基于检测外周血线粒体dna氧化损伤评价体内氧化应激的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子诊断技术领域。具体地说，本发明提供了检测外周血线粒体DNA 氧化损伤的试剂在制备评价体内氧化应激的试剂中的应用，以及基于检测外周血线粒体 DNA氧化损伤评价体内氧化应激的方法。
【背景技术】
[0002]氧化应激，指机体活性氧（reactive oxygen species，R0S)或活性氮（reactive nitrogen species，RNS)产生过多和/或机体抗氧化能力减弱，R0S或RNS清除不足，导致 体内R0S或RNS增多，破坏了机体的氧化/还原的正常失衡，从而导致组织和细胞发生氧化 损伤的病理过程。因此，评价体内氧化应激在疾病诊断和相关科学研宄中（如氧化应激与 衰老、神经退行性变、代谢性疾病等的相关研宄）均有重要意义。
[0003] 目前，对于氧化应激水平的评价体系主要包括检测以下生物分子：1)活性氧/ 活性氮修饰的生物分子：包括蛋白质氧化损伤标志物，如蛋白质羰基化、硝基化损伤、晚 期氧化蛋白产物（A0PP);脂质过氧化产物，如4-羟基壬烯醛（HNE)和丙二醛（MDA)，以 及核酸氧化损伤时产生的8_0HdG;2)抗氧化酶活性，如超氧化物岐化酶（superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶（catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷脫甘肽 S 转移酶酶（glutathione S-transferase，GST)和血红素 氧化酶（heme oxygenase，H0)等。目前常用检测方法主要包括，1)用分光光度法检测MDA、 S0D、CAT、还原型/氧化型GSH、GPx等，方法简单，且相对便宜，但稳定性差；2)利用ELISA 检测MDA、HNE、8-OHdG等，该法比较可靠，费用相对较高。此外，利用高效液相色谱-电化学 (HPLC-ECD)法、气质联用（GC-MS)等可用于8-OHdG水平的检测，但由于需要相关仪器，且操 作繁琐、灵敏度低等缺点，难于推广和应用。
【发明内容】
[0004] 在对外周血的分子诊断研宄中，认为外周血循环的核酸成分可成为反映疾 病状态较好的指标。外周血包括血浆和血细胞（红细胞、粒细胞、淋巴细胞、单核细 胞、血小板等）。外周血中淋巴细胞的基因组DNA的氧化损伤，如8-羟基脱氧鸟苷 (8-hydroxydeoxygumlosine，8-〇HdG)/ 8_羟基鸟嗓呤（8-〇x〇-guanine，8_ox〇-G)的产 生或者DNA链的断裂，已被应用于评价氧化应激状态。与核基因组DNA相似，线粒体 DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)也存在类似的损伤。
[0005] mtDNA位于细胞线粒体内，为环状双链、多拷贝的DNA。人类完整的mtDNA为闭合 环状双链DNA，长16569bp，编码37个基因。线粒体独立存在于细胞核外的细胞器，是细胞 能量和R0S产生的主要场所。由于mtDNA暴露于高活性R0S环境中，且缺乏组蛋白保护和 有效的修复机制，mtDNA更易遭受氧化攻击而产生氧化损伤，进一步导致DNA突变，其突变 率为核DNA的20倍。本专利基于mtDNA易氧化损伤的特点，通过分析细胞内、外mtDNA损 伤水平来更灵敏的反映氧化应激状态，并将该方法应用于代谢综合征患者和健康对照外周 血单个核细胞、血浆mtDNA氧化损伤水平的检测。
[0006] 首先利用 8_ 氧化鸟嗓呤 DNA 糖基化酶（human oxoguanine glycosylase 1， hOGGl)在体外酶解DNA，该酶在体内为参与DNA碱基切除修复的关键酶，能特异性识别并切 除DNA双链中8-OHdG，产生脱嘌呤（AP)位点，进而经碱基切除修复机制恢复正常G:C碱基 配对。在体外，hOGGl酶去除DNA分子上的8-OHdG后，通过设计引物，利用荧光定量PCR特 异性扩增mtDNA。由于mtDNA分子经hOGGl酶切后产生缺碱基位点，与未酶切的mtDNA存在 扩增的差异，结果上表现为Ct的差异，Ct差值（A Ct值）即反映mtDNA氧化损伤水平。
[0007] 在专利的效果评价中，利用不同浓度H202建立氧化应激细胞模型，用线粒体靶向 性抗氧化剂Mitoquinone (MitoQ)构建抗氧化细胞模型。H202作用细胞引起氧化应激是较为 常用的方法，本专利使用中低浓度（50-200 yM)H202。MitoQ是一种亲脂性的带正电荷的醌 醇类物质，可穿过细胞脂质双分子层直接进入带负电荷的线粒体，降低线粒体R0S的产生， 抑制线粒体膜电位的下降以及细胞色素C的释放，具有线粒体保护作用
[0008] 一方面，本发明提供了检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂在制备评价体内氧 化应激的试剂中的应用。
[0009] 进一步地，其中所述检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂为PCR引物和人8-氧 化鸟嘌呤DNA糖基化酶（hOGGl)。
[0010] 再进一步地，其中PCR引物为选自下列引物对的引物对：
[0011]DLP1 :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)；
[0012] C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC (SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)；
[0013]ND1：正向弓丨物 CCTAATGCTTACCGAACGAA (SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
[0014] 进一步地，选择PCR引物：
[0015] DLP1 :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)〇
[0016]另一方面，本发明提供了基于检测外周血线粒体DNA氧化损伤来评价体内氧化应 激的非诊断方法，步骤包括：
[0017] (1)提取样本 DNA;
[0018] (2)使用hOGGl处理部分DNA ;
[0019] (3)使用hOGGl处理过和未处理过的DNA进行qPCR反应；
[0020] (4)比较hOGGl处理过和未处理过的DNA的Ct值差异；
[0021] (5)根据Ct值差异，判断8-羟基脱氧鸟苷（8-OH-dG)的含量，并间接反映DNA氧 化损伤和体内氧化应激的水平。
