专利名称：Idh2基因突变的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。
背景技术：
异朽1檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase, IDH)在三羧酸循环中将异朽1檬酸转化为α-酮戊二酸，从而为机体的能量代谢、生物合成以及抗氧化压力等方面发挥起重要作用。人体内有两种类型的IDH酶需要以NAD为辅酶的IDH酶(EC1. I. I. 41)，和需要 NADP的IDH酶(ECl. I. I. 42);两者在不同亚细胞部位催化同一反应在胞液中以NADP+ 为辅酶，在线粒体内膜中则以NAD+为辅酶。
血清IDH酶含量测定，临床上对诊断肝病有一定意义,尤其是恶性肿瘤病人血清 IDH酶升高，往往是肝脏转移的信号。此外，人们发现急性髓系白血病(AML)患者存在的IDH 基因突变，可能是AML患者的不良预后因素，因此检测IDH突变可能为白血病的分层治疗提供依据。更进一步地，通过全基因组测序，还发现IDHl和IDH2突变存在于AML、急性淋巴细胞白血病(ALL)及骨髓增殖性疾病(MPD)中，但在慢性粒细胞白血病(CML)中尚未检测到突变，有报道称IDHl和IDH2突变在CN-AML患者中的发生率分别为5. 5-9. 6% [10-14]和 3-11%,并认为具有IDHl和IDH2突变的AML患者具有较低的CR，较高的RR和较短得OS。
除此之外，近年来也在神经胶质瘤中发现了 IDH基因的点突变，导致酶原有活性下降，同时获得新的将α -酮戊二酸转化为2-羟戊二酸的功能；发生突变的酶还产生 “2-羟基戊二酸”(2HG)，为一种潜在的致癌代谢物。IDH突变促进癌症形成的机制多样， 如产生2HG的IDH突变体能阻止组蛋白去甲基化而抑制细胞分化，有助于细胞积累突变而最终导致肿瘤发生；而人原始星细胞中的IDHl突变诱导DNA超甲基化，并对“甲基化组” (methylome)进行重塑，以模仿CMP表现型(神经胶质瘤和其他固体肿瘤的一个共同特征); 此外，2HG的(R) —对映体(而不是〈S〉-2HG)能刺激“ELN脯氨酰4-羟化酶”的活性，导致 “缺氧诱导因子”(HIF)水平下降，后者又能增强细胞增殖。这些研究成果为了解神经胶质瘤的形成建立了一个框架，同时也凸显了人类癌症中基因组变化与基因组以外的变化之间的相互作用。
高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法。使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs, mutations)。
SYBRTM Green I 对 PCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。
罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LC Green,它有三个优点 饱和染料毒性低；高浓度可以使DNA达到饱和；降低了染料位置重组的可能。
而PCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应产物的高分辨率熔解曲线HRM的要求包括
仪器高分辨率高均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响
试剂稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线
软件高分辨率熔解曲线分析专用软件
罗氏突光定量PCR系统LightCycler Nano System具有光源好、温控好、检测好、 加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。
LightCycler Nano System 是 LightCycler 480System 的缩小版，
ightCycler 480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR系统应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等；影响因子10分以上 5 篇，包括 Nature, Nature Methods, NatureGenetics,影响因子 5 — 10 分 10 篇，5 分以上文章占总数的18%逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点
第一灵敏度不高，低比例突变(< 20%)无法检测；
第二耗时长，一般需要2-3天；
第三成本高。
鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的实IDH2基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。
发明内容
本发明要解决的技术问题主要是现有的测序法有三个缺点
第一灵敏度不高，低比例突变(< 20%)无法检测；
第二耗时长，一般需要2-3天；
第三成本高。
为了解决以上问题，本发明提供了一种丝裂原活化蛋白激酶KMitogenACtivated protein Kinase Kinase I, IDH2/MAPKK1)基因突变的快速检测方法,本发明技术在突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物，两者分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)PCR产物的Tm取决于GC含量.
高Tm G : C>A : T>G G>G T=G A > T:T=A A>T:C>A OC C 低 Tm
将纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线分析，得到相似峰形的熔解曲线；当然，包括野生型纯合子或突变纯合子。
将杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线分析，得到不同峰形的熔解曲线.
S卩，为解决上述技术问题，本发明提供了一种IDH2基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤
一种IDH2基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤
在IDH2基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；
分别设计了 IDH2的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；
不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分。
所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的 Tm取决于GC含量。
所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.
