一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，通过核酸互补杂交，目标miRNA可以特异性识别与三元探针并形成稳定的三元杂交结构；三元杂交结构中的三元引物沿着三元模板起始链置换扩增反应并产生大量的SDA模板产物；SDA模板产物可以打开双功能发卡探针，最终触发切口酶信号放大反应，循环酶切分子信标，产生级联放大的荧光信号。本发明可以检测低至100fM的miRNA；该检测方法具有超高的特异强，能够很好区分不同错配位置的高度同源序列，从而解决了现有检测方法中由于特异性不强而导致假阳性结果的难题。
【专利说明】—种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于miRNA检测【技术领域】，涉及一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]MiRNA是一类细胞内源性非蛋白编码单链RNA分子，其长度约为18~25个碱基，广泛存在于真核生物中。MiRNA源于胞内miRNA基因的转录，整个过程与其它基因的转录同步，转录产物为由几百个核苷酸组成的pr1-miRNA。Pri_miRNA在核内经过酶切，最终形成带有发夹结构的前体miRNA (pre-miRNA,约为70个碱基)。之后，pre_miRNA会进入细胞质，并被Dicer酶加工为成熟的miRNA。而成熟的miRNA可与信使RNA (mRNA)的非编码区作用，形成基因沉默复合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC)抑制mRNA的蛋白表达。大量研究表明，超过60%的哺乳动物的编码基因都受到miRNA的调控。miRNA在细胞的增殖、凋亡、分化以及肿瘤的发病机制中扮演着重要的调控作用，细胞miRNA的表达水平与人类疾病特别是癌症的发生、转移密切相关，可以作为标志物用于一些癌症的早期诊断。
[0003]由于大部分miRNA分子在细胞内的表达程度比较低、存在多种相似程度极高的同源序列、序列过短等特点，发展高选择性、高灵敏度、简单、快速的miRNA检测方法显得尤为重要。目前，miRNA的检测方法仍然以传统方法包括Northern印迹法、原位杂交法以及基因芯片技术为主，其中Northern印迹法作为miRNA检测的标准方法被广泛应用。然而，这些检测方法的灵敏度较低，选择性一般，需要多步、耗时反应，洗涤过程繁杂，样品需求量大。近来，多种基于核酸扩增技术的miRNA检测方法陆续发展起来，如RT-PCR、RCA、EXPAR等。其中，RT-PCR是研究最多、应用最广的检测方法。该方法首先通过特殊引物对miRNA进行反转录反应，得到响应的cDNA ;在以cDNA为模板进行实时荧光PCR，实现信号的指数扩增。该方法灵敏度高，同时能区分单碱基错配的同源序列。然而，该方法需要设计复杂的引物，还需要对miRNA进行反转录反应；更为重要的是，PCR需要使用昂贵的热循环仪器。相对于RT-PCR，基于RCA、EXPAR等恒温扩增技术发展起来的检测方法更简单、更直接。然而这些方法存在强烈的非特异性扩增信号，选择性较差或者耗时长等缺点。因此，发展一种简单、直接、快速、高灵敏、高选择性的miRNA检测方法依旧是一个挑战。
【发明内容】
[0004]本发明解决的问题在于提供一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，以克服现有技术选择性不高、设计复杂、耗时长等缺点。
[0005]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0006]一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，包括:
[0007]能够与miRNA形成三元杂交结构的组合物，包括3_WJ引物和3_WJ模板，3-ffJ弓丨物由两部分序列组成:其5’端部分与目的miRNA3’端部分互补，3’端部分与3-WJ模板的中间段互补；3-WJ模板由三部分序列组成:其5’端部分与目的miRNA5’端部分互补，中间段与3-WJ引物3’端部分互补，其3’端部分为含核酸切口酶识别位点的SDA模板区域；
[0008]扩增底物，包括dNTPs混合物；
[0009]DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；SDA模板与目的miRNA杂交后触发DNA分子机器工具，产生SDA模板产物；
[0010]具有发卡结构的发卡分子H，能够与SDA模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构；
[0011]具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子H相互补的序列；
[0012]以及DNA分子机器扩增反应缓冲液。
[0013]所述3-WJ引物与3-WJ模板有5~7个碱基的互补，3_WJ引物:3_WJ模板的摩尔比为1:1;
[0014]发卡分子H与SDA模板产物互补，也与分子信标探针互补，该互补序列中含有Nt.BbvCI的酶切位点；发卡探针与分子信标的摩尔比为1:5 ;
[0015]DNA聚合酶与核酸切口酶的浓度为2.5U和0.8U。
[0016]所述反应缓冲液为:50mMNaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA,pH7.9 ;反应体积为20 μ L，反应温度为37°C，反应时间为30min。 [0017]所述的3WJ-模板的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示；
[0018]3WJ-引物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示；
[0019]SDA模板产物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.3所示；