[0022] 进一步地，其中步骤（3)的qPCR反应中使用的引物选自下列引物对：
[0023]DLP1 :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)；
[0024]C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC(SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)；
[0025] ND1 ：正向弓丨物 CCTAATGCTTACCGAACGAA (SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
[0026] 再进一步地，其中步骤（3)的qPCR反应中使用的引物为：DLP1:正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID N0.1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTAITTA(SEQ ID N0.2)。
【附图说明】
[0027] 图1 :荧光显微镜观察氧化应激和抗氧化应激细胞模型DCFH-DA荧光强度。
[0028] 图2 :流式细胞仪监测R0S水平。
[0029] 图3 :不同H202浓度下的细胞MDA含量和S0D活力。
[0030] 图4 :氧化应激和抗氧化应激细胞模型CAT、GSH-S、S0D活力和MDA含量。
[0031] 图5: ACt值计算图示。
[0032] 图6 :各对引物的扩增的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0033] 图7 :qPCR扩增结果（DLP1引物为例，上为扩增曲线，下为溶解曲线）
[0034] 图8 :各对引物扩增后的A Ct值。
[0035] 图9 :利用DLP1检测氧化应激和抗氧化细胞内和细胞上清mtDNA氧化损伤水平。
[0036] 图10 :代谢综合征患者和健康对照血清MDA含量比较。
[0037] 图11 :外周血PBMC mtDNA与血浆游离mtDNA氧化损伤水平比较
【具体实施方式】
[0038] 实施例1引物设计
[0039] 根据NCBI基因库人类mtDNA(NC_012920)标准序列，首先针对mtDNA D-loop区 (displacement loop)设计引物。D-loop区包含mtDNA重链合成的复制起始区，是mtDNA 复制的控制区，也是mtDNA与线粒体膜的结合位点，易受脂质过氧化物的影响，是mtDNA 突变的高发区，碱基突变率比其他区域高6-8倍。D-loop区包括三个高变区，高变区 I (npl6024-16383)、高变区II (np57-372)和高变区III (np438-574)。因此，为保证扩增的 特异性，在设计引物时避开这三个高变区。
[0040] 表1中显示的DLP1引物扩增的片段，未涵盖高变区，而DLP2引物扩增片段则部分 包含了高变区。此外，设计了扩增C0X1基因、C0X2基因和ND1基因的引物，以进行比较，这 些区域在mtDNA中相对保守且不易缺失。
[0041] 表1用于mtDNA氧化损伤检测的引物列表
[0042]
【主权项】
1. 检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂在制备评价体内氧化应激的试剂中的应用。
2. 权利要求1所述的应用，其中所述检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂为PCR引 物和人8-氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶（hOGGl)。
3. 权利要求2所述的应用，其中PCR引物为选自下列引物对的引物对： DLPl :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)； C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC (SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)； NDl :正向引物 CCTAATGCTTACCGAACGAA(SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
4. 权利要求3所述的应用，其中PCR引物为： DLPl :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)〇
5. 基于检测外周血线粒体DNA氧化损伤来评价体内氧化应激的非诊断方法，步骤包 括： (1)提取样本DNA ; ⑵使用hOGGl处理部分DNA ; (3) 使用hOGGl处理过和未处理过的DNA进行qPCR反应； (4) 比较hOGGl处理过和未处理过的DNA的Ct值差异； (5) 根据Ct值差异，判断8-羟基脱氧鸟苷（8-OH-dG)的含量，并间接反映DNA氧化损 伤和体内氧化应激的水平。
6. 权利要求5所述的非诊断方法，其中步骤（3)的qPCR反应中使用的引物为选自下列 引物对的引物对： DLPl :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)； C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC (SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)； NDl :正向引物 CCTAATGCTTACCGAACGAA(SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
7. 权利要求6所述的非诊断方法，其中步骤（3)的qPCR反应中使用的引物为：DLP1 : 正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA (SEQ ID NO. 2) 〇
【专利摘要】本发明提供了检测外周血线粒体DNA氧化损伤的试剂在制备评价体内氧化应激的试剂中的应用，以及基于检测外周血线粒体DNA氧化损伤评价体内氧化应激的方法。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104846075
【申请号】CN201510145466
【发明人】叶薇, 刘楚, 汤晓君, 吕建新
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年3月31日