专利名称：一种检测转cry1Ac基因甘蔗的恒温扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种植物转基因的检测方法，具体涉及一种检测转基因甘蔗的恒温扩增方法，属生物技术领域。
背景技术：
甘蔗螟虫，属昆虫纲鳞翅目，是危害甘蔗普遍而严重的一类钻蛀性害虫。螟虫种类多，世界甘蔗螟虫有65种，我国常见的有五种，即螟蛾科的条螟{ChiIo vmosatus)、二良螟{C. infuscatelIus)和白螟 i^cirpophaga excerpalis);卷叶蛾科的黄螟{Aryroploce■scAisteceafla);夜蛾科的大螟(5 inferens)。甘鹿原产于热带,经驯化后我国主要在广西、云南、福建等地种植，其加工产品蔗糖约占我国食糖总产的92%，甘蔗生产又被誉为蔗糖生产的第一车间，因此，甘蔗生产关系我国食糖安全。长期以来，螟虫是我国甘蔗生产上最重要和发生最普遍、危害最严重的虫害，各种螟虫每年可发生3-7代，世代重叠和多种螟虫混合发生并存，还具有全生长季为害的特点。其中①萌芽期为害造成不出苗，缺株；②苗期或分蘖初期为害，幼虫入侵为害生长点后，心叶枯死，形成枯心苗；③生长中期生长点受害，形成梢端枯萎，抽出侧芽，使主茎受抑制而停止生长；④生长中后期受害，致蔗糖分降低可高达4个百分点，如遇大风，常在虫口处折断，形成风折茎，虫伤还常引起甘蔗赤腐病菌侵人，使甘蔗产量和品质受损更大。目前，95%以上采用化学农药进行防治，也在尝试采用性诱剂和寄生蜂防治。目前，在全生长季两次施药的前提下，株虫害率都超过85%，甚至高达98%。2008年3月和2011年7月的调研发现，中国广西最大蔗区广西崇左主栽品种R0C22和云南德宏蔗区主栽品种R0C20因螟虫危害严重，导致宿根头发株率低，宿根产量低，难以进行宿根栽培，大幅度增加了甘蔗生产成本，因为在正常情况下，第一次宿根蔗可比新植增产15-30%，且宿根亩投入成本还比新植低600元以上，此外，正常还可进行第二次宿根。好会30通过转基因技术导入抗螟虫基因，提高抗虫性，实现螟虫控制，是一种公 认的经济、环境友好的策略，抗虫棉等一系列抗虫转基因改良品种，已经在国内外生产上发挥巨大的作用。由于甘蔗是工业原料作物和无性繁殖作物，利用甘蔗生产蔗糖需要经过107°C高温，国家转基因安全委员会认定甘蔗属于转基因安全风险等级最低(I级)的作物，因此，转基因甘蔗有很好的产业化应用前景。由于甘蔗缺乏抗螟虫基因，利用CiTlAc基因导入甘蔗，提高甘蔗对螟虫的抗性，是控制甘蔗螟虫危害的经济、有效的重要策略和技术途径，优良转基因株系培育过程中，需要对转基因群体进行鉴定筛选，后续转基因产品产业化也需要基因成分鉴定技术，因此，急需建立一种快速、准确、灵敏、低成本的转CiylAc基因甘鹿和CiylAc基因成分的检测技术。对转基因产品及其成分的检测，目前主要从核酸水平和蛋白质水平两方面着手。由于蛋白质易受外界环境影响而失活或分解，故ELISA等蛋白质水平的免疫学检测具有局限性。相对而言，核酸的稳定性要高于蛋白质，因此，针对核酸成分的检测技术成为转基因成分检测的首选。而核酸水平的检测方法主要有PCR法、Southern杂交及斑点印迹法等，其中，PCR法因其技术成熟、可快速扩增、特异性强、灵敏度高、对模板纯度要求低等优点而广泛采用，也是目前我国农业部各转基因检测室首选技术，但常规PCR检测方法在目标序列扩增环节需要昂贵的PCR扩增仪，扩增产物的检测与判断需要昂贵的凝胶扫描成像系统，对电泳图片进行采集，而且，电泳检测常用的嵌入显色剂EB属于致癌剂等，对于快速检测和基层如试验站实施检测等存在一定的局限性。恒温扩增技术是一种对目的核苷酸序列扩增可以替代常规基于PCR仪技术。其主要特征是在聚合酶的作用下，针对待检测的靶标基因有关区域，通过设计了 4条特异引物，实现对目的片段的快速、简便和精确扩增，且是在简单的水浴恒温条件下实现扩增，因此，该技术是一种快捷、准确的检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测转基因甘蔗的恒温扩增方法，是针对转cryIAc基因甘鹿和crylAc基因成分的检测需求，以目的基因crylAc基因的核苷酸序列信 息为基础，设计并筛选出特异序列引物，建立的一种检测转基因甘蔗的恒温扩增方法。所述基因是从苏云金芽孢杆菌{Bacillus thuringiensis)中分离并经过偏爱密码子修饰，该基因具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列(I 848 bp)。本发明的一种检测转crylAc基因甘蔗的恒温扩增方法，包括甘蔗模板DNA提取、恒温扩增体系的建立和恒温扩增产物的鉴定，其特征在于
(I)恒温扩增检测引物所使用的检测引物是抗螟虫转基因甘蔗的目的基因的特异检测引物F3、B3、FIP和BIP
引物 F3 为 5’ -AGAGAGTGGGAAGCCGAT _3’ ；
引物 B3 为 5’ -CGAATCCCCACCTTTGCC-3’ ；
引物 FIP 为 5’ -AGGCGCTGTTCATGTCGITGACCTACTAACCCAGCTCTCCG-3’ ；
引物 BIP 为 5’ -TGTCCGTGTACGITCAAGCAGCCAAACACGCTAACGTCTCGA-3’。(2)恒温扩增体系的建立在200 u L离心管中，先加入恒温扩增反应液；所述恒温扩增反应液的组成如下浓度为50 mmol/L MgSO4液I. 5 yL，浓度为10 mmol/L dNTPs液 3. 5 ii L，IOX 扩增缓冲液(ThermoPol Reaction Buffer，购买自 NEB 公司)2. 5 yL，浓度为10 ymol/L的引物FIP和BIP各2.0 yL，浓度为10 y mol/L的引物F3和B3各0. 5U L,0. 75 u L Bst DNA聚合酶，10. 75 y L高压灭菌ddH20，再加入I. 0 U L甘蔗DNA模板，混匀后I 000 g,瞬时离心I s -2 s,开盖并在管盖上点上I. 0 y L浓度为1，000倍的突光染料SYBR Green I，闭盖后置于水浴锅中65° C恒温水浴进行扩增，扩增时间为55 min-60 min。(3)恒温扩增产物的鉴定扩增结束后，将管盖上的染料SYBR Green I与扩增产物混合，待检样品呈明亮的绿色，判定为真实的转基因甘蔗样品。本发明具有以下优点本发明针对抗螟虫转基因甘蔗的外源目的基因的碱基序列，设计了 4条特异性引物，在聚合酶作用下进行链置换扩增反应，特异性高。同时，扩增反应仅需水浴锅与可完成瞬时离心的常温低速离心机就能完成，因此，所需仪器设备简单，比常规PCR技术需要昂贵的凝胶扫描系统和PCR仪(或real-time PCR)等要低很多。扩增成本相对较低且扩增时间短、效率高，目视法颜色反应看结果直观方便。体系建立后，直接以提取的甘蔗基因组DNA作为模板，是一种适用于实验室和田间筛选转基因甘蔗以及进行基因成分检测、跟踪的低成本、快速、灵敏、简单、准确的方法。
图I为转CirJAC基因甘蔗的恒温扩增检测结果。图I中，I为水对照、2为受体甘蔗非转基因阴性对照，I和2都呈现橘黄色；3为阳性质粒对照、4为待检样品，3和4都呈现为明亮的绿色，说明待检样品为转基因甘蔗。图2为转cirJAc基因甘蔗的恒温扩增检测结果。图2中，I为水对照、2为受体甘蔗非转基因阴性对照，I和2都呈现橘黄色；3为阳性质粒对照、4为转ciylAc基因甘蔗阳性对照(即采用real-time PCR和Southern Bloting确认为转基因甘鹿代号为19a_l的样品)、5为待检样品，3、4和5都呈现明亮的绿色；说明待检样品为转基因甘蔗。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。实施例I :一种检测转基因甘蔗的恒温扩增方法，包括以下步骤
I、甘蔗基因组DNA的提取
(1)将待检测的转基因甘蔗无性系16K-2(甘蔗基因型为新台糖22号)的幼嫩叶片，用体积比为75%的乙醇擦拭消毒；
(2)将消毒后的叶片放入经消毒预冷的研钵，加入液氮并充分研磨成幼嫩叶粉末；
(3)取0.5g幼嫩叶粉末装入2 mL离心管A中，加入800 U L 65° C预热的CTAB提取液和100 U L无水乙醇,振荡混勻,65° C温育30 min,离心10 min ；
