Gprasp2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于遗传学、分子生物学，具体涉及遗传性疾病致病基因的鉴定方法，特别 涉及GPRASP2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 耳聋是导致交流障碍最常见的疾病，至2013年为止，在全球约有3. 6亿人患有耳 聋[1]，其中约有50%的患者发病与遗传有关。遗传性耳聋可分为综合征型耳聋（Syndromic Hearing Loss，SHL)和非综合征型耳聋（Non-syndromic Hearing Loss，NSHL)，其中 SHL约 占30%，其临床表型除了耳聋外，还有眼、骨肾、皮肤等其他病变。迄今为止约有300种SHL， 其中约有70种为X连锁遗传的SHL [h]。虽然在世界范围内不断有新的SHL大家系被定位 及新的致病基因被发现，但新的X连锁遗传的SHL大家系甚少被定位。并且由于听觉系统 结构、功能的复杂性，涉及听觉相关的基因种类和数量多，至今定位与克隆的SHL基因与预 期的还相距甚远。
[0003] 在包括连锁分析和纯合子定位在内的传统的疾病基因检测方法中[4' 5]，利用遗传 标记来发现基因组区域，然后在基因组区域中通过原位克隆以及对候选基因的研宄来发现 致病突变。而在对耳聋基因的检测和定位过程中，由于该疾病所表现出的的极端异质性使 得该过程变得更加繁琐。随着高通量测序（High-Throughput Sequencing)技术的引入以 及外显子组测序（Exome sequencing)的发展，基于其高通量，低成本和高准确率的特点，在 遗传性疾病基因检测中得到了广泛应用，已有一系列高水平的相关外显子组测序用于遗传 性疾病的基因研宄的报道 [6<。
[0004] 发明人采集到一个罕见的呈典型的X染色体隐性遗传的先天性SHL大家系，该家 系患者的临床特征除了耳聋外，还伴有耳廓及外耳道畸形、小眼以及双眼睑下垂等为特征 的面部畸形，研宄排除了已知的常染色体显性遗传性耳聋致病基因与家系耳聋表型的相关 性，结合孟德尔遗传方式分析，认为该家系是一个新的呈X连锁遗传的SHL，并且是由一个 新的基因致病。如果采用传统的单基因遗传性疾病基因的定位方法，由于连锁区域将涉及 已知基因、未知基因和预测基因，这将是一个耗时费力的过程。因此，外显子组测序技术结 合生物信息学分析、候选致聋基因新突变致病性分析等实现对耳聋性基因的鉴定。
[0005] 参考文献
[0006] [l]http://www. who. int
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[0009] [4]Lander ES,Botstein D.Strategies for studying heterogeneous genetic traits in humans by using a linkage map of restriction fragment length polymorphism. Proc Nat Acad Sci USA, 1986,83:7353 - 7735.
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[0011] [6]Rehman AU,Morell RJ, Belyantseva IA，et al. Targeted capture and next-generation sequencing identifies C9orf75,encoding taperin，as the mutated gene in nonsyndromic deafness DFNB79. Am J Hum Genet，2010, 86:378 - 388.
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【发明内容】
[0014] 本发明所要解决的技术问题是提供一种GPRASP2突变型基因。
[0015] 本发明还要解决的技术问题是提供上述突变型基因的鉴定方法。
[0016] 本发明最后要解决的技术问题是提供检测上述突变型基因的检测试剂盒。
[0017] 针对上述问题，发明人首先采用人基因组外显子捕获与高通量测序技术获得候选 SHL相关基因的突变位点，再结合常规测序的方法对候选基因突变位点逐一进行遗传共分 离验证、外显子以及外显子-内含子边界的序列比对与分析，最终找到了一个SHL相关的新 基因。由此可见，本发明发现致病基因的方法高效、快捷和准确度高，同时仅需对部分家系 成员的样本进行外显子捕获测序，大大降低了成本。
[0018] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0019] 一种GPRASP2突变型基因，其在人的GPRASP2基因（NM_001004051. 3)序列的第5 外显子编码区第1717~1718位核苷酸GC突变成为核苷酸AA(c. 1717-1718GC > AA)。
[0020] 其中，突变后的人的GPRASP2基因序列的第5外显子区，其核苷酸序列如SEQ IDNo:5 所示。
[0021] 一种重组载体，其含有上述的GPRASP2突变型基因。
[0022] -种重组细胞，其含有上述的重组载体。
