专利名称：Bcl10基因突变的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。
背景技术：
BcllO 是一种含有胱冬妝酶募集结构域(Caspase Recruitment Domain, CARD)的细胞凋亡调节因子，是从粘膜相关淋巴组织(Mucosa-associatedLymphoid tissue, MALT)淋巴瘤的染色体转位中发现的；最初作为低度B细胞淋巴瘤(B-cell Lymphoma)相关基因得到鉴定的，BcllO基因位于多个抑癌基因聚集的染色体1P22位置，而染色体转位使整个bcllO基因在染色体上受到调节因子的控制而导致其超量表达。BCL10、CARMAl JPMALTI一道为淋巴细胞抗原受体介导的NF-κ B激活过程所必需，3种信号蛋白分子，在这条信号传导通路中互相协调，具有调节细胞凋亡和NF-κ B信号转导等活性(3)。如果NF-κ B家 族成员有基因缺陷或其上游的信号分子功能缺陷，则可能引起免疫缺陷性疾病；而异常的NF-κ B持续活化也可导致细胞过度增生、分化障碍或凋亡抑制，是自身免疫性疾病或淋巴造血系统肿瘤发生的重要原因。研究者们发现，BcllO蛋白在多种肿瘤组织中的表达增高，如大肠癌、宫颈癌、乳腺癌、尤其是在MALT淋巴瘤中表达量增加显著；且此110蛋白在不同部位的MALT中的表达情况也不一样，它和MALT淋巴瘤的形成有很大的关系。更进一步地，一项针对135名MALT淋巴瘤患者的临床研究结果显示，45%的患者BcllO基因出现缺失突变；另一项研究项目则显示，BCL10基因是所有B细胞亚系发育过程所必不可少的。高分辨熔解曲线(high-resolution melt,HRM)是一种高效稳健的PCR技术,可用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它不受突变碱基位点与类型局限，操作简便快速，使用成本低而敏感性高。LightCycler Nano System是 Light Cycler 480System 的缩小版,ightCycler 480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR系统应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等；影响因子10分以上5篇，包括Nature, Nature Methods, NatureGenetics,影响因子 5 — 10 分 10 篇，5 分以上文章占总数的18%逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有技术的测序法有三个缺点第一灵敏度不高，低比例突变(< 20%)无法检测；第二 耗时长，一般需要2-3天；第三成本高。鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的实BCL10基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。
发明内容
本发明要解决的技术问题主要是现有的测序法有三个缺点第一灵敏度不高，低比例突变(< 20%)无法检测；第二耗时长，一般需要2-3天；第三成本高。为了解决以上问题，本发明技术采用高分辨率熔解曲线法(HRM法)，不仅能检出O. 1%的突变、极大地提高了检出率，且检测时间短(只需要I小时)、成本低。本发明设计一对引物将包括待突变位点在内的基因序列扩增出来作为野生型模板(wt);再设计引物在将待突变位点改变成所需碱基的同时，将上述DNA片段在待突变分为两段，且在待突变位点附近有少量重复序列；最后利用部分重复的两个DNA片段混合起来作为模板，而利用最开始的那对引物将两个小片段连接起来，其产物尽管与wt大小完全 相同，但却含有所期望的突变点。PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)· PCR产物的Tm取决于GC含量·高Tm G:C>A:T>G:G>G:T=G:A > T:T=A:A>T:C>A:C>C:C低 Tm·纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线(包括野生型纯合子或突变纯合子)··杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.S卩，为解决上述技术问题，本发明提供了一种BCLlO基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤一种BCLlO基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤设计一对引物将包括待突变位点在内的基因序列扩增出来作为野生型模板；再设计引物在将待突变位点改变成所需碱基的同时，将上述DNA片段在待突变点分为两段，且在待突变位点附近有少量重复序列；最后利用部分重复的两个DNA片段混合起来作为模板，而利用最开始的那对引物将两个小片段连接起来，其产物即含有所述的突变点；不同比例混合上述两种片段，用HRM方法进行区分。所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.所述的一种BCLlO基因突变的快速检测方法，其包括如下步骤样本处理取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀,4°C保存； DNA提取取200 μ L抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；qPCR-HRM 检测，包括；结果分析及判定通过HRM方法，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。