[0020]发卡分子H的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.4所示；
[0021]分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示，其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。
[0022]一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测方法，包括以下步骤:
[0023]I)通过核酸互补杂交，目标miRNA特异性识别3_WJ引物、3_WJ模板并形成稳定的三元杂交结构；
[0024]2)将三元杂交结构与扩增底物、DNA分子机器工具、具有发卡结构的发卡分子H、分子信标探针以及DNA分子机器扩增反应缓冲液混合；
[0025]3)在三元杂交结构存在的情况下，DNA聚合酶识别3_WJ引物与3_WJ模板的SDA模板区域形成的扩增起始位置，并进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，产生SDA产物，而三元杂交结构中的SDA模板区域继续被扩增；
[0026]4)扩增所获得的SDA产物触发打开发卡分子H构成杂交体，发卡结构H被打开后，暴露出的与分子信标互补的区域，从而破坏分子信标的莖环结构，分子信标与杂交体构成双链结构，其荧光恢复；而分子信标参与形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，而SDA产物与发卡分子H构成的杂交体再打开新的分子信标，以产生更多的突光信号；
[0027]5)待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中miRNA的含量，在一定范围内，miRNA浓度越高，则荧光信号越强。[0028]所述3-WJ引物与3-WJ模板有5~7个碱基的互补，3_WJ引物:3_WJ模板的摩尔比为1:1;
[0029]发卡分子H与SDA模板产物互补，也与分子信标探针互补，该互补序列中含有Nt.BbvCI的酶切位点；发卡探针与分子信标的摩尔比为1:5 ;
[0030]DNA聚合酶与核酸切口酶的浓度为2.5U和0.8U ；
[0031]所述反应缓冲液为:50mMNaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA,pH7.9 ;反应体积为20 μ L，反应温度为37°C，反应时间为30min。
[0032]所述SDA产物与发卡结构有18个bp的互补序列，可以在37°C相互杂交从而打开发卡结构。
[0033]所述SDA模板区域中含有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列3’ -GGAGTCG-5’ ；为了防止发卡分子H自身3’端的非特异性扩增影响单链触发的效率，发卡分子H的3’端修饰有磷酸基团。
[0034]所述发卡分子H的序列含有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列3’ -GGAGTCG-5’，发卡分子H没有被打开时，发卡分子H和分子信标均是茎环结构不发生作用；当发卡被打开后有12个bp与分子信标互补形成双链并且被Nt.BbvCI识别切断，切断的两段分子信标均不能够在37°C下和发卡分子H形成稳定的双链结构而和发卡分子H分开，被打开的发卡分子H能够循环的打开多个分子信标，使荧光信号放大。
[0035]所述检测中的反应温度为37°C，反应时间为30分钟。
[0036]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0037]1.本发明提供的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，采用一步法操作，只需要一步操作就可以完成酶协同级联恒温扩增反应；
[0038]2.本发明提供的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，具有超高的选择性，经试验验证可以很好地区分同族的各种错配序列；
[0039]3.本发明提供的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，具有高灵敏度，级联扩增的设计，可以提高灵敏度到IOOfM;
[0040]4.本发明提供的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，设计简单，不需要涉及纳米材料的合成和修饰等，反应快速，只需要30分钟；
[0041 ] 5.与传统的Northern印迹分析方法相比，本发明提供的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，上样量很少，可以实现微量操作，尤其有利于检测物中miRNA含量很少的情况，具有很高的适用范围；
[0042]6.与实时定量PCR相比，本发明提供的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，由于采用的恒温反应，无需使用昂贵的热循环仪，应用范围更广泛；
[0043]7.本发明提供的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，具有通用性强，可以用于检测所有物种的miRNA，包括3’末端甲基化的miRNA ;并且只需改变三元探针的序列而无需改变发卡探针及分子信标即可检测其他序列的miRNA，方便、价廉。尤其是还能检测到肿瘤细胞中miRNA的表达水平，结果与商品化miRNA试剂盒相一致；甚至可以检测各种修饰的miRNA序列，如3’末端2_0_甲基化修饰。
【专利附图】
【附图说明】[0044]图1为本发明的方法流程示意图；
[0045]图2为miRNA，3WJ-引物和3WJ-模板形成稳定的三元杂交结构的检测；
