可避免假阴性的空肠弯曲菌恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种空肠弯曲菌的恒温检测引物组、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)，是一种人畜共患病致病菌，其作为一种引起腹泻的主要致病菌是急性肠胃炎最常见的病因之一，严重影响着食品安全。该菌广泛分布于各种动物体内，以禽类为主要带菌者。人类与带菌动物进行密切接触或食用被其污染的食品会导致感染发病，引起急性、自限性胃肠炎，临床症状为腹泻、发热及腹绞痛。
[0003]传统的空肠弯曲菌检测主要通过生化检测方法，由于其培养条件苛刻，培养时易受杂菌干扰，不易生长，容易发生漏检；同时检测过程费力、耗时，常常需要4-7天才能完成。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。
[0004]为了寻求快速、准确、简便、微量的检验方法，国内外学者进行了大量的研宄，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法，并在实践检验中不断取得新进展。
[0005]以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半，灵敏性高和但特异性差；以核酸为基础的PCR技术及恒温扩增技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于空肠弯曲菌检测。但检测样品复杂，因目前检测方法对假阴性的检测结果没有采取监控手段，故存在漏检的可能，但空肠弯曲菌危害严重，漏检造成的危害无法估量，此夕卜，PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种可鉴别假阴性检测结果的快速、高通量且对仪器要求不高的空肠弯曲菌检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。
[0006]本发明在样品管检测的时候同时设立一个内标基因检测管，该内标检测管及检测方法具有以下特点:1)内标基因与实际样品的检测不在同一管中进行检测，2)该内标基因的扩增靶标与样品检测管中的扩增靶标不同，3)内标基因的扩增靶标的核酸浓度在该内标基因的检测线附近，可识别轻微的反应抑制。正常情况下因内标检测管在加入样品提取液的同时加入有低浓度的内标靶标片段，所以内标检测管检测检测结果为阳性，如内标管检测结果为阴性，提示样品提取液中含有抑制因子或其他原因，导致内标检测管不能进行扩增反应，同样样品检测管也可能因抑制因子或其他原因导致不能进行正常扩增检测，造成样品检测管检测结果为假阴性，因此该方法可根据内标管的检测结果辅助判断样品检测结果可能为假阴性结果。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的在于提供一种用于检测空肠弯曲菌的恒温荧光引物组合物。
[0008]本发明的另一个目的在于提供一种空肠弯曲菌的恒温荧光检测试剂盒本发明的另一个目的在于提供一种空肠弯曲菌的恒温荧光检测方法本发明所采取的技术方案是:
用于检测空肠弯曲菌的恒温荧光检测引物组合物，其包含一组检测引物和一组内标引物，其中，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
CJ0-F3:5’ -AATGCACAAATTTGCCTTAT-3’ ；
CJ0-B3:5， -AGCAGCATAAATAGGATCTT-3，；
CJO-FIP:5， -CACCCAAACCCTCTTCAGCACTTGTGGTCATGATGGACAT-3，；
CJO-BIP:5’ -GCGATGATGGCTTCTTCGGAGAGCACTTCCATGACCAC-3’ ；
CJO-LF:5，-TGCAGCAAGCAATAAAGAAGT-3，；
CJO-LB:5’ -AGTATTGAAGTTATTGGAAGGG-3’ ；
所述内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
CJA-F3:5’ -TACATCTTGCTTGGTGCG-3’ ；
CJA-B3:5’ -TCTCAATGCAGTTCTTGTGAA-3’ ；
CJA-FIP:5’ -ACAAGAACTTGAAGCTAGAGGACATCTTGAGTTGCTCCATAAGA-3’ ；
CJA-BIP:5’ -TTTCAAAGCAATACCAGTGTCTACATTAGCGATGTTGGAATTCA-3’ ；
CJA-LoopF:5’ -AGTTGTGCTTGACAATAACGAT-3’ ；
CJA-LoopB:5’ -TGCGTTTATTGGCACAACAT-3’。
[0009]一种空肠弯曲菌的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括如上所述的检测弓I物组和内标引物组。
[0010]作为优选的，所述检测引物组及内标引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为:1_2:4_8:2_4。
[0011]所述的空肠弯曲菌的恒温荧光检测试剂盒中还包括以下成分:(1)反应液；(2)DNA聚合酶；(3)内标靶标片段；(4)阳性对照和阴性对照。
[0012]所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
[0013]所述反应液含有:8mM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液、120mM MgSOjK溶液、三者的体积比是7:4:3。
[0014]所述阳性对照为含有空肠弯曲菌CJO基因片段的T载体克隆，阴性对照为超纯水，内标靶标片段为含有空肠弯曲菌CJA基因片段的T载体克隆。
[0015]一种空肠弯曲菌的恒温荧光检测方法，包括如下步骤:
(1)提取待检样品DNA；
(2)利用权利要求1的恒温荧光检测引物组合物对待检样品DNA进行恒温扩增；
(3)结果判断:将反应管中置于ESE-QuantTube Scanner或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据CJO基因检测结果和内标基因CJA检测结果进行判断:
CJO基因检测结果为阳性内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
CJO基因检测结果为阴性内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；
CJO基因检测结果为阳性内标基因检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
CJO基因检测结果为阴性内标基因检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测。
[0016]恒温扩增的25 μ I 反应体系含有:CJ0-F3 0.2 μ M，CJ0-B3 0.2 μ M，CJO-FIP1.6 μ Μ，CJO-BIP 1.6 μ Μ，CJO-LF 0.8 μΜ, CJO-LB 0.8 μ Μ, CJA-F3 0.2 μ Μ, CJA-B30.2 μ Μ，CJA-FIP 1.6 μ Μ，CJA-BIP 1.6 μ Μ，CJA-LoopF 0.8 μ Μ，CJA-LoopB 0.8 μ Μ，反应液12.5 μ 1，DNA 聚合酶 8U，10 X SYBR Green I 0.5 μ 1，待检样品 2 μ I，内标 2 μ 1，用超纯水补齐到25 μ I。
[0017]恒温扩增的程序为:63?65°C反应30?60min，并在80°C持续2min。
[0018]本发明的有益效果是:
本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高检测的准确性，及时发现检测中的假阴性结果，可有效防止因假阴性检测结果引起各种事故。
[0019](I)快速高效:整个扩增只用30?60min即可完成，扩增产量可达19?10 1CI个拷贝；
(2)操作简便:不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
(3)高特异性:本发明根据空肠弯曲菌CJO基因设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
(4)尚灵敏度:最低检测极限可达到10fg/ μ I ；
(5)鉴定简便:可通过观察扩增曲线判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
[0020]( 6 )提高检测的准确性:本发明的检测试剂盒内含内标基因，可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，有效预防因抑制等原因造成的检测结果为假阴性的情况发生，为目前无法判断检测结果是假阴性结果的情况提供一种新的恒温荧光检测方法，提高检测的准确性。
【附图说明】
[0021]图1空肠弯曲囷内标基因的最低检出限为10 fg/ μ I ；
图2空肠弯曲菌内标基因的最低检出限为10 fg/μ I的复核；
图3空肠弯曲菌CJO基因最低检出限2.4 X 13 CFU/mL ；
图4特异性实验，对单核增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、创伤弧菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、普通变形杆菌、克雷伯氏菌、藤黄微球菌无非特异性扩增；
图5无抑制因子的实际样品检测；
图6有抑制因子的实际样品检测。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0023]实施例1空肠弯曲菌恒温荧光检测试剂盒的建立空肠弯曲菌的恒温荧光检测试剂盒，包括检测引物组、内标引物组、反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和内标。
[0024](I)检测引物组:以空肠弯曲菌CJO基因为靶基因，进行引物的设计，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
CJ0-F3:5’ -AATGCACAAATTTGCCTTAT-3’ (SEQ ID N0.1)；
CJ0-B3:5’ -AGCAGCATAAATAGGATCTT-3’ (SEQ ID N0.2)；
CJO-FIP:5’ -CACCCAAACCCTCTTCAGCACTTGTGGTCATGATGGACAT-3’ (SEQ ID N0.3)；CJO-BIP:5’ -GCGATGATGGCTTCTTCGGAGAGCACTTCCATGACCAC-3’ (SEQ ID N0.4)；CJO-LF:5’ -TGCAGCAAGCAATAAAGAAGT-3’ (SEQ ID N0.5)；
CJO-LB:5’ -AGTATTGAAGTTATTGGAAGGG-3’ (SEQ ID N0.6)；
(2)内标引物组:以空肠弯曲菌CJA基因为内标基因，进行引物的设计，所述内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
CJA-F3:5’ -TACATCTTGCTTGGTGCG-3’ (SEQ ID N0.7)；
CJA-B3:5’ -TCTCAATGCAGTTCTTGTGAA-3’ (SEQ ID N0.8)；
CJA-FIP:5’ -ACAAGAACTTGAAGCTAGAGGACATCTTGAGTTGCTCCATAAGA-3’ (SEQ ID N0.9)；CJA-BIP:5’-TTTCAAAGCAATACCAGTGTCTACATTAGCGATGTTGGAATTCA-3’ (SEQ ID N0.10)；CJA-LoopF:5’ -AGTTGTGCTTGACAATAACGAT-3’ (SEQ ID N0.11)；
CJA-LoopB:5’ -TGCGTTTATTGGCACAACAT-3’ (SEQ ID N0.12)。
[0025](3)反应液:8mM dNTP、10XThermoPol 反应缓冲液、120mM MgSOjK溶液、三者的体积比是?:4:3。
[0026](4)阳性对照为含有空肠弯曲菌CJO基因部分片段的T载体克隆，其制备方法为:以分离鉴定的空肠弯曲菌为模板，利用的CJO外引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2)进行扩增，所得CJO基因扩增片段序列如SEQ ID NO: 13所示，回收该扩增片段，利用常规方法连