专利名称：一种海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法
技术领域：
本发明涉及微藻制氢技术，具体地说是一种海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法。
背景技术：
微藻制氢技术作为应用研究的历史不到30年，涉及的藻种主要是蓝藻和绿藻；蓝藻利用体内的固氮酶产氢，其生物学机制决定了该技术的能量利用率不可能达到10％(参见文献1Carolyn C.Elam.IEA Agreement onthe production and utilization of hydrogen 199941-46；文献2Jun Miyake，Masato Miyake and Yasuo Asada(1999)Biotechnological hydrogen productionresearch for efficient light energy conversion，J.Biotechnology 70，89-111)，因此，国际能源局(IEA)认为该技术没有实际开发价值。绿藻(Platymonassubcordiformis)体内的可逆产氢酶的活性比蓝藻体内的固氮酶的活性大约高1000倍，而且产氢过程不需要ATP，光能利用效率可能达到10％(参见文献1Carolyn C.Elam.IEA Agreement on the production and utilization ofhydrogen 199941-46；文献3John Benemann(1996)Hydrogen biotechnologyprogress and prospects，Nature Biotechnology 14，1101-1103)；绿藻可逆产氢酶直接光解水制氢技术在产生氢气的同时产生氧气，当气相氧分压达到2％时，可逆产氢酶失活，产氢过程停止，不能实现连续大规模制氢。对提高可逆产氢酶耐氧性的研究目前刚刚开始，可逆产氢酶的抗氧活性还没有明显提高(参见文献4Ghirardi et al.Process for selection of oxygen tolerantalgal mutants that produce H2under aerobic conditions，USA Patent5,871,952(2001))；加入除草剂等试剂可以抑制氧气释放，但导致了细胞死亡；通过加入化学试剂消耗掉氧气，或通入惰性气体带走所产生的氢气和氧气，虽然可以获得绿藻连续产氢，但是这些方法也不能实现大规模经济地制造氢气(参见文献5Anastasios Melis et al.，Hydrogen production usinghydrogenase-containing oxygenic photosynthetic organisms，United StatesPatent Application 20010053543(2001))。
美国加州大学伯克利分校的Melis等人于2000年提出了两步法间接光解水制氢工艺，其中第一步是绿藻进行光合作用，固定二氧化碳，释放氧气，获得生物量的积累；第二步是在无硫、厌氧的环境中诱导可逆产氢酶的高表达(利用无硫培养基，在光照下经过24～30小时，使密封的衣藻的光合放氧速度降低到低于呼吸耗氧速度，消耗系统中的氧气，达到厌氧状态，使可逆产氢酶被诱导)，再光照产氢(在40小时开始)，以每升细胞浓度为6×106cells/mL的藻液，每小时产氢1.71mL的速度连续70小时产生氢气120毫升(参见文献6Melis，A.Et al.，(2000)Sustainedphotobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation ofoxygen evolution in the green alga Chlamydomanas reinhardtii，Plant Physiol.122，127-136)。2001年，美国能源部预计该技术最终可能实现制氢成本10$/GJH2的目标，使该技术最终达到市场可接受的生产成本(参见文献7Wade A.Amos，Margaret K.Mann，Pamela L.Spath，Janice M.Lane(2001)Process analysis work for the DOE hydrogen program-2000，Proceedings of the2001 DOE hydrogen program review NREL/CP-570-30535)。
由于Melis等所用的微藻的生长培养基中含硫元素，而可逆产氢酶的诱导和光合产氢阶段都要求无硫的培养基，所以需要对绿藻细胞进行离心收集、用新鲜无硫培养基清洗细胞等多次重复操作，既造成工艺路线长，操作复杂，也使微藻生物量的重复使用困难，使该技术的成本增加；又由于人类可利用的淡水资源有限，如果能利用资源丰富的海水进行微藻生物光解水制氢，该技术将具有更重大的意义。虽然绿藻可逆产氢酶两步法间接光解水制氢具有极大的发展潜力，也取得一定的进展，但是要使该技术要真正进入实用阶段，目前迫切需要解决的技术难点有(1)获得优良的海洋产氢微藻；(2)可逆产氢酶活性的提高；(3)有效抑制光合放氧却不抑制光合产氢；(4)延长产氢时间并实现微藻生物量的循环使用等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法；其采用优良的海洋产氢藻种，应用合理的制氢路线提高绿藻的产氢能力、简化操作过程。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为按常规方式操作，亚心型扁藻进行光合作用，获得生物量的积累，将获得生物量积累后的亚心型扁藻在无氧暗处存放20～45小时进行暗诱导，再光照产氢；所述无氧存放可为简单的密封存放；所述暗诱导最好是在无硫海水中进行，获得了绿藻连续6～8小时的光合放氢；若在天然海水中，经过厌氧暗诱导的藻液在光照下立即释放大量氧气，从而迅速抑制光合产氢过程，该产氢过程仅仅维持1-3小时；所述无硫海水(人工)较佳配方为
每升海水培养基中微量营养盐的量为1.3mg FeCl36H2O，0.36mgMnCl24H2O，33.6mg H3BO3，45.0mg EDTA，20.0mg NaH2PO4H2O，100mg NaNO3，0.21mg ZnCl2，0.20mg CoCl26H2O，0.09mg(NH4)4Mo7O244H2O，0.136mgCuCl2，0.1μg VB12以及1.0μg VB1。
所述扁藻藻液的细胞密度一般为1.0～6.0×106cells/mL；
所述暗诱导也可在天然海水或无硫海水中进行，然后向藻液中加入微摩尔级解偶联剂CCCP或者FCCP(其英文全名CCCPcarbonyl cyanidem-chlorophenylhydrazone；FCCPcarbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenyl)；使其在藻液中的浓度为5～20μM；解偶联剂的使用抑制了光合放氧，又提高了微藻光合产氢速度和产量，加入的浓度在微摩尔级，不会对反应器容量、制氢全过程的操作带来不便；本发明把解偶联剂对绿藻的生理调控作用用于抑制绿藻的光合放氧、提高其光合产氢，使光合放氧完全被抑制，与机械方法和化学方法不同；解偶联剂的使用，使光合放氧被完全抑制，藻液的气液两项都维持在无氧状态，使光合放氢得以持续到6小时，每升细胞浓度为1.0～1.2×106cells/mL的藻液的产氢速度达到每小时0.090～0.108mL。
在暗诱导后还可向藻液中加入质子泵抑制剂DCCD(其英文全名DCCDN，N’-dicyclohexylcarbodiimide)；使其在藻液中的浓度为1～5μM；其中解偶联剂与质子泵抑制剂的联合使用，与不加入CCCP或FCCP比较，使该藻的产氢时间延长了1倍，持续到6小时，产氢量提高79倍，使每升细胞浓度为1.0～1.2×106cells/mL的藻液的产氢速度达到每小时0.234～0.281mL。
本发明具有如下优点1.获得优良的海洋产氢微藻。本发明发现了一种新的产氢海洋藻种，率先提出了一株海洋产氢绿藻亚心型扁藻；其能够利用可逆产氢酶，经过一定的代谢调控手段使其能够光合产氢，使该技术的原料从淡水扩大到海水，极大地丰富了其原料的来源。
2.制氢路线合理，操作过程简单。本发明提出了一种与亚心型扁藻相应的产氢工艺路线，该绿藻首先进行光合作用，释放氧气，固定二氧化碳，积累有机物，获得适合产氢的生物量；然后密封微藻细胞悬浮液，在暗处诱导可逆产氢酶系的活性，再在光照下利用光能释放氢气
3.本发明开发了无硫海水用于诱导可逆产氢酶系的活性和光照产氢，与天然海水比较，无硫海水使其产氢能力提高10倍。
4.能有效抑制光合放氧却不抑制光合产氢。本发明在获得微藻生物量后，仅仅密封在天然海水中的藻液使之与大气隔离就可以进行暗诱导，暗诱导结束后再加入解偶联剂抑制光合放氧、促进光合放氢，使藻液维持厌氧并连续产氢；产氢结束后绿藻能重新进行光合作用、固定二氧化碳，所以本技术容易实现微藻生物量的循环利用；利用解偶联剂，不但使光合放氧与光合放氢解偶联，使微藻只产氢不产氧，而且打破了类囊体膜的跨膜质子梯度，使质子不经过消耗ATP的跨膜运输，使每升细胞浓度为1.0～1.2×106cells/mL的藻液的产氢速度达到每小时0.090～0.108mL；利用解偶联剂和质子泵抑制剂的共同作用，使质子向可逆产氢酶路径转移，使每升细胞浓度为1.0～1.2×106cells/mL的藻液的产氢速度达到每小时0.234～0.281mL，同样细胞数量的产氢速度与Melis等的结果相近。本发明利用同一个反应器实现了暗诱导和光照产氢两个过程。
图1为本发明利用无硫海水培养基在不同暗诱导时间下的产氢曲线图。
图2为本发明解偶联剂对产氢影响的示意图。
图3为本发明解偶联剂与质子泵抑制剂共同作用对产氢影响的示意图。
具体实施例方式
实施例1(利用无硫海水培养基产氢的暗诱导时间的优化)收集对数生长后期的扁藻细胞，用新鲜无硫海水培养基离心洗涤3次，再调整到1.0～1.2×106cells/mL的细胞浓度；取容积为300mL的血浆瓶，内装295mL藻液，用橡皮塞密封瓶口，用输液器的针头与血浆瓶上部空间紧密连接，充氮气5分钟；25℃下，放置到暗处存放不同的时间，利用藻细胞的暗呼吸作用消耗密封在瓶中的氧气，使之达到厌氧状态，并诱导产氢酶的活性，再在160μmol photo m-2s-1的光照和150rpm回旋摇动下光照放氢。输液器软管放入倒置的刻度试管中，利用水封收集并测定气体体积。
结果如图1(无硫海水中暗诱导时间对光合产氢的影响)所示可见，密封的藻液经过不同的暗诱导时间对光合产氢量影响极大。不经过暗诱导的藻液不产生氢气，暗诱导40小时的藻液产生39000纳升的氢气，而暗诱导48小时的藻液也不产生氢气，所以暗诱导时间的优化值为40小时。
实施例2(解偶联剂对产氢的影响)用295mL的扁藻细胞悬浮液作空白实验，其光合产氢延续3小时，产量为6.3μL。经过在天然海水中暗厌氧诱导的藻液，在光照开始前5分钟加入调节剂，结果见图2(DCMU、DCCD、CCCP、DBMIB对产氢的影响)；50μM的DCMU使同样浓度和数量的扁藻细胞产生氢气6.7μL，比空白实验的氢气产量增加6％；2μM的DCCD使其氢气产量为9.9μL，比空白试验的氢气产量增加57％；10μM的CCCP使其产氢过程延续6小时，氢气产量为191μL，为空白试验的30倍；5μM的DBMIB使其氢气产量为1.7μL，为空白试验的27％。解偶联剂大大提高了光合产氢量，而除草剂DCMU或其他光合作用电子传递抑制剂DBMIB都抑制光合产氢。
实施例3(解偶联剂与质子泵抑制剂共同作用对产氢的影响)经过在天然海水中暗厌氧诱导的藻液，在光照开始前5分钟加入调节剂，结果见表1和图3(DCMU、DBMIB、DCCD对加入CCCP的扁藻产氢的影响)。与仅仅使用天然海水进行的微藻光解水产氢对比，解偶联剂单独作用和与质子泵抑制剂共同作用都使产氢时间从3小时延长到6小时。
空白试验中氢气产量为6.3μL，10μM的CCCP和50μM的DCMU共同作用下，同样状态下的等量的扁藻细胞产生氢气2.4μL，为空白试验的0.38；10μM的CCCP和5μM的DBMIB使其氢气产量为10.6μL，为空白试验的1.68倍；10μM的CCCP和2μM的DCCD使产氢延续6小时，其氢气产量为498μL，为空白试验的79倍。
表1 解偶联剂、质子泵抑制剂处理对产氢的影响产氢
权利要求
1.一种海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法，绿藻进行光合作用，获得生物量的积累，其特征在于所述绿藻为亚心型扁藻，将获得生物量积累后的亚心型扁藻在无氧暗处存放20～45小时进行暗诱导，再光照产氢。
2.按照权利要求1所述海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法，其特征在于所述无氧暗处存放是在密封环境中存放。
3.按照权利要求1所述海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法，其特征在于所述暗诱导是在无硫海水或无硫海水中进行。
4.按照权利要求3所述海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法，其特征在于所述每升无硫海水培养基中微量营养盐的量为1.3mg FeCl36H2O，0.36mg MnCl24H2O，33.6mg H3BO3，45.0mg EDTA，20.0mg NaH2PO4H2O，100mg NaNO3，0.21mg ZnCl2，0.20mg CoCl26H2O，0.09mg(NH4)4Mo7O244H2O，0.136mg CuCl2，0.1μg VB12以及1.0μg VB1。
5.按照权利要求1所述海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法，其特征在于所述亚心型扁藻藻液的细胞密度为1.0～6.0×106cells/mL。
6.按照权利要求1所述海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法，其特征在于所述暗诱导在天然海水或无硫海水中进行，然后向藻液中加入微摩尔级解偶联剂CCCP或FCCP。
7.按照权利要求6所述海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法，其特征在于所述加入解偶联剂后，使其在藻液中的浓度为5～20μM。
8.按照权利要求6所述海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法，其特征在于在暗诱导后向藻液中加入质子泵抑制剂DCCD。
9.按照权利要求8所述海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法，其特征在于所述加入质子泵抑制剂后，使其在藻液中的浓度为1～5μM。
全文摘要
本发明涉及微藻制氢技术，具体地说是一种海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法，绿藻进行光合作用，获得生物量的积累，其特征在于所述绿藻为亚心型扁藻，将获得生物量积累后的亚心型扁藻在无氧暗处存放20～45小时进行暗诱导，再光照产氢。本发明优点如下1.获得优良的海洋产氢微藻。2.制氢路线合理，操作过程简单。3.本发明开发了无硫海水用于诱导可逆产氢酶系的活性和光照产氢。4.利用解偶联剂单独作用，或与质子泵抑制剂的共同作用，能有效抑制光合放氧却不抑制光合产氢。
文档编号C12P3/00GK1521262SQ0311098
公开日2004年8月18日 申请日期2003年1月29日 优先权日2003年1月29日
发明者张卫, 管英富, 虞星炬, 金美芳, 邓麦村, 张 卫 申请人:中国科学院大连化学物理研究所