[0046]图3为3-WJ引物长度对检测方法的影响；
[0047]图4为优化3-WJ弓丨物与3-WJ模板的摩尔比；
[0048]图5为是不同分析时间对检测信号的影响；
[0049]图6为是不同目标miRNA (let_7b)响应的荧光光谱；
[0050]图7为表示各种同源序列对检测方法的干扰。
【具体实施方式】
[0051]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0052]本发明提供的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，是一种基于三元杂交结构和DNA聚合酶-切口酶协同级联恒温扩增策略(PONDA)的荧光miRNA检测。参见图1，本发明通过核酸互补杂交，目标miRNA可以特异性识别与三元探针(引物和模板)并形成稳定的三元杂交结构；三元杂交结构中的三元引物沿着三元模板起始链置换扩增反应并产生大量的SDA模板产物(单链DNA) ；SDA模板产物可以打开双功能发卡探针，最终触发切口酶信号放大反应，循环酶切分子信标，产生级联放大的荧光信号。
[0053]本发明可以检测低至IOOfM的miRNA ;该检测方法具有超高的特异强，能够很好区分不同错配位置的高度同源序列，从而解决了现有检测方法中由于特异性不强而导致假阳性结果的难题。
[0054]本发明提供的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，包括:
[0055]能够与miRNA形成三元杂交结构的组合物，通过核酸互补杂交，目标miRNA可以特异性识别与3-WJ引物和3-WJ模板)并形成稳定的3-WJ杂交结构；
[0056]3-WJ引物和3-WJ模板，3-WJ引物由两部分序列组成:其5’端部分与目的miRNA3’端部分互补，3’端部分与3-WJ模板的中间段互补；3-WJ模板由三部分序列组成:其5’端部分与目的miRNA5’端部分互补，中间段与3-WJ引物3’端部分互补，其3’端部分为含核酸切口酶识别位点的SDA模板区域；
[0057]具体的如图2所示，图A为只有3WJ-弓丨物和3WJ-模板时的溶解曲线，Tm=33.89°C，图B为加入目的miRNA(Let-7b)后，miRNA，3WJ-引物和3WJ-模板的溶解曲线，Tm=40.93°C。由于反应温度是37°C，该组图证明了只有在miRNA存在的时候，miRNA, 3WJ-弓丨物和3WJ-模板才能形成稳定的三元杂交结构。
[0058]扩增底物，包括dNTPs混合物；
[0059]DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；SDA模板与目的miRNA杂交后触发DNA分子机器工具，产生SDA模板产物；具体为3-WJ杂交结构中的3-WJ引物沿着3-WJ模板起始链置换扩增反应并被切割产生大量的SDA模板产物；SDA模板产物可以打开双功能发卡探针，最终触发切口酶信号放大反应，循环酶切分子信标，产生级联放大的荧光信号；
[0060]具有发卡结构的发卡分子H，能够与SDA模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构；[0061]具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子H相互补的序列；
[0062]以及DNA分子机器扩增反应缓冲液。
[0063]具体的给出以下实施例:
[0064]特异性识别目标miRNA的3_WJ引物和3_WJ模板，用于协同级联恒温扩增策略的探针包括双功能发卡探针和分子信标，而DNA聚合酶为Klenow Fragment,核酸切口酶为Nt.BbvCI ；
[0065]3-WJ引物有两部分序列组成:一部分(12个碱基)与模板miRNA互补，另一部分(5-7个碱基)与3-WJ模板互补；而3-WJ模板除了与3-WJ引物互补的一段之外，还含有识别目标miRNA的序列(10个碱基)和扩增区域(含有Nt.BbvCI酶切位点)；
[0066]3-WJ引物与3-WJ模板互补碱基为6个时，效果最佳；3_WJ引物:3_WJ模板的最优摩尔比为1:1 (IOnM:10nM);发卡探针与链置换扩增产物互补，也与分子信标互补，该互补序列中含有Nt.BbvCI的酶切位点；发卡探针与分子信标的最优摩尔比为1:5 ；KlenowFragment聚合酶与Nt.BbvCI切口酶的最优浓度为2.5个单位和0.8个单位。
[0067]所述反应缓冲液为:50mMNaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA,pH7.9 ;反应体积为20 μ L，反应温度为37°C，反应时间为30min。
[0068]具体的针对Let_7b进行的检测用序列设计如下:
[0069]3WJ-模板的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示；
[0070]3WJ-引物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示；
[0071 ] SDA模板产物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.3所示；
[0072]发卡分子H的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.4所示；
[0073]分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示，其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。
[0074]基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测方法，包括以下步骤:
[0075]I)通过核酸互补杂交，目标miRNA特异性识别3_WJ引物、3_WJ模板并形成稳定的三元杂交结构；