所述qPCR-HRM检测的程序包括95°C变性10分钟；95°C变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65°C，每个循环降低1°C，时间为10秒钟；72°C延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环；95°C变性60秒钟；40°C变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60°C到95°C，缓变率是O. 050C /S)。所述野生型目的片段的获取以已知未突变基因组为模板，BCL2F和BCL2R为引物进行实验，获得条带单一的特异性野生型目的片段；将目的片段稀释至I万- ο万倍，终浓度约为10-20ng/y L，作为检测野生型阴性对照模板用。所述BCL10-2突变型目的片段的获取突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成BCL10-2突变型目的片段。所述M/W = 1%阳性对照模板的获取混合99 μ L野生型模板和I μ L突变型模板，配制100 μ L突变型/野生型(M/W) =1 %的混合模板，作为检测用I %阳性对照模板。本发明的有益效果是本发明的HRM法能检出O. I %的突变、检测时间只需要I小时、每样品试剂耗材成本〈Υ7. 00，S卩，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。
图I为本发明BCLlO基因HRM检测分析结果示意图。
具体实施例方式本发明应用于生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。HRM的主要原理是利用特定的饱和荧光染料插入DNA双链中，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。由于PCR扩增后得到的DNA片段在长度、GC含量以及碱基互补性等方面存在差异，应用极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。其中所述 HRM 仪器 LightCycIer480 及其简化版 LightCycIer Nano System,加上其 ResoLight饱和染料，为本发明HRM检测工作提供了极大的便利。HRM检测所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料，它不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析。此技术简化了操作时间和步骤，降低了使用成本；此技术可以鉴别出PCR产物中杂合的单碱基突变，比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。其技术优势高通量；高敏度，是传统“PCR+测序”方法25-250倍；特异性高；重复性好；成本低，每个样本成本在10元以下；适用范围广等优点。如图I所示，本发明分别设计了一对引物将包括待突变位点在内的基因序列扩增出来作为野生型模板(wt);再设计引物在将待突变位点改变成所需碱基的同时，将上述DNA片段在待突变分为两段，且在待突变位点附近有少量重复序列；最后利用部分重复的两个DNA片段缓和起来作为模板，而利用最开始的那对引物将两个小片段连接起来，其产物尽管与wt大小完全相同，但却含有所期望的突变点。下面以BCL2F和BCL2R为引物为例，说明具体的操作。I、样本处理取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存。2,DNA 提取取 200 μ L 抗凝血用 QIAmp DNA Blood Mini Kit 试剂盒提取 DNA。采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测，3、qPCR-HRM 检测的体系I)对照的设立和检测重复孔每个样本的检测必须同时设有对照实验，包括野生型阴性对照和m/w (突变/野生=1%)阳性对照。对照和样本均采用复孔。2) 10 μ L反应体系构成如下(以4管反应为例)A先按下表配制MasterMix,混匀后短暂离心，然后吸取4. 5 μ L加至每管8联管中，计4管
MasterMix 组成(Ix)(5χ)
25mM MgC12I. 2μ Iθ Π
2 μ MBCL-2F primerI μ I5 μ I
2 μ MBCL-2R primerI μ I5 μ I
Η20I. 3μ I6. 5μ I
~4. 5μ I22. 5μ IB向每管中加入O. 5 μ L (约5-10ng)模板DNA。C 向每管中加入 5yL 2x HRM 荧光 Master (罗氏 Cat#04 909 631 001)；Σ=10 μLo混合均匀，盖上8联管盖。将8联管置于LightCycler Nano仪器中，合上仪器盖子。4、qPCR-HRM 检测的程序I) %°C变性 10 分钟；2) 95 °C 变性 10 秒钟；3)退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65°C，每个循环降低1°C，时间为10
秒钟；4) 72 °C 延伸 3O 秒钟；5)重复第2步到第四步45个循环；6) 95 0C 变性 60 秒钟；7) 40 °C 变性 60 秒钟；8)设置高分辨率熔解温度从60°C到95°C，缓变率是O. 05°C /s)。5、结果分析I)设置好样本名称、检测靶点和所使用的荧光染料。2)通过各孔的熔解曲线图可以查看各孔PCR条带特异性；以野生型样品孔为基线，通过高分辨率熔解曲线，可以查看阳性对照孔与样本孔图谱。3)结果判定
