专利名称：一株Pseudomonas psychrophila Den-03低温好氧反硝化菌及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程、环境工程技术领域,涉及菌株Pseudomonas psychrophilaDen-03的筛选及其在低温污水脱氮过程中的应用。
背景技术：
进入21世纪，全球性的水资源危机给人类带来巨大困扰，尤其我国作为ー个发展大国，经济发展迅速，加速水污染治理已经成为我国加强水资源保护的主要目标之一。集中排放的城镇生活污水的氨氮，大量化肥产生的硝态氮等各种形式氮元素积存，加剧了湖泊水体富营养化的程度，影响并制约了社会经济的发展。“十二五”期间，我国在已有及新建的污水处理厂中，执行《城市污水处理厂污水综合排放标准》(GB18918-2002) ー级A标准(氨氮<5mg/L，TN〈15mg/L)，表明城市污水处理的目标已经逐渐从关注COD和悬浮固体的去除扩大到氮等有机营养物质的去除。因此，开发经济高效的生物脱氮方法和技术已成为水污染控制领域热点之一。由于好氧反硝化较传统生物脱氮技术存在着明显的优势，近年来好氧反硝化技术成为了国内外废水生物脱氮新的发展方向。马放等人针对好氧反硝化菌在环境中数量较少，不易形成优势种群，直接筛选难度较大，有可能筛到的菌反硝化效率不高的特点，采用SBR反应器，通过间歇曝气和连续曝气两种方式均对活性污泥体系中好氧反硝化菌起到了选择和富集的作用，并开发出了相应的试验装置。好氧反硝化应用的主体是好氧反硝化菌群，到目前为止，好氧反硝化菌主要集中在假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)和芽孢杆菌属(Bacillus),菌种应用及机理研究较多，而低温好氧反硝化菌的报道则较少。为此，从自然界筛选出低温条件下可显著提高生物脱氮效率的菌株，并将其制成生物菌制剂，应用于此类污染的治理将有着实际的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于为好氧反硝化技术的应用提供高效的菌剂，強化低温生物脱氮的效能，从自然界中分离出Pseudomonas psychrophila Den_03,能够在低温环境下提高生物脱氮的效率，对低温城市污水的稳定运行奠定理论基础。本发明能为现有城市污水厂提供低温高效生物脱氮菌制剂，強化低温生化系统的脱氮效能，从自然界中分离出菌株Pseudomonas psychrophila Den_03,能够在低温环境中促进N素的转化效率，是ー株低温好氧反硝化菌株，适宜冬季城市污水处理。本发明的技术解决方案是，本发明提供的菌株为Pseudomonas psychrophiliaDen-03，为革兰氏阴性假单胞菌，于2012年03月27日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)，其 保藏号 CGMCC NO. 5941。
该菌株Pseudomonas psychrophila适宜在中性(pH 7. 2)的培养介质中生长，生长温度为10 oC。其细菌学形态特征为革兰氏阴性假单胞菌，无鞭毛，细胞为黄白色，好氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，可进行反硝化作用，能够以硝态氮为能源生长。菌株Pseudomonas psychrophila Den-03是从哈尔滨城市污水厂好氧池活性污泥中分离得到。从哈尔滨城市污水厂好氧反应池采集活性污泥样品，作为菌源进行驯化培养，整个培养过程均在低温(10°c)条件下进行。即将所取污泥到好氧反硝化培养基中驯化，驯化采用一次性投加高浓度化合物的驯化方法，每个驯化周期结束时，将培养物取一定体积加入到新鮮的好氧反硝化培养基中，将此混合菌液涂布在好氧反硝化固体基础培养基上，反复进行平板涂布，分离出ー株具有高效低温好氧反硝化能力的菌株psychrophi Ia。具体按以下步骤进行
1)冬季从哈尔滨城市污水处理厂取IOmL新鮮活性污泥加入IOOmL好氧反硝化培养基 三角瓶中，置于温度为10°C、转速为150r/min的摇床中培养48h，获得富集菌液；
2)取IOmL富集菌液加入IOOmL好氧反硝化培养基三角瓶中，重复步骤I)的培养条件，获得驯化菌液；
3)取100μ L驯化菌液加入固体好氧反硝化培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为10°C的培养箱中，培养48 72h，获得单菌落；
4)重复操作步骤3)3^4次，即完成低温好氧反硝化菌的获得；
其中所述的好氧反硝化培养基组成为7.9 g/L Na2HPO4 ·7Η20、0. 3 g/L NH4Cl、4. 7 g/L柠檬酸钠、I. 5 g/L KH2P04、0. I g/L MgSO4 · 7H20、1. 5 g/L KNO3, 2mL 微量元素液溶于 1000mL蒸馏水中，调节pH 7. 2 ；