[0076]2)将三元杂交结构与扩增底物、DNA分子机器工具、具有发卡结构的发卡分子H、分子信标探针以及DNA分子机器扩增反应缓冲液混合；
[0077]3)在三元杂交结构存在的情况下，DNA聚合酶识别3_WJ引物与3_WJ模板的SDA模板区域形成的扩增起始位置，并进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，产生SDA产物，而三元杂交结构中的SDA模板区域继续被扩增；
[0078]4)扩增所获得的SDA产物触发打开发卡分子H构成杂交体，发卡结构H被打开后，暴露出的与分子信标互补的区域，从而破坏分子信标的莖环结构，分子信标与杂交体构成双链结构，其荧光恢复；而分子信标参与形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，而SDA产物与发卡分子H构成的杂交体再打开新的分子信标，以产生更多的突光信号；
[0079]5)待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中miRNA的含量，在一定范围内，miRNA浓度越高，则荧光信号越强。
[0080]所提供的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测方法，包括以下步骤:
[0081]加入目标miRNA，其可与3_WJ引物和模板形成稳定的3_WJ杂交结构；之后，在酶和dNTPs的存在下，3-WJ引物沿着3-WJ模板进行链置换扩增反应，产生数以千计的单链产物；该单链产物可以与发卡探针互补杂交，并将其打开；发卡探针被打开之后，可以与分子信标杂交形成DNA复合物，包含有切口酶的识别位点，并被Nt.BbvCI酶切；该酶切反应导致荧光基团和淬灭基团分开，产生荧光信号，同时将发卡探针释放出来；该游离存在的发卡探针又可结合另一个分子信标，进行下一轮的酶切反应；如此循环，最初每分子的目标miRNA可以触发放大的荧光信号。
[0082]在上述基础上进行优化，包括3-WJ引物长度对检测方法的影响，如图2所示；优化3-WJ引物与3-WJ模板的摩尔比，如图3所示；优化反应时间，如图4所示；优化结果如下:
[0083]其中，3-WJ引物有两部分序列组成:一部分(12个碱基)与模板miRNA互补，另一部分(5-7个碱基)与3-WJ模板互补；
[0084]而3-WJ模板除了与3-WJ弓丨物互补的一段之外，还含有识别目标miRNA的序列(10个碱基)和扩增区域(含有Nt.BbvCI酶切位点)；
[0085]3-WJ引物与3-WJ模板互补碱基为6个时，效果最佳；3_WJ引物:3_WJ模板的最优摩尔比为 1:1 (IOnM:10nM)；
[0086]双功能发卡探针与链置换扩增产物互补，也与分子信标互补，该互补序列中含有Nt.BbvCI的酶切位点； 发卡探针与分子信标的最优摩尔比为1:5 (50nM:250nM)；
[0087]Klenow Fragment聚合酶与Nt.BbvCI切口酶的最优浓度为2.5个单位和0.8个单位；检测反应缓冲液:50mM NaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA, pH7.9 ;反应温度为37°C，最优时间为30分钟。
[0088]SDA产物与发卡结构有18个bp的互补序列，可以在37°C相互杂交从而打开发卡结构。
[0089]SDA模板区域中含有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列3’ -GGAGTCG-5’ ；为了防止发卡分子H自身3’端的非特异性扩增影响单链触发的效率，发卡分子H的3’端修饰有磷酸基团。
[0090]发卡分子H的序列含有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列3’ -GGAGTCG-5’，发卡分子H没有被打开时，发卡分子H和分子信标均是茎环结构不发生作用；当发卡被打开后有12个bp与分子信标互补形成双链并且被Nt.BbvCI识别切断，切断的两段分子信标均不能够在37°C下和发卡分子H形成稳定的双链结构而和发卡分子H分开，被打开的发卡分子H能够循环的打开多个分子信标，使荧光信号放大。
[0091]待反应完成后，利用荧光分光光度计检测荧光信号的强度，根据荧光信号的检测结果与目标miRNA的浓度来绘制标准曲线，如图6所示，其中，横坐标为miRNA的浓度，纵坐标为为荧光强度；所述的标准曲线表示为Y=0.701X+5.229，Y表示荧光强度(X 105)，X表示miRNA浓度取以10为底的对数。
[0092]为了验证本发明检测的特异性，将let_7b的其他同族序列进行验证，结果如图7所示，可以看出被检测的let-7b结果非常明显，与其他相比具有显著的区别，因此本发明的检测试剂盒、检测方法具有针对miRNA的特异性。
【权利要求】
1.一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，其特征在于，包括: 能够与miRNA形成三元杂交结构的组合物，包括3-WJ引物和3-WJ模板，3-WJ引物由两部分序列组成:其5’端部分与目的miRNA3’端部分互补，3’端部分与3-WJ模板的中间段互补；3_WJ模板由三部分序列组成:其5’端部分与目的miRNA5’端部分互补，中间段与3-WJ引物3’端部分互补，其3’端部分为含核酸切口酶识别位点的SDA模板区域； 扩增底物，包括dNTPs混合物； DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；SDA模板与目的miRNA杂交后触发DNA分子机器工具，产生SDA模板产物； 具有发卡结构的发卡分子H，能够与SDA模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构； 具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子H相互补的序列； 以及DNA分子机器扩增反应缓冲液。