在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。6、野生型目的片段的获取以已知未突变基因组为模板，BCL2F和BCL2R为引物进行实验，参照步骤2及步骤3的反应体系及程序，获得条带单一的特异性野生型目的片段。将目的片段稀释至I万-10万倍，终浓度约为10_20ng/ μ L，作为检测野生型阴性对照模板用。7、BCL10_2突变型目的片段的获取突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物(BCL2F, BCL2MR ；BCL2MF, BCL2R)获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片 段连接起来，构成BCL10-2突变型目的片段。I)突变第一步PCR以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以BCL2F，BCL2MR ；以及BCL2MF，BCL2R为引物进行两组实验，实验体系及程序参照步骤2及步骤3，获得两个条带单一的片段。2)突变第一步产物稀释将突变第一步获得的两段PCR产物稀释I万-10万倍，终浓度约为10_20ng/ μ L。3)突变第二步PCR以稀释后的第一步两段产物为模板，以BCL2F+BCL2R为引物进行第二步PCR，实验体系及程序参照步骤2及步骤3，获得条带单一的片段。4)突变第二步产物稀释将突变第二步获得的PCR产物稀释I万-10万倍，终浓度约为10_20ng/ μ L。 8、M/W = I %阳性对照模板的获取混合99 μ L野生型模板和IyL突变型模板，配制100 μ L突变型/野生型(Μ/W) =1 %的混合模板，作为检测用I %阳性对照模板。9、结果分析通过HRM方法，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型，如图；依次为O. 1%、1%、和10%的BCLlO突变分子；其中距横轴最近的是O. I %。附表BCL10_2_11311DEL T 检测引物序列
权利要求
1.一种BCLlO基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下实现步骤 设计一对引物将包括待突变位点在内的基因序列扩增出来作为野生型模板； 再设计引物在将待突变位点改变成所需碱基的同时，将上述DNA片段在待突变点分为两段，且在待突变位点附近有少量重复序列； 最后利用部分重复的DNA片段混合起来作为模板，而利用最开始的那对引物将两个小片段连接起来，其产物即含有所述的突变点； 不同比例混合上述两种片段，用HRM方法进行区分。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线。
4.根据权利要求I所述的一种BCLlO基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤 样本处理取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；DNA提取取200 μ L抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测； qPCR-HRM检测，包括 结果分析及判定通过HRM方法，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述qPCR-HRM检测的程序包括95°C变性10分钟；95°C变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65°C，每个循环降低1°C，时间为10秒钟；72°C延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环;95°C变性60秒钟；40°C变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60°C到95°C，缓变率是O. 05°C /s)。
6.根据权利要求I或4任一所述的方法，其特征在于所述野生型目的片段的获取以已知未突变基因组为模板，BCL2F和BCL2R为引物进行实验，获得条带单一的特异性野生型目的片段；将目的片段稀释至I万-10万倍，终浓度约为10-20ng/ μ L，作为检测野生型阴性对照模板用。
7.根据权利要求I或4任一所述的方法，其特征在于所述BCL10-2突变型目的片段的获取突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成BCL10-2突变型目的片段。
8.根据权利要求I或4任一所述的方法，其特征在于所述M/W= I %阳性对照模板的获取混合99 μ L野生型模板和I μ L突变型模板，配制100 μ L突变型/野生型(M/W) =1 %的混合模板，作为检测用I %阳性对照模板。
全文摘要
本发明提供了一种BCL10基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤设计一对引物将包括待突变位点在内的基因序列扩增出来作为野生型模板；再设计引物在将待突变位点改变成所需碱基的同时，将上述DNA片段在待突变点分为两段，且在待突变位点附近有少量重复序列；最后利用部分重复的两个DNA片段混合起来作为模板，而利用最开始的那对引物将两个小片段连接起来，其产物即含有所述的突变点；不同比例混合上述两种片段，用HRM方法进行区分；与其它方法相比，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。
文档编号C12Q1/68GK102965437SQ20121046225
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者王明, 范少安 申请人:上海赛安生物医药科技有限公司