微量元素液的组成EDTA 50; ZnSO4 2. 2 g /L; CaCl2, 5. 5 g /L; MnCl2 · 4 H2O 5.0g /L; FeSO4 · 7 H2O 5 g /L; ( NH4 ) 6Mo702 · 4 H2O I. I g /LjCuSO4 · 5 H2O I. 57 g /L;CoCl2 · 6H20 I. 61 g /L ；pH:7. 2。步骤2)中驯化菌液的0D_值为I. 0，好氧反硝化培养基均在121°C下灭菌30 min以后使用。经过菌种鉴定，得到了长度为1501bp的16S rDNA序列。PCR 引物采用细菌 16S rDNA 的通用引物 27F :5’ -AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3’ 和1492R :5’ -GGTTACCTTGTTACGACT-3’。PCR 扩增反应体系总体积为 50 μ :超纯水 36 μ ,10 X Buffer 5 μ , dNTP 4 PL，27F 引物 I PL，1492R 引物 I μ ，rTaq 酶 I μ ，总 DNA 2 μ 于反应体系中。扩增仪器为PCR仪(GeneAmp，PCR System 9700)，PCR扩增反应条件为94oC预变性5 min,经过30个循环，其中，94 oC变性30 S，55 oC退火40 S，72 oC延伸30s，30个循环后再在72 oC延伸8 min，l%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测。通过Blast程序进行同源性比较，表明该菌株与Pseudomonas psychrophila的同源性高达99%。本发明的菌株Pseudomonas psychrophila Den-03在应用前需在好氧反硝化培养基中进行驯化，培养条件为菌株在10°c,pH 7. 2,低温好氧培养。该菌株对低温生境中硝酸盐的降解能力极强，且具有广泛的底物广谱性。本发明提供的菌株Pseudomonas psychrophila在低温城市污水处理过程中具有较强的反硝化能力，活化简単，在低温条件下生长较快，在溶解氧充足条件下，提高冬季的城市污水厂氮转化率，提高冬季城污厂生产效率，降低能耗。由于其低温好氧条件下可大量繁殖的特点，使其在低温条件下处理多种城市污水过程中具有极大潜力，可以应用于大规模的低温城市污水处理的脱氮过程中。该菌株对低温生活污水中的TN去除率达到74%。本发明在保证脱氮效率稳定的前提下，提高了冬季城市污水处理系统脱氮率、提高生产效率，降低生产能耗，对于实现短程同步硝化反硝化的具有重大意义。
图I是本发明的好氧反硝化菌96小时的菌体生长情况及污染物降解率变化。其中·表示好氧反硝化菌在96小时生长周期中的菌浊，柱形图□为96小时好氧反硝化菌生长周期中的污染物降解率。图2是本发明的好氧反硝化菌低温反硝化过程中不同硝态氮浓度的去除率趋势。其中·表示好氧反硝化菌在硝酸盐初始浓度100mg/L时的降解转化率，其中·表示好氧反硝化菌在硝酸盐初始浓度80mg/L时的降解转化率，其中▲表示好氧反硝化菌在硝酸盐初 始浓度60mg/L时的降解转化率，其中▼表示好氧反硝化菌在硝酸盐初始浓度40mg/L时的降解转化率。图3是本发明的好氧反硝化菌低温反硝化过程中亚硝氮积累转化趋势。其中·表示SBR反应器中配水进水浓度，其中·表示SBR反应器中单纯含有活性污泥的亚硝氮转化趋势，其中▲表示SBR反应器中含活性污泥和低温好氧反硝化菌的亚硝氮转化趋势。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式提供好氧反硝化菌的筛选步骤
一、冬季从哈尔滨城市污水厂取IOmL新鮮活性污泥加入IOOmL好氧反硝化培养基三角瓶中，置于温度为10°C，转速为150r/min的摇床中培养48h，获得富集菌液；ニ、取IOmL富集菌液加入IOOmL好氧反硝化培养基三角瓶中，重复步骤一的培养条件，获得驯化菌液；三、取100 μ L驯化菌液加入固体好氧反硝化培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为10°C的培养箱中，培养48 72h，获得单菌落；四、重复操作步骤三3 4次，即完成低温好氧反硝化菌的获得；五、其中步骤四获得的低温好氧反硝化菌，属于psychrophilia,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO. 5941 ；
其中所述的好氧反硝化培养基组成为7.9 g/L Na2HPO4 ·7Η20、O. 3 g/L NH4Cl、4. 7 g/L柠檬酸钠、I. 5 g/L KH2P04、0. I g/L MgSO4 · 7H20、1. 5 g/L KNO3, 2mL 微量元素液溶于 1000mL蒸馏水中，调节pH 7. 2 ；
微量元素液的组成EDTA 50; ZnSO4 2. 2 g /L; CaCl2, 5. 5 g /L; MnCl2 · 4 H2O 5.0g /L; FeSO4 · 7 H2O 5 g /L; ( NH4 ) 6Mo702 · 4 H2O I. I g /LjCuSO4 · 5 H2O I. 57 g /L;CoCl2 · 6H20 I. 61 g /L ；pH:7. 2。
步骤2)中驯化菌液的0D_值为I. O,好氧反硝化培养基均在121°C下灭菌30 min以后使用。
具体实施方式
ニ取具体实施方式
一中获得的低温好氧反硝化菌单菌落于装有灭菌的好氧反硝化培养基中低温好氧培养96h，转速150r/min，即为低温好氧反硝化菌的生长降解曲线。结果如图I所示，96h的好氧反硝化菌0D_趋于稳定达到I左右。污染物降解率达到70%，说明本实施方式获得的好氧反硝化菌具有良好的降解能力。
具体实施方式
三与具体实施方式
ニ不同的是将培养96h后的好氧反硝化菌液置于SBR反应器。根据四个不同硝态氮浓度100mg/L、80mg/L、60mg/L、40mg/L分别装入四个三角瓶SBR反应器中，每个500mL三角瓶中加入10%的活性污泥，IO0C培养，150 r/min，好氧培养10d。反应周期ー个周期12h，进水O. 5h，曝气8h，沉淀2h，排水和闲置时间I. 5h。结果如图2所示，随着培养时间的延长，8d不同浓度硝态氮降解效果明显，硝态氮浓度均达到20mg/L以下，说明本实施所用的低温好氧反硝化菌具有良好的反硝化能力。
具体实施方式
四与具体实施方式
三不同的是将培养96h后的低温好氧反硝化菌液置于SBR反应摇瓶中。一个摇瓶中单纯采用活性污泥处理配水进水，另ー个摇瓶采用活性污泥加入本实施获得的低温好氧反硝化菌液共同处理配水进水。
本实施中配水进水各种营养元素比例按照城市生活污水比例配制。本实施中SBR反应周期与具体实施方式
三相同。SBR连续运行23d，亚硝氮的浓度变化结果如图3所示，亚硝酸盐在SBR运行初期有明显的积累，运行IOd之后加入本实施制备的低温好氧反硝化菌的反应摇瓶中亚硝酸盐的含量急剧下降，随着周期的延长亚硝酸盐的含量趋于稳定，平均浓度维持在10mg/L左右。单纯活性污泥的反应摇瓶亚硝酸盐的含量在累积过后无下降趋势，平均浓度维持在65mg/L左右。说明本实施制备的低温好氧反硝化菌有较强的好氧反硝化能力，可以应用于大規模的低温城市污水处理的脱氮过程中。
权利要求
1.一株·Pseudomonas psychrophila Den_03低温好氧反硝化菌,其特征在于为革兰氏阴性假单胞菌，于2012年03月27日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO. 5941。
2.根据权利要求I所述的低温好氧反硝化菌，其特征在于菌株适宜在中性(pH7. 2)的培养介质中生长，生长温度为10°C，无鞭毛，细胞为黄白色，好氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，可进行反硝化作用，能够以硝态氮为能源生长。
3.根据权利要求I或2所述的ー株Aewt/offlmaspsychrophila Den_03低温好氧反硝化细菌的筛选方法，其特征在于按以下步骤进行 1)冬季从哈尔滨城市污水处理厂取IOmL新鮮活性污泥加入IOOmL好氧反硝化培养基三角瓶中，置于温度为10°C、转速为150r/min的摇床中培养48h，获得富集菌液； 2)取IOmL富集菌液加入IOOmL好氧反硝化培养基三角瓶中，重复步骤I)的培养条件，获得驯化菌液； 3)取100μ L驯化菌液加入固体好氧反硝化培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为10°C的培养箱中，培养48 72h，获得单菌落； 4)重复操作步骤3)3^4次，即完成低温好氧反硝化菌的获得； 其中所述的好氧反硝化培养基组成为7.9 g/L Na2HPO4 ·7Η20、O. 3 g/L NH4Cl、4. 7 g/L柠檬酸钠、I. 5 g/L KH2P04、0. I g/L MgSO4 · 7H20、1. 5 g/L KNO3, 2mL 微量元素液溶于 1000mL蒸馏水中，调节pH 7. 2 ；微量元素液的组成EDTA 50; ZnSO4 2. 2 g /L; CaCl2, 5. 5 g /L; MnCl2 · 4 H2O 5.0g /L; FeSO4 · 7 H2O 5 g /L; ( NH4 ) 6Mo702 · 4 H2O I. I g /LjCuSO4 · