一种腺病毒实时荧光定量pcr试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物技术领域中的PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链反应） 试剂盒，尤其涉及一种腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒。
[0003]
【背景技术】
[0004]腺病毒（Adenovirus，ADV)是导致免疫抑制个体发病率和死亡率的主要诱因。腺 病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可 感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临 床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。此前病毒分离与鉴定的方法主要为：病毒 的分离培养，标本应尽早从感染部位采集。采集患者咽喉、眼分泌物，粪便和尿液等，加抗 生素处理过夜，离心取上清接种敏感细胞（293、Ifep-2或HeLa细胞等)，37°C孵育后可观察 到典型CPE，即细胞变圆、团聚、有拉丝现象，最突出的表现是许多病变细胞聚在一起呈葡萄 串状。病毒抗原抗体鉴定，用荧光标记的抗六邻体抗体与分离培养细胞作用来鉴定腺病毒， 也可用血凝抑制（hemoagglutinationinhibition，HI)试验或中和试验（neutralization test，NT)检测属和组特异性抗原并鉴定病毒的血清型。
[0005] 上述所述检测病毒的方法在一定程度上是有效的，但是它们也有不足的地方，如 病毒的分离培养，是需要耗费大量人力、物力和时间的，抗体检测对一些临床样本缺乏足够 的灵敏度，有时不能判定出一些正常个体中的潜伏感染。一种更有效快速准确的检测技术， 实时荧光定量PCR技术对ADV进行检测，取病变组织或细胞，提取病毒DNA，与标记的病毒 DNA探针和引物进行杂交来判断是否被感染。这种方法的优点体现在高灵敏度、高准确性和 高速率，在应对病毒大爆发流行时能为医院等单位在面临大堆的临床样本时提供更加快速 精确的检测，及时对疫情的加以控制和对流行病学调查作出巨大的贡献。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种腺病毒实时荧光 定量PCR试剂盒。
[0008]本发明的目的是这样实现的： 1、腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒(简称试剂盒） 本试剂盒是在对腺病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性 引物和一条特异性的荧光探针，利用实时荧光定量PCR技术对腺病毒进行检测。此技术不 仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。
[0009]在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核酸进行 PCR扩增，来实现对腺病毒的检测。
[0010] 具体地说，本试剂盒包括腺病毒的一对特异性引物（F和R)、一条特异性荧光探针 (FP)、阳性对照、阴性对照、5XPCRBuffer和EnzymeMix; ① 特异性引物 F:5'-AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3' 25bp, R:5'-GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3' 27bp； ② 荧光探针 FP：Cy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2 30bp， 荧光探针5'端标记荧光报告基团Cy5,3'端标记荧光淬灭基团BHQ-2 ; ③ 阳性对照 腺病毒标准品； ④ 阴性对照 RNaseFreeH20 ； ⑤ 5XPCRBuffer配制 Tris ?Cl 20mM KC1 80mM (NH4)2S04 80mM DTT 1. 5mM MgCl2 12mM dNTP lOmM 配置混合后于冰箱_20°C保存； ⑥EnzymeMix配制 Tris ?Cl 20mM KC1 80mM DTT ImM EDTA 0.ImM NonidetP-40 0. 5% Tween20 0.5% 甘油 50% Taq酶 2.5U/ul 配置混合后于冰箱_20°C保存。
[0011] 2、试剂盒的使用方法 ①病毒核酸的提取： A、 首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇； 在漂洗液中加入30μg/mlcarrierRNA; B、 取30y1蛋白酶放入1. 5ml离心管中； C、 将标本(如咽拭子等）取200y1加入此管中，充分混匀； D、 再在每管分别加入200y1漂洗液(含30yg/mlcarrierRNA)，混匀振荡30s，70°C 温育lOmin; E、 加入250y1无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min; F、 将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心lmin，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回 收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液； G、 滤柱中加入500y1缓冲液1，12000rpm，离心lmin，弃收集管中的离心液； H、 另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入 500y1缓冲液2,12000rpm，离心lmin，重复步骤⑧一次； I、 将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37°C15min 以干燥滤膜； J、 将滤柱放在1. 5mlEppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase_freeH20,室温静置 2min。12OOOrpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。
[0012] ②实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系） 取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul实时荧光定量PCR反应液至八联管中进行荧 光定量PCR扩增。
[0013]A、实时荧光定量PCR反应液(mix)的配制： 5xPCR buffer 8ul Enzyme Mix 5ul 特异性引物F和R 各lul 特异性荧光探针FP 2ul Rnase Free H20 3ul 反应液体积： 20ul B、一步实时荧光定量PCR反应程序： X: 95°C 2min Z 95°c15s # 64°C 30s 60°Clmin ：FGoto% ,45cycles 步骤f从64°C开始开始荧光检测。
[0014] c、检测仪器： 本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪，在FAM通道进行检测。
[0015] D、结果判断： 在荧光定量PCR仪运转正常，阴性对照和阳性对照均正常的情况下， (1) 当Ct< 35时，判断样品为腺病毒阳性； (2) 当35〈Ct< 40时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于 35就判断样品为腺病毒阳性，否则判断样品为腺病毒阴性。
[0016] (3)当Ct>40时，判断样品为腺病毒阴性。
[0017] 本发明具有下列优点和积极效果： ① 检测时间周期短、检测效率高； ② 检测病毒特异性高，准确率高； ③ 在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析； ④ 检测灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法灵敏度高； ⑤ 操作简单、易于推广； ⑥ 实验结果重复性好。
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【附图说明】
[0019] 图1是30份ADV阳性标本荧光定量PCR扩增曲线； 图2是18份ADV阳性标本荧光定量PCR扩增曲线。
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【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图和实施