(4)取上清800u L于离心管B中，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇溶液，混匀，离心5min,取上清700 U L于离心管C中,加入等体积的氯仿和异戍醇溶液,混勻,离心5 min,取上清500 UL于离心管D中，加入1/10体积在4° C冰箱中预冷的NaAc和等体积在-20° C冰箱中预冷的异丙醇，混匀；所述酚、氯仿和异戊醇溶液指体积比为酚氯仿异戊醇=25:24: I ;所述氯仿和异戊醇溶液指体积比为氯仿异戊醇=24:1 ;
(5)在-20°C放置30 min后，离心(12 000 g) 10 min，去上清，用体积比为75%乙醇洗涤沉淀物2次，再用无水乙醇洗涤I次，在超净台吹风干燥10 min后，加入100 y L高压去离子无菌水，溶解并混匀，即为甘蔗基因组DNA样品；
(6)甘蔗基因组DNA样品测定浓度后稀释到100ng/yL，作为恒温扩增的模板；
2、恒温扩增体系的建立
如图I所示，设无菌水对照I、受体甘蔗非转基因对照2、阳性质粒对照3、待检样品4，共4种模板，进行恒温扩增；其中所述阳性质粒指带有外源目的基因CciylAc基因)的表达载体质粒DNA;扩增体系包括24.0 U L的恒温扩增反应液和I. 0 U L模板；所述恒温扩增反应液组成为浓度为50 mmol/L MgSO4液I. 5 u L，浓度为10 mmol/L dNTPs液3. 5 u L，
2.5 u LlOX 扩增缓冲液(ThermoPol Reaction Buffer，购买自 NEB 公司)2. 5 u L，浓度为10 iimol/L的引物FIP和BIP各2. 0 U L，浓度为10 y mol/L的引物F3和B3各0. 5 u L,
0.75 V^L Bst DNA聚合酶，10. 75 U L高压灭菌的ddH20。在装有恒温扩增反应液的200 u L离心管中，加入1.0 UL甘蔗DNA模板，用手轻弹混匀后瞬时离心(I 000 g, Is -2 S)，开盖并在管盖上点上I. 0 ii L浓度为1，000倍的荧光染料SYBR Green I，闭盖后置于水浴锅中65 ° C恒温水浴进行扩增，扩增时间为60 min ；
3、恒温扩增产物的鉴定
扩增结束后，将管盖上的染料SYBR Green I与扩增产物混合结果如图I所示，水对照和受体甘蔗非转基因对照均呈现橘黄色，阳性质粒对照和待检样品均呈现明亮的绿色，说明待检样品为真实的转基因甘蔗。实施例2 :—种检测转基因甘蔗的恒温扩增方法，包括以下步骤
1、甘蔗基因组DNA的提取本实施例中选取转基因甘蔗(甘蔗基因型为福农95-1702)中间试验基地的转基因甘蔗无性系a-2的幼嫩叶片，作为待检测试样，提取方法与步骤与实施例I相同；
2、恒温扩增体系的建立如图2所示，设无菌水对照I、受体甘蔗非转基因对照2、阳性 质粒对照3、转cryiXc基因甘鹿阳性对照4 (即采用real-time PCR和Southern Bloting确认为转基因甘蔗代号为19a-l的样品)、待检样品5，共5种模板，进行恒温扩增；扩增体系包括24. 0 u L的恒温扩增反应液和1.0 u L模板；在装有恒温扩增反应液的200 y L离心管中，加入1.0 UL甘蔗DNA模板，用手轻弹混匀后瞬时离心(I 000 g, Is -2 S)，开盖并在管盖上点上I. 0 ii L浓度为1，000倍的荧光染料SYBR Green I，闭盖后置于水浴锅中65° C恒温水浴进行扩增，扩增时间为60 min ；
3、恒温扩增产物的鉴定扩增结束后，采用离心或重用臂力将管盖上的染料SYBRGreen I甩下，使管盖上的染料SYBR Green I与扩增产物混合结果如图2所示，水对照和受体甘鹿非转基因对照均呈现橘黄色，阳性质粒对照、已确认的转CiylAc基因甘鹿19a-l和待检样品均呈现明亮的绿色，说明待检样品为真实的转基因甘蔗。本发明采用的主要试剂如下(除引物为PAG即聚丙烯酰胺凝胶级纯化外，期于所有化学试剂均为分析纯)
NaAc:浓度为 3. 0 mol/L, 121。C 灭菌 20 min。MgSO4 :浓度为 50 mmol /I,, 121 ° C 灭菌 20 min。酚氯仿异戊醇(体积比为25: 24: I):美国GENERAY BIOTECH公司产品。氯仿异戍醇(体积比为24: I):国药集团化学试剂,用灭菌ddH20配制。异丙醇、无水乙醇、CTAB :国药集团化学试剂有限公司产品。Bst 聚合酶和 10X 扩增缓冲液(ThermoPol Reaction Buffer):美国New EnglandBiolabs (NEB)公司产品。荧光染料SYBR Green I =BioTeke公司产品，用IXTAE稀释到1000X。dNTPs 10 mmol/L，宝生物工程(大连)有限公司(Takara)产品。引物F3、B3、FIP和BIP均委托宝生物工程(大连)有限公司(Takara)合成。本发明所使用的仪器与耗材主要如下
5417C型常温高速离心机德国Eppendorf公司；
Nanovne plus超微量紫外分光光度计美国GENE有限公司；
MP-13H恒温水浴锅上海一横科学仪器有限公司，精度为±0. 1° C ；
Q2-866型涡旋振荡仪和LX-300型迷你离心机海门贝尔仪器制造有限公司；
100-1000 u LU0-100 iiL、0.5-10 yL和 0.1-2.5 ii L移液枪德国 Eppendorf 公司； 200 iiL和10 UL滤芯枪头美国AXYGEN公司产品，且经121° C灭菌20 min处理。
2 mL、l. 5 mL和200 ii L离心管美国AXYGEN公司产品，且经121° C灭菌20 min处理。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.本发明的一种检测转CrylAc基因甘蔗的恒温扩增方法，包括甘蔗模板DNA提取、恒温扩增体系的建立和恒温扩增产物的鉴定，其特征在于 恒温扩增检测引物所使用的检测引物是抗螟虫转基因甘蔗的目的基因的特异检测引物F3、B3、FIP和BIP 引物 F3 为 5’ -AGAGAGTGGGAAGCCGAT _3’ ；引物 B3 为 5’ -CGAATCCCCACCTTTGCC-3’ ；引物 FIP 为 5’ -AGGCGCTGTTCATGTCGTTGACCTACTAACCCAGCTCTCCG-3’ ；引物 BIP 为 5’ -TGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCCAAACACGCTAACGTCTCGA-3’ ； (2)恒温扩增扩增体系的建立在200μ L离心管中，先加入恒温扩增反应液；所述恒温扩增反应液的组成如下浓度为50 mmol/L MgSO4液I. 5 yL，浓度为10 mmol/L dNTPs 液3.5 μ L，IOX扩增缓冲液2. 5 μ L，浓度为10 ymol/L的引物FIP和BIP各2.0 μ L，浓度为10 “11101/1的引物？3和83各0.5 μ L,0. 75 μ L fciDNA聚合酶，10. 75 μ L高压灭菌ddH20,再加入I. O μ L甘鹿模板DNA,混勻后I 000 g, Is -2 s离心,开盖并在管盖上点上I. O μ L浓度为1，000倍的荧光染料SYBR Green I，闭盖后置于水浴锅中65° C恒温水浴进行扩增，扩增时间为55 min -60 min ； (3)恒温扩增产物的鉴定扩增结束后，将管盖上的染料SYBRGreen I与扩增产物混合，待检样品呈明亮的绿色，判定为真实的转基因甘蔗样品。
全文摘要
本发明涉及一种检测转cry1Ac基因甘蔗的恒温扩增方法，包括甘蔗模板DNA提取、恒温扩增体系的建立和恒温扩增产物的鉴定。转cry1Ac基因甘蔗的恒温扩增检测方法针对抗螟虫转基因甘蔗的外源目的基因cry1Ac的碱基序列，设计了4条特异性引物，在Bst聚合酶作用下进行链置换扩增反应，特异性高。同时，扩增反应仅需水浴锅与可完成瞬时离心的常温低速离心机就能完成，因此，所需仪器设备简单，比常规PCR技术需要昂贵的凝胶扫描系统和PCR仪(或real-timePCR)等，扩增成本相对较低且扩增时间短、效率高，目视法颜色反应看结果直观方便。体系建立后，直接以提取的甘蔗基因组DNA作为模板，是一种适用于实验室和田间筛选转cry1Ac基因甘蔗以及进行cry1Ac基因成分检测、跟踪的低成本、快速、灵敏、简单、准确的方法。
文档编号C12Q1/68GK102965436SQ20121046121
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者许莉萍, 郭晋隆, 周定港, 阙友雄, 林庆良, 陈如凯, 高世武 申请人:福建农林大学