专利名称：用于抑制线粒体3-磷酸甘油酰基转移酶1(mtgpat1)表达的rna拮抗剂化合物的制作方法
用于抑制线粒体3-磷酸甘油酰基转移酶1 (MTGPAT1)表达
的RNA拮抗剂化合物
技术领域：
本发明涉及寡聚体化合物(寡聚体)，其靶向细胞内的mtGPATlmRNA，导致mtGPATl 的表达降低。mtGPATl表达降低有利于一系列疾病，例如超重，肥胖症，脂肪肝，肝脏脂肪变 性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰岛素抗性，及非胰岛素依 赖型糖尿病(NIDDM)。
背景技术：
线粒体3-磷酸甘油酰基转移酶1 (EC 2. 3. 1. 15，也被称为GPATl，mtGPATl, GPAM， mtGPAM)在肝脏甘油三酯形成中起主要作用，其中高水平的mtGPATl活性导致脂肪肝(肝脏 脂肪变性)，然而mtGPATl的缺乏导致低水平的肝脏甘油三酯及刺激的脂肪酸氧化。3-磷酸甘油酰基转移酶(GPATs)是催化甘油三酯合成中的限速步骤的酶家族。酶 催化3-磷酸甘油与活化的脂肪酸(酰基-辅酶A，酰基-CoA)之间的酯键形成。早已知，不 只一种酶负责细胞内GPAT酶促活性，有酶促活性存在于内质网及线粒体外膜，及一部分酶 不敏感相应敏感于NEM灭活(Coleman et al. (2000) Annu. Rev. Nutr. 20,77-103-3 ；Coleman et al. (2004)Prog. Lipid Res. 43,134-176 ；Coleman(2007)Cell Metab 5,87-89)。MtGPATl已鉴定为不敏感于NEM灭活的GPAT酶，及仅存在于线粒体内。mtGPATl活 性在肝外组织低，在那里它们负责总GPAT活性的10%，然而在肝脏中活性高，其中mtGPATl 占总 GPAT 活性的达 50% (Coleman et al. (2000)Annu. Rev. Nutr. 20,77-103-3 ；Coleman et al. (2004) Prog. Lipid Res. 43,134-176 ； Co leman (2007) Cell Metab 5,87-89)。溶血 磷脂酸(LPA)，全部GPAT活性的产物，可驱动合成甘油三酯及磷脂。涉及甘油三酯合成的 多数酶存在于内质网，及mtGPATl因此早先被认为主要涉及磷脂前体合成。但是，mtGPATl 活性的激素及营养调节显示在肝脏甘油三酯合成中的关键作用(Coleman et al. (2000) Annu.Rev.Nutr. 20,77-103-3 ；Colemanet al. (2004)Prog. Lipid Res. 43,134-176 ； Coleman(2007)Cell Metab5，87-89)。MtGPATl活性响应喂食及在肥胖的小鼠中显著上调 (Xuet al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 349,439-448)。mtGPATl在CHO或HEK293细胞中的过表达导致细胞内甘油三酯的水平稳固增加 (Igal et al. Q001)J. Biol. Chem. 276,42205-42212)。mtGPATl 在肝脏细胞中的过表达 导致甚至更高水平的细胞内脂质蓄积(Lewin et al. (2005)Am. J. Physiol Endocrinol. Metab 288, E835-E844)，伴随用于细胞燃料的脂肪酸利用(β -氧化)降低-看起来似乎 高水平的mtGPATl活性导致增加的肝脏脂肪酸摄取及甘油三酯合成(脂肪合成代谢)及 降低的脂肪酸氧化(脂质分解代谢)。这与丙二酰-CoA控制的“代谢转换”的观点一致， 其中细胞的能量需求(通过控制丙二酰-CoA浓度)驱使活化的脂肪酸向脂肪生成/储存 (mtGPATl活性)或转移到线粒体，然后脂肪酸氧化(用肉毒碱棕榈酰转移酶-1，CPT-IJt 为限速酶)。在表达高水平的mtGPATl的全部细胞中，甘油三酯合成优于将活化的脂肪酸插 入磷脂或胆留醇酯。
mtGPATl的瞬时的肝脏腺病毒-诱导的过表达导致肝脏三酰甘油大量增加，即 肝脏脂肪变性(Linden et al. (2006)FASEB J. 20，434-443)及胰岛素抗性(Nagle et al. (2007) J.Biol· Chem. 282，14807-14815)。已产生 MtGPATl 敲除小鼠。当保持标准喂 食时，动物具有更低重量及性腺脂肪垫重量，更低肝脏甘油三酯水平，更低血浆甘油三 酯，及更低 VLDL 分泌(Hammond et al. (2002)Mol. Cell Biol. 22,8204-8214 ；Yazdi et al. (2008)Biochem. Biophys. Res. Commun. 369，1065-1070)。MtGPATl 敲除动物也似乎被保 护抵抗胰岛素抗性(Neschen et al. (2005) Cell Metab 2, 55-65) 在保持高脂肪，高蔗 糖摄食4个月的小鼠中，mtGPATl的缺乏导致肝脏甘油三酯含量60 %降低，伴随刺激的脂 肪酸氧化的适应症，例如增加的血浆β-羟基丁酸水平(Hammond et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 25629-25636)。老的mtGPATl敲除小鼠具有增加的长链脂肪酸-CoA肝脏蓄积， 提示，酶促活性的平衡的下调优选相比于完全缺乏蛋白(Hammond et al. (2005) J. Biol. Chem. 280,25629-25636)。但是，mtGPATl的缺乏似乎不导致任何肝脏尺寸，肝脏细胞数，或 线粒体形态的总变化(Hammond et al. (2007)Exp. Mol. Pathol. 82，210-219)。总的结论是， 高mtGPATl活性关联于肥胖症，胰岛素抗性，及肝脏脂质蓄积。mtGPATl活性抑制至今限于指向酶活性位点的小分子。但是，在GPAT家族不同成 员的活性位点有大程度的蛋白序列同源性(Gonzalez-Baro et al. (2007)Am. J. Physiol Gastrointest. LiverPhysiol 292, G1195-G1199)使设计特异于蛋白家族的一种奇异成员 的小分子抑制剂成为挑战。因此，有对亚型特异性GPAT抑制剂的需求，例如mtGPATl特异性抑制剂。含本发 明的RNA拮抗剂的LNA是所述符合未满足的涉及mtGPATl表达调节的治疗性，诊断性及研 究应用需求的mtGPATl特异性抑制剂。发明概述本发明提供长度10 30个核苷酸之间的寡聚体，其中包括总10 30个核苷酸之 间的连续核苷酸序列，其中所述连续核苷酸序列至少80% (例如，85%，90%，95%，98%， 或99%)同源于对应于哺乳动物mtGPATl基因或mRNA，例如SEQ ID NO :263或其天然存在 的变体的反向互补体的区。因此，例如，寡聚体与具有部分SEQ IDNO :263序列的单链核酸 分子杂交。本发明提供缀合物，其包括本发明的寡聚体，及共价连接到所述寡聚体的至少一 个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。本发明提供药物组合物，其包括本发明的寡聚体或缀合物，及药学可接受的稀释 剂，载质，盐或佐剂。本发明提供用作药物的本发明的寡聚体或缀合物，所述药物例如用于治疗超重， 肥胖症，脂肪肝，肝脏脂肪变性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)， 胰岛素抗性，及非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。本发明提供本发明的寡聚体或缀合物用于制备治疗超重，肥胖症，脂肪肝，肝脏脂 肪变性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰岛素抗性，及非胰岛 素依赖型糖尿病(NIDDM)的药物的用途。本发明提供治疗超重，肥胖症，脂肪肝，肝脏脂肪变性，非酒精性脂肪肝病 (NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰岛素抗性，及非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的方法，所述方法包括给患有，或可能患有超重，肥胖症，脂肪肝，肝脏脂肪变性，非酒精性 脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰岛素抗性，及非胰岛素依赖型糖尿病 (NIDDM)的患者施用本发明的寡聚体，缀合物或药物组合物。本发明提供抑制表达mtGPATl的细胞内的mtGPATl的方法，所述方法包括给所述 细胞施用本发明的寡聚体，或缀合物，以实现抑制所述细胞内的mtGPATl。
图1 显示含针对mtGPATl的单链反义寡核苷酸的一系列LNA以相同纳摩尔范围 体外有效。A)用一系列含针对mtGPATl的反义分子的LNA脂质-辅助的转染后LTK-D2细 胞内的相对mtGPATlmRNA表达。数据代表表示为模拟转染的细胞内的相应mRNA比的百分 率的mtGPATl/GADPH mRNA表达的平均值士SD。B)用一系列含针对mtGPATl的反义分子的 LNA经脂质-辅助的转染后HuH7细胞内的相对mtGPATlmRNA表达。数据代表表示为模拟转 染的细胞内相应mRNA比的百分率的mtGPATl/GADPH mRNA表达的平均值士SD。图2 雌性C57BL/6小鼠中肝脏mtGPAT mRNA表达的体内下调。测试了 5种不同 mtGPAT 反义寡聚体，SEQ ID NO :33，125，147，176，及 249 对肝脏 mtGPAT mRNA 表达的影响。序列标识号简述1 262提供于表1。263提供于实施例部分后的序列表。264 290提供于表2。选自表1的特别优选的反义序列的列表提供于表3。发明详述寡聚体本发明采用寡聚体化合物(在本文中称为寡聚体)，其用于调节编码哺乳动物 mtGPATl的核酸分子(例如显示于SEQ ID NO :263的mtGPATl核酸，及所述编码哺乳动物 mtGPATl的核酸分子的天然存在的变体)的功能。术语“寡聚体”在本发明中指由2个或更 多核苷酸共价连接形成的分子(即寡核苷酸)。寡聚体包括长度10 30个核苷酸之间的 连续核苷酸序列，或由其构成。在各种实施方式中，本发明的化合物不包括RNA (单元)。优选是，本发明的化合 物是线性分子或合成为线性分子。寡聚体是单链分子，及优选不包括例如，互补于相同寡聚 体内的等同区的至少3，4或5个连续核苷酸的短区(即双链体)_在这点上，寡聚体(基本 上)不是双链。在一些实施方式中，寡聚体基本上不是双链，例如不是siRNA。在各种实施 方式中，本发明的寡聚体可完全由连续核苷酸区构成。因此，寡聚体基本上不自体互补。靶适宜地，本发明的寡聚体能下调mtGPATl基因的表达。在这点上，本发明的寡聚体 可一般在哺乳动物中例如人细胞中实现mtGPATl的抑制。在一些实施方式中，本发明的寡 聚体结合靶核酸，及实现相比正常表达水平至少10%或20%的表达抑制，更优选相比正常 表达水平至少30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的抑制。在一些实施方式中， 当使用0. 04与25nM之间的，例如0. 8与20nM之间的浓度的本发明的化合物时，观察到所 述调节。在相同或不同实施方式中，表达抑制小于100%，例如小于98%的抑制，小于95%抑制，小于90 %抑制，小于80 %抑制，例如小于70 %抑制。表达水平的调节可通过测量蛋 白水平来测定，例如通过例如SDS-PAGE，然后使用针对产生的靶蛋白的适宜抗体的蛋白印 迹的方法。或者，表达水平的调节可通过测量mRNA水平来测定，例如通过RNA印迹或定量 RT-PCR。当通过mRNA水平测量时，当使用适当的剂量，例如0. 04及25nM之间的，例如0. 8 及20nM之间的浓度时，下调的水平在一些实施方式中，一般到无本发明的化合物的情况的 正常水平的10 20%之间的水平。 本发明因此提供下调或抑制表达mtGPATl蛋白和/或mRNA的细胞内的mtGPATl 蛋白和/或mRNA的表达的方法，所述方法包括给所述细胞施用本发明的寡聚体或缀合物， 以下调或抑制所述细胞内的mtGPATl蛋白和/或mRNA的表达。适宜地，细胞是哺乳动物细 胞，例如人细胞。在一些实施方式中，施用可体外实现。在一些实施方式中，施用可体内实 现。 本文所用的术语“靶核酸”指编码哺乳动物mtGPATl多肽(例如人mtGPATl)的DNA 或RNA，例如SEQ ID NO :263。编码mtGPATl的核酸或其天然存在的变体，及由其衍生出的 RNA核酸，优选mRNA，例如pre-mRNA，尽管优选为成熟的mRNA。在一些实施方式中，例如当 用于研究或诊断时，“靶核酸”可为cDNA或源于以上DNA或RNA核酸靶的合成的寡核苷酸。 本发明的寡聚体优选能与靶核酸杂交。需知，SEQ ID NO :263是cDNA序列，及如所述，对应 于成熟的mRNA靶序列，尽管在cDNA序列中尿嘧啶被胸苷取代。术语“其天然存在的变体”指在指定的分类群(例如哺乳动物，例如小鼠，猴，及优 选人)中天然存在的核酸序列的mtGPATl多肽变体。一般而言，当说道多核苷酸的“天然存 在的变体”时，术语也可包括编码通过染色体转位或复制见于染色体10 ；位置10q25. 2Mb 的mtGPATl的基因组DNA的任何等位变体，及RNA，例如由其衍生出的mRNA。“天然存在的 变体”还可包括源于mtGPATlmRNA的可变剪接的变体。当说道特异性多肽序列时，例如，术 语也因此包括天然存在的形式的可例如通过翻译同时或翻译后修饰(例如信号肽切割，蛋 白水解切割，糖基化，等)加工的蛋白。序列寡聚体包括对应于SEQ ID NO :263所示的核苷酸序列的反向互补体的连续核苷酸 序列，或由其构成。因此，寡聚体可包括选自SEQID N0:l ^2的序列，或由其构成，其中 所述寡聚体(或其连续核苷酸部分)可相对所述选定的序列任选有1个、2个或3个错配。表1 本发明的寡聚体序列的列表可根据本发明，如别处所述，通过包括增加寡核苷酸Tm的核苷酸类似物来设计此 表中的寡聚体序列。而且，可将硫代磷酸酯键提供为核苷酸间键。“S”代表硫代磷酸酯键，粗体字母代表LNA分子。
权利要求
1.长度10 30个核苷酸之间的寡聚体，例如SEQID NO 125，其包括总10 30个核 苷酸之间的连续核苷酸序列，其中所述连续核苷酸序列至少80%同源于对应于下列的区 哺乳动物mtGPATl基因或mRNA的反向互补体，例如SEQ ID NO J63，或者它们的天然存在 的变体。
2.权利要求1的寡聚体，其中所述连续核苷酸序列至少80%同源于对应于下列任何的 区=SEQ ID NO 264, 265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279， 280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，及 290。
3.权利要求1或2的寡聚体，其中所述连续核苷酸序列与SEQIDNO :263的相应区的 反向互补体不包括错配，或包括不多于1个或2个错配。
4.权利要求1 3中任一项的寡聚体，其中所述寡聚体的核苷酸序列由连续核苷酸序 列构成。
5.权利要求1 4中任一项的寡聚体，其中所述连续核苷酸序列的长度在10 18个 核苷酸之间。
6.权利要求1 5中任一项的寡聚体，其中所述连续核苷酸序列包括核苷酸类似物。
7.权利要求1 6中任一项的寡聚体，其中所述连续核苷酸包括SEQID NO 1 262 中任一个,或由SEQ ID NO :1 262中任一个构成。
8.权利要求6或7的寡聚体，其中所述核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸，例如选自下 列的糖修饰的核苷酸锁核酸(LNA)单元；2’ -0-烷基-RNA单元，2’ -OMe-RNA单元，2’ -氨 基-DNA单元，及2，-氟-DNA单元。
9.权利要求6或7的寡聚体，其中所述核苷酸类似物是LNA0
10.权利要求6 9中任一项的寡聚体，其为间隔聚体。
11.权利要求1 10中任一项的寡聚体，其中所述寡聚体是SEQIDNO :2，33，125，142， 147，169，176，182，214，249，250 及 254 中任一个。
12.权利要求1 11中任一项的寡聚体，其抑制表达mtGPATl基因或mRNA的细胞内的 mtGPATl基因或mRNA的表达。
13.缀合物，其包括权利要求1 12中任一项的寡聚体，及共价连接到所述寡聚体的至 少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。
14.药物组合物，其包括权利要求1 12中任一项的寡聚体，或权利要求13的缀合物， 及药学可接受的稀释剂，载质，盐或佐剂。
15.用作药物的权利要求1 12中任一项的寡聚体，或权利要求13的缀合物，所述药 物例如用于治疗超重，肥胖症，脂肪肝，肝脏脂肪变性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精 性脂肪性肝炎(NASH)，胰岛素抗性，及非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。
16.权利要求1 12中任一项的寡聚体，或权利要求13中定义的缀合物用于制备治 疗超重，肥胖症，脂肪肝，肝脏脂肪变性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)，胰岛素抗性，及非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的药物的用途。
17.治疗超重，肥胖症，脂肪肝，肝脏脂肪变性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性 脂肪性肝炎(NASH)，胰岛素抗性，及非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的方法，所述方法包括 给患有，或可能患有超重，肥胖症，脂肪肝，肝脏脂肪变性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒 精性脂肪性肝炎(NASH)，胰岛素抗性，及非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的患者施用权利要求1 12中任一项的寡聚体，或权利要求13的缀合物，或权利要求14的药物组合物。
18.表达mtGPATl的细胞内的mtGPATl的抑制方法，所述方法包括给所述细胞施用权利 要求1 12中任一项的寡聚体，或权利要求13的缀合物，以抑制所述细胞内的mtGPATl。
全文摘要
本发明涉及寡聚体化合物(寡聚体)，其靶向细胞内的mtGPAT1mRNA，导致mtGPAT1的表达减少。mtGPAT1表达降低有利于治疗某些疾病，例如超重，肥胖症，脂肪肝，肝脏脂肪变性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰岛素抗性，及非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。
文档编号C12N15/113GK102076854SQ200980124993
公开日2011年5月25日 申请日期2009年6月24日 优先权日2008年7月3日
发明者E·M·斯特拉尔普, M·林德霍尔姆 申请人:桑塔里斯制药公司