盘子)。在所有的情况中，平板的上面部分是用作MTT-试验的，下面部分是用来测定DNA合成以及在用结晶紫染色后测定细胞的数量。
表2所列出的数据是4个平行实验的平均值。
实施例14“二氢卟酚的液态提取物”物质和“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)药物形式的毒性性质的体内研究。
向实验室的重19-21g小白鼠(俄罗斯医学研究院的动物繁殖场，Krukovo)静脉内注射PS来研究毒性。将动物保存在标准的动物房环境中，根据俄罗斯卫生部10.10.83的1179号规定“关于在健康保护机构中的实验室老鼠所消耗的饲料规格的认可”。在计算平均致死剂量-LD50后，根据动物的死亡来测定毒性。根据国家药典第11版(1，3)推荐的统计学方法进行计算。根据Hodge和Sterner基于所研究的制剂的LD50是指具有特定种类的毒性。在实验期间也记录了无毒性反应。
12只小鼠(6雄和6雌)给予每一种测试的PS剂量。下面的剂量用来测定PS的LD505，10，15，20，30，40，50，75，100，125，150，175，200，225，250，275mg/kg。PS浓度为5mg/ml的溶液静脉内注入小鼠体内，剂量根据注入的PS体积来改变。
所得的LD50值是210.53±22.2mg/kg，LD10值是169.87mg/kg。
实施例15使用“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)药物形式的体内生物活性。
“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)药物形式的光动力学活性在Balb/c系小鼠上进行研究，这些小鼠在后腿肌肉上都接种了T36胚胎癌。鼠的重量是20-21g。在接种肿瘤2周后，利用二极管激光ML-662-SP来实现照射步骤。在进行之前将照射区域的皮肤去毛。
以40mg/kg的剂量将制剂腹膜内注入，和足够的治疗剂量相一致。为了进行照射步骤，小鼠用乙醚麻醉。实验时在对照和实验组中的肿瘤重量是从0.9至1g不等。注射PS5-6小时后进行照射。每个动物，除了对照，都照射一次，步骤之后观察一个月，记录下肿瘤坏死和正常生理状态区域的面积。
照射暴露剂量的平均密度是150或300J/cm2。
在接受光剂量为300J/cm2组群中，观察到的最好结果是在PDT治疗后1周内肿瘤完全坏死，痂形成，此痂在PDT1.5个月后退去。
实施例16使用“Radachlorin，0.5％注射液”(“Photochlorin”)药物形式治疗基底细胞皮肤癌。
基底细胞皮肤癌是通过细胞学刮痕检查来诊断的。在用100ml 0.9％无菌NaCl盐溶液稀释后将制剂静脉内逐滴注入使得浓度为病人体重的0.7mg/kg。2-3小时后，利用二极管激光ML-662-SP来照射肿瘤，波长是662nm，表面剂量是50J/cm2，不麻醉。在注射制剂和激光照射期间没有记录到不良副反应。照射2小时后，在肿瘤部位形成了暗褐色的的病灶，周围有1-2cm的红色区域。第一天结束，在肿瘤的部位以干燥的暗褐色痂(焦痂)的形式形成了坏死。2-3周中，痂开始脱落，又2周后在原来基底瘤的部位形成的皮肤缺损完全上皮化，并有好的美容效果。
实施例17使用“Radachlorin，0.5％凝胶”药物形式治疗基底细胞皮肤癌。
基底细胞皮肤癌是通过细胞学刮痕检查来诊断的。凝胶以薄层应用于肿瘤部位，并且尽可能的不碰到健康皮肤部分。在使用凝胶20-40分钟后进行照射。用二极管激光ML-662-SP(“Mylon-Sign Plus”俄罗斯)照射，波长是662nm。照射的暴露剂量密度是2500J/cm2。照射2小时后，在肿瘤部位形成了暗褐色的病灶，周围有1-2cm的红色区域。1周中，在肿瘤的部位以干燥的暗褐色痂(焦痂)的形式形成坏死。2周中，痂开始脱落，又2周后在原来基底瘤的部位形成的皮肤缺损完全上皮化，并有好的美容效果。
实施例18使用“Radachlorin，0.5％溶液以二甲亚砜作为外用”药物形式去除纹身。
这种溶液应用于餐巾，后者置于纹身上，用黑纸或薄的铝箔盖住并固定30分钟。多余的溶液用酒精棉花从表面去除。用二极管激光ML-662-SP(“Mylon-SignPlus”俄罗斯)照射，波长是662nm，照射沿着标本线进行以避免影响周围的组织。照射的暴露剂量密度是120J/cm2。照射1小时后，在纹身的部位观察到皮肤发红和肿胀。到第二天结束，形成了暗褐色的“图片”，周围有1mm的红色区域。2周中，在纹身的部位以干燥的暗褐色痂(焦痂)的形式形成坏死。又2周后，痂和纹身一起开始剥落。在较小的光剂量时通过染色脱色，不会坏死，但在这种情况下需重复一段时间。在6周中作为PDT的结果，在纹身的部位形成了一块软粉红色组织，这块组织和周围皮肤有一点不同，观察到良好的美容效果。