[0023] 一种综合征型耳聋（SHL)检测试剂盒，其至少包括：根据GPRASP2基因所有5个外 显子及其外显子-内含子交界区序列设计的PCR引物；所述PCR引物用于PCR扩增，其扩增 产物包含GPRASP2基因第5外显子区的核苷酸序列；
[0024] 所述的PCR引物序列为如下引物对中的至少一对：SEQ ID No:6和SEQ ID No:7、 SEQ ID No:8 和 SEQ ID No:9、SEQ ID No: 10 和 SEQ ID No: 11、SEQ ID No: 12 和 SEQ ID No: 13、SEQ ID No:14 和 SEQ ID No:15、SEQ ID No:16 和 SEQ ID No:17;
[0025] 其中，引物SEQ ID No: 12和SEQ ID No: 13其扩增产物为GPRASP2基因第5外显 子编码区第1-744位核苷酸序列；SEQ ID No: 14和SEQ ID No: 15其扩增产物为GPRASP2基 因第5外显子编码区第689-1879位核苷酸序列；SEQ ID No: 16和SEQ ID No: 17其扩增产 物为GPRASP2基因第5外显子编码区第1857-2517位核苷酸序列。
[0026] 其中，所述编码区是从SEQ ID No:5中第334位的atg开始起始，到第2850位的 taa处终止。
[0027] 其中，上述综合征型耳聋（SHL)检测试剂盒还包括用于PCR的DNA扩增酶和相应 缓冲液。
[0028] -种遗传性疾病的相关基因的鉴定方法，包括以下步骤：
[0029] 1)利用人X染色体外显子组捕获和高通量测序技术对采集的综合征型耳聋（SHL) 家系的患者以及正常个体X染色体外显子组捕获和分析，获得候选的遗传性疾病相关基因 的突变位点；
[0030] 2)结合常规的测序方法对候选的遗传性疾病相关基因的突变位点进行鉴定：
[0031] 2A)家系内未参与X染色体外显子组捕获的其余样本进行遗传共分离验证；
[0032] 2B)对步骤2A)验证基因的外显子及外显子-内含子交界区的序列进行PCR扩增 和检测；
[0033] 2C)扩大样本量验证，以此鉴定遗传性疾病的相关基因。
[0034] 本发明中，所述遗传性疾病是指生殖细胞或受精卵的遗传物质（染色体和基因） 发生突变（或畸变）所引起的疾病，通常具有垂直传递的特征，具有以上特征的家族成员及 其关系称为遗传性疾病家系。
[0035] 本发明中，DNA样本来自于组织、血液或各种体液等。
[0036] 上述GPRASP2突变型基因、或试剂盒在制备综合征型耳聋（SHL)检测试剂中的应 用。
[0037] -种鉴定GPRASP2突变型基因的方法，其包括以下步骤：
[0038] 1)测定待测样本中GPRASP2基因中外显子和外显子-内含子交界区序列；
[0039]2)与野生型相比较，如果存在缺失、替换、插入则认定该基因存在突变；
[0040] 步骤1)中，采用如下引物中的至少一对分别扩增外显子或外显子-内含子交界区 的序列：SEQ ID No:6 和 SEQ ID No:7、SEQ ID No:8 和 SEQ ID No:9、SEQ ID No:l(^PSEQ IDNo:ll、SEQIDNo:12*SEQIDNo:13、SEQIDNo:14*SEQIDNo:15、SEQIDNo:16 和 SEQ ID No:17;
[0041] 上述鉴定GPRASP2突变型基因的方法，具体来说包括以下步骤：
[0042] 1)测定待测样品中GPRASP2基因第5外显子区的序列；
[0043] 2)GPRASP2基因第5外显子编码区第1717-1718位核苷酸GC，则所述的综合征型 耳聋（SHL)相关基因为野生型；GPRASP2基因第5外显子的上述对应位置突变为核苷酸AA， 则所述的综合征型耳聋（SHL)相关基因为突变型。
[0044] 步骤1)中，GPRASP2基因第5外显子编码区的第1717-1718位核苷酸GC的核苷 酸序列的测定采用？〇?的方法，所述？〇?引物序列如3￡0 10勵：14与3￡0 10勵：15所示。
[0045] 有益效果：本发明利用人X染色体外显子组捕获和高通量测序技术发现遗传性疾 病的相关基因。该方法方便、便捷，而且由于只需取一个或少量的个体样本进行X染色体外 显子组捕获，大大降低了成本。基于上述方法，本发明发现了一种SHL相关基因GPRASP2,该 基因编码的G蛋白偶联受体相关蛋白，这是首次发现该基因及其突变型与SHL的发生相关。 该基因的鉴定对SHL的易感和发生人群的基因诊断具有重要价值，对探索SHL致病机制和 开辟新的治疗途径具有重要意义。
【附图说明】
[0046] 图1 SHL相关基因突变位点的筛选与验证流程图。
[0047] 图2该SHL家系参与X染色体外显子组捕获及测序的2例耳聋患者的典型听力图 (图2-A :患者-1，男，57岁，右侧外耳道闭锁，左侧外耳道过度狭窄，纯音测听示双耳不对称 的混合性听力损失；图2-B:患者-2,男，41岁，双侧外耳道闭锁，纯音测听示双耳对称的混 合性听力损失。
[0048] 图3 GPRASP2基因第5外显子编码区1717-1718位及其侧翼序列（参见SEQ ID N0:5)的测序结果（图3-A:SHL家系内男性患者，GPRASP2基因第5外显子编码区存在 c. 1717-1718GOAA半合子突变；图3-B :SHL家系内女性携带者，GPRASP2基因第5外显子 编码区存在c. 1717-1718GOAA杂合子突变；图3-C :听力正常人，测序图无突变现象）。
【具体实施方式】