2.如权利要求1所述的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，其特征在于，所述3-WJ引物与3-WJ模板有5~7个碱基的互补，3-WJ引物:3-WJ模板的摩尔比为1:1 ; 发卡分子H与SDA模板产物互补，也与分子信标探针互补,该互补序列中含有Nt.BbvCI的酶切位点；发卡探针与分子信标的摩尔比为1:5 ; DNA聚合酶与核酸切口酶的浓度为2.5U和0.8U。
3.如权利要求1所述的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液为:50mM NaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA，pH7.9 ;反应体积为20 μ L，反应温度为37°C，反应时间为30min。
4.如权利要求1或2所述的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的3WJ-模板的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示； 3WJ-引物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示； SDA模板产物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.3所示； 发卡分子H的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.4所示； 分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示，其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。
5.一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)通过核酸互补杂交，目标miRNA特异性识别3-WJ引物、3-WJ模板并形成稳定的三元杂父结构； 2)将三元杂交结构与扩增底物、DNA分子机器工具、具有发卡结构的发卡分子H、分子信标探针以及DNA分子机器扩增反应缓冲液混合； 3)在三元杂交结构存在的情况下，DNA聚合酶识别3-WJ引物与3-WJ模板的SDA模板区域形成的扩增起始位置，并进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，产生SDA产物，而三元杂交结构中的SDA模板区域继续被扩增； 4)扩增所获得的SDA产物触发打开发卡分子H构成杂交体，发卡结构H被打开后，暴露出的与分子信标互补的区域，从而破坏分子信标的莖环结构，分子信标与杂交体构成双链结构，其荧光恢复；而分子信标参与形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，而SDA产物与发卡分子H构成的杂交体再打开新的分子信标，以产生更多的突光信号； 5)待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中miRNA的含量，在一定范围内，miRNA浓度越高，则荧光信号越强。
6.如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的miRNA检测方法，其特征在于，所述3-WJ引物与3-WJ模板有5~7个碱基的互补，3-WJ引物:3-WJ模板的摩尔比为1:1 ; 发卡分子H与SDA模板产物互补，也与分子信标探针互补,该互补序列中含有Nt.BbvCI的酶切位点；发卡探针与分子信标的摩尔比为1:5 ; DNA聚合酶与核酸切口酶的浓度为2.5U和0.8U ；
所述反应缓冲液为:50mM NaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA，pH7.9 ;反应体积为20 μ L，反应温度为37°C，反应时间为30min。
7.如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的miRNA检测方法，其特征在于，SDA产物与发卡结构有18个bp的互补序列，可以在37°C相互杂交从而打开发卡结构。
8.如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的miRNA检测方法，其特征在于，SDA模板区域中含有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列3’ -GGAGTCG-5’;为了防止发卡分子H自身3’端的非特异 性扩增影响单链触发的效率，发卡分子H的3’端修饰有磷酸基团。
9.如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的miRNA检测方法，其特征在于，发卡分子H的序列含有Nt.BbvCI识别双链中不被切割的单链序列3’ -GGAGTCG-5’，发卡分子H没有被打开时，发卡分子H和分子信标均是茎环结构不发生作用；当发卡被打开后有12个bp与分子信标互补形成双链并且被Nt.BbvCI识别切断，切断的两段分子信标均不能够在37°C下和发卡分子H形成稳定的双链结构而和发卡分子H分开,被打开的发卡分子H能够循环的打开多个分子信标，使荧光信号放大。
10.如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的miRNA检测方法，其特征在于，检测中的反应温度为37°C，反应时间为30分钟。
【文档编号】C12Q1/68GK103789435SQ201410043512
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月29日 优先权日:2014年1月29日
【发明者】赵永席, 陈锋, 张青, 田苗, 赵越, 林曼丽 申请人:西安交通大学