所述不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000 和0，最后用HRM方法进行区分。
一种IDH2基因突变的快速检测方法，其包括如下步骤
样本处理取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；DNA提取 取200 μ L抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；
qPCR-HRM检测，包括对照孔的设立和检测重复孔；10 μ L反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR 系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。
所述qPCR-HRM检测的程序包括95°C变性10分钟；95°C变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65 °C，每个循环降低1°C，时间为10秒钟；72°C延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环；95°C变性60秒钟；40°C
变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60 V到95 °C，缓变率是O. 05 °C /s )。
所述IDH2突变型目的片段的获取包括
利用带有突变位点的突变引物IDH2F，IDH2MR ；IDH2M, IDH2R获得突变位点前后两段突变片段；
将这两段突变片段连接起来，构成IDH2突变型目的片段。
所述IDH2突变型目的片段的获取包括
突变第一步PCR 以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以IDH2F，IDH2MR;以及 IDH2M, IDH2R为引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；
突变第一步产物稀释将突变第一步获得的两段PCR产物稀释I万-10万倍，终浓度约为IOng/ μ L ；
突变第二步PCR :以稀释后的第一步两段产物为模板，以IDH2F+IDH2R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；
突变第二步产物稀释将突变第二步获得的PCR产物稀释I万-10万倍，终浓度约为 10-20ng/μ L。
所述M/W = 1%阳性对照模板的获取混合99 μ L野生型模板和I μ L突变型模板， 配制100 μ L突变型/野生型(M/W) =1 %的混合模板，作为检测用I %阳性对照模板。所述野生型目的片段的获取包括以已知未突变基因组为模板、IDH2F+IDH2R为引物进行实验， 获得条带单一的特异性IDH2野生型目的片段；将目的片段稀释至I万-10万倍，终浓度约为10-20ng/y L，作为检测野生型阴性对照模板用。6
本发明的有益效果是本发明分别设计了 IDH2的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，最后用HRM方法进行区分，采用了高分辨率熔解曲线法(HRM法)；与其它方法相比，本发明的HRM法能检出O. 1%的突变、检测时间只需要I小时、每样品试剂耗材成本〈Y7. 00，即，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。
图I为本发明IDH2基因HRM检测分析结果示意图。
具体实施例方式
本发明应用于生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR 技术。
如图I所示，我们分别设计了 IDH2的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100，最后用HRM方法进行区分。下面以IDH2为例，说明具体的操作。
I样本处理取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀,4°C保存。
2DNA 提取取 200 μ L 抗凝血用 QIAmp DNA Blood Mini Kit 试剂盒提取 DNA。采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测。
3、qPCR-HRM 检测的体系
I)对照的设立和检测重复孔
2)每个样本的检测必须同时设有对照实验，包括野生型阴性对照和m/w (突变/野生=1%)阳性对照。对照和样本均采用复孔。
3) 10 μ L反应体系构成(引物序列见附表)如下(以4管反应为例)
4) A先按下表配制MasterMix,混匀后短暂离心，然后吸取4. 5 μ L加至每管8联管中，计4管
权利要求
1.一种IDH2基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下实现步骤在IDH2基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物； 分别设计了 IDH2的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段； 不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分。
5.根据权利要求I所述的一种IDH2基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤 样本处理取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；DNA提取取200 μ L抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测； qPCR-HRM检测，包括对照孔的设立和检测重复孔；10μ L反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统仪器中进行程序性检测； 结果分析及判定在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述qPCR-HRM检测的程序包括95°C变性10分钟；95°C变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65°C，每个循环降低1°C，时间为10秒钟；72°C延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环;95°C变性60秒钟；40°C变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60°C到95°C，缓变率是O. 05°C /s)。
7.根据权利要求I或5任一所述的方法，其特征在于所述IDH2突变型目的片段的获取包括 利用带有突变位点的突变引物IDH2F，IDH2MR ；IDH2M, IDH2R获得突变位点前后两段突变片段； 将这两段突变片段连接起来，构成IDH2突变型目的片段。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述IDH2突变型目的片段的获取包括 突变第一步PCR 以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以IDH2F，IDH2MR;以及IDH2M, IDH2R为引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段； 突变第一步产物稀释将突变第一步获得的两段PCR产物稀释I万-10万倍，终浓度约为 IOng/μ L ； 突变第二步PCR :以稀释后的第一步两段产物为模板，以IDH2F+IDH2R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段； 突变第二步产物稀释将突变第二步获得的PCR产物稀释I万-10万倍，终浓度约为10_20ng/μ L。
9.根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于所述M/W=1%阳性对照模板的获取混合99 μ L野生型模板和I μ L突变型模板，配制100 μ L突变型/野生型(M/W) =1 %的混合模板，作为检测用I %阳性对照模板。
10.根据权利要求I或5任一所述的方法，其特征在于所述野生型目的片段的获取包括以已知未突变基因组为模板、IDH2F+IDH2R为引物进行实验，获得条带单一的特异性IDH2野生型目的片段；将目的片段稀释至I万-10万倍，终浓度约为10-20ng/ μ L，作为检测野生型阴性对照模板用。
全文摘要
本发明提供了一种IDH2基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤在IDH2基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；分别设计了IDH2的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分；与其它方法相比，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。
文档编号C12Q1/68GK102925579SQ201210461630
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者王明, 范少安 申请人:上海赛安生物医药科技有限公司