权利要求
1.一种包含碱金属二氢卟酚盐的光敏剂，其特征在于，二氢卟酚是由二氢卟酚e6(13-羧基-17-[2-羧乙基]-15-羧甲基-17，18-反-二氢-3-乙烯基-8-乙基-2，7，12，18-四甲基卟啉) 组成80-90％，由紫色素5(13-羧基-17-[2-羧乙基]-15-甲酰基-17，18-反-二氢-3-乙烯基-8-乙基-2，7，12，18-四甲基卟啉) 组成5-20％，由紫色素18-二氢卟酚P6(13-羧基-17-[2-羧乙基]-15-羧基-17，18-反-二氢-3-乙烯基-8-乙基-2，7，12，18-四甲基卟啉) 构成其余部分，这样提及的成分形成组合物。
2.如权利要求1所述的光敏剂，其特征在于，钠用作碱金属。
3.如权利要求1所述的光敏剂，其特征在于，钾用作碱金属。
4.一种生产光敏剂的方法，其特征在于，螺旋藻生物质用丙酮处理直至叶绿素α完全提取，将生物量滤出或离心，用酸处理提取物以便去除叶绿素分子中的镁离子，并水解叶绿酯基，所得的脱镁叶绿酸α衍生物与强无机碱反应，特征在于在用酸处理提取物去除叶绿素分子中的镁离子后，中和提取物，滤出沉淀的脱镁叶绿素a，然后脱镁叶绿素a在盐酸-丙酮-己烷混合液中水解，每1g粗脱镁叶绿素α使用6-16ml丙酮，0.6-6ml己烷和5-10ml浓盐酸，混合物加热至40-60℃，搅拌20分钟-1小时，然后加入己烷(6-16ml)，有机相用丙酮和盐酸(2-10∶1)的混合物洗涤，用己烷洗涤水相，然后用过量的柠檬酸钠(3-，2-或单取代)水溶液中和含脱镁叶绿酸α的水相，滤出沉淀的脱镁叶绿酸α，用水洗涤，在丙酮-水的混合液中重结晶，空气干燥直至其重量变得恒定，然后将脱镁叶绿酸α溶解在丙酮中，强无机碱以浓度为0.05-1.00％的水溶液形式加入，在30-60℃下搅拌5-30分钟，额外体积的强无机碱以浓度为1-50％的水溶液形式加入，混合液在40-60℃下加热20-90分钟，用稀盐酸中和，二氢卟酚e6沉淀物通过离心分离，用蒸馏水洗涤直至酸反应消失，获得55-80％的二氢卟酚e6，然后为了分离出线状的四吡咯将二氢卟酚e6从丙酮中重结晶出来，滤出二氢卟酚e6并用蒸馏水洗涤，二氢卟酚e6在40-100℃下在密封容器中加热1小时-30天，然后冷却，加入强碱溶液直至pH值为7.5-8.5，然后用供注射用的无热原的水调整溶液使得光敏剂浓度为6.5-7.5％物质。
5.一种制备如权利要求4所述的光敏剂的方法，其特征在于在加入强碱直至pH值为7.5-8.5后，混合物通过凝胶过滤使得氯e6的百分比达80-90％，紫色素5达5-20％，紫色素18占剩下的比例，然后加入稀盐酸溶液直至光敏剂沉淀，用供注射用的无热原的水调整溶液使得光敏剂浓度为6.5-7.5％物质，这样就获得了“二氢卟酚的液态提取物”。
6.一种制备如权利要求5所述的光敏剂的方法，其特征在于，在凝胶过滤后，在光敏剂溶液中加入稀盐酸溶液直至光敏剂沉淀，然后滤出沉淀物或用离心分离，加入获得RF国家药典认可的添加剂直至pH值为7.5-8.5，加入用于注射的无热原的水使得光敏剂浓度为0.1-1％物质，然后滤出细菌。
7.一种制备如权利要求5所述的光敏剂的方法，其特征在于，在凝胶过滤后，在混合物中加入稀盐酸溶液直至光敏剂沉淀，然后滤出沉淀物或用离心分离，用供注射用的无热原的水调整溶液使得光敏剂浓度为6.5-7.5％物质，根据下面的比例在凝胶基质中分散“二氢卟酚的液态提取物”0.5-12％物质的“二氢卟酚的液态提取物”，5-20％物质的二甲亚砜，剩余部分是水，药理学上可接受的添加剂和凝胶基质。
8.一种制备如权利要求5所述的光敏剂的方法，其特征在于，在凝胶过滤后，在混合物中加入稀盐酸溶液直至光敏剂沉淀，然后滤出沉淀物或用离心分离，用供注射用的无热原的水调整溶液使得光敏剂浓度为6.5-7.5％物质，然后所得的“二氢卟酚的液态提取物”根据下面的比例溶解在二甲亚砜中0.5-12％物质的“二氢卟酚的液态提取物”，剩余部分是二甲亚砜。
全文摘要
本发明涉及药物并涉及检测和治疗肿瘤的光敏剂。本发明的光敏剂为含有盐或碱金属形式的氯的组合物的形式。用作氯的是80－90％的氯e
文档编号A61P35/00GK1512881SQ01823093
公开日2004年7月14日 申请日期2001年10月4日 优先权日2001年3月30日
发明者A·V·列舍特尼科夫, A V 列舍特尼科夫, I·D·扎列夫斯基, 扎列夫斯基, J·V·科莫夫, 科莫夫, A·V·伊万诺夫, 伊万诺夫, A·V·卡曼扬, 卡曼扬, A·T·格列尤什科, 格列尤什科, V·P·拉普泰夫, 拉普泰夫, N·P·诺伊高多瓦, 诺伊高多瓦, 0·Y·阿巴库莫瓦, 阿巴库莫瓦, V·A·普里瓦洛夫, 普里瓦洛夫, A·V·拉帕, 拉帕, V·A·罗曼诺夫, 罗曼诺夫 申请人:“反射药物”有限责任公司