专利名称：一种快速双向多位点基因突变的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及ー种快速高效的基因突变方法。本方法以改进的重叠延伸PCR方法为基础，利用带有突变位点的特异性引物，通过两轮PCR扩增和DNA片段连接实现DNA双向多位点基因突变。
背景技术：
随着分子生物学研究的不断发展，基因定点突变技术成为ー种常用的改造和优化基因的方法，在基因合成，基因表达及蛋白质结构与功能之间的关系等方面的研究中得到广泛的应用。PCR介导的点突变是使用最为普遍的基因定点突变技术。PCR诱导定点突变包括重叠延伸突变及一歩快速突变等，具有准确、高效的特点，其中重叠延伸突变PCR可以在DNA区段的任何位置实现定点突变，但耗时长且突变位点有限。本发明对传统重叠延伸PCR法进行定点突变的实验方法进行了改进，可以在同管内实现双向多位点快速基因突变。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种基因多位点突变方法，采用此方法可以快速、准确地实现双向多位点基因突变和新目的基因片段合成。所述快速双向多位点基因突变方法包括以下步骤
O 根据目的基因待突变位点及其上下游序列特点，确定上中下三个DNA片段，根据上述三个DNA片段的序列特点和待突变位点，设计三对特异性引物，分别表示为FlF和F1RT，F2FT和F2RT,以及F3FT和F3R，其中Fi (i=l，2和3)表示3个DNA片段，F表示上游引物，R表示下游引物，T表示延伸序列；
2)进行第一轮PCR，以目的基因为模板，利用步骤I)中的三对特异性引物分别扩增得Fl，F2和F3三个DNA片段；
3)进行第二轮PCR，分离纯化步骤2)所得的扩增产物Fl，F2和F3，并将其作为扩增模板，采用重叠延伸PCR方法，利用三个片段间重叠部分的片段作为铰链，将含有突变序列的三个片段相连接，以FlF和F3R为引物进行扩增，即可扩增得到双向多位点突变的基因产物；
4)在步骤I)中，Fl片段的下游引物FlRT和F2片段的上游引物F2FT含有相同待突变片段和部分重叠序列，F2片段的下游引物F2RT和F3片段的上游引物F3FT亦含有相同待突变片段和部分重叠序列；
5)在步骤2)中，第一轮PCR扩增产物Fl片段的3’端和F2片段的5’端部分序列相同并含有相同的突变序列，F2片段的3’端序列和F3片段的5’端部分序列相同并含有相同的另一段突变序列。
图I基因双向多位点突变原理示意图。以目的基因为模板，利用三对引物进行第ー轮PCR扩增，得Fl、F2和F3三个片段；再以上述三个DNA片段为模版，以FlF和F3R为引物进行第二轮PCR扩增，即获得双向多位点突变基因。图2 PCR产物电泳图。图A、B分别为第一、ニ轮PCR扩增产物的电泳图。
具体实施例方式实施例I :长度为324 bp,含有两个突变DNA片段的获得 一、引物的设计 根据所选DNA片段(见序列表SEQ ID No. I)的拟突变位点及其序列特征，设计三对特异性引物，分别用于扩增选定的DNA片段和其相邻上下游片段(Fl :上游片段，F2 :靶序列，F3 :下游片段)。所设计的引物序列如表I所示，其中划线部分为延伸序列，即重叠部分。表I引物序列
权利要求
1.ー种快速双向多位点基因突变的方法，其特征在于以下步骤 1)在需突变基因的序列范围及其上下游选定三个DNA片段，设计三对引物，引物分别表示为FlF和F1R，F2F和F2R，以及F3F和F3R (Fi (i=l，2和3)表示3个DNA片段，F表示上游引物，R表示下游引物)，其中F1R，F2F，F2R和F3F含有突变序列； 2)进行第一轮PCR，以待突变基因为模板，利用上述三对引物扩增，得到含有突变序列的DNA片段产物F1，F2和F3，其序列特点为Fl片段的3’端和F2片段的5’端部分序列相同并含有相同的突变序列，F2片段的3’端序列和F3片段的5’端部分序列相同并含有相同的另一段突变序列； 3)以F1，F2和F3三个片段作为扩增模板，采用重叠延伸PCR方法，利用三个片段间重叠部分的片段作为铰链，将含有突变序列的三个片段相连接并以FlT和F3R为引物进行第ニ轮PCR，扩增即可得到目的基因产物。
2.按照权利要求I所述的基因双向多位点突变的方法，其特征在于运用两轮PCR，且第二轮PCR利用了重叠延伸的方法。
3.根据权利要求I和2所述的基因双向多位点突变方法，其特征为确定含有待突变序列的DNA片段F2和其上游片段Fl和下游片段F3。
4.根据权利要求1，2和3所述的基因双向多位点突变方法，其特征是所用的部分特异性引物含有待突变序列和重叠序列。
5.根据权利要求1，2，3和4所述的基因双向多位点突变方法，其特征是所用的源模板是通过基因修饰方法获得的含有突变基因的DNA序列。
6.根据权利要求5所述和基因双向多位点突变方法，其特征是采用改进的重叠延伸PCR方法连接多个含有突变基因序列的片段。
7.根据权利要求5和6所述和基因双向多位点突变方法，其特征是采用改进的重叠延伸PCR方法快速合成含有突变基因序列的片段。
全文摘要
本专利涉及一种快速双向多位点基因突变的方法。本方法以改进的重叠延伸PCR方法为基础，利用带有突变位点的序列特异性引物，通过两轮PCR扩增和DNA片段连接实现DNA双向多位点基因突变。本方法可广泛用于目的基因定点突变，基因合成，蛋白结构-功能研究、蛋白质表达优化和目的基因包装。本方法按照需要实现突变的DNA片段序列特点，设计出三个DNA片段和三对相应特异性扩增引物。通过两步PCR扩增和特定的扩增程序设定，得到引入所需突变位点的目的基因片段。
文档编号C12N15/10GK102690807SQ20121014000
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者徐峰, 王书崎, 隗慧林 申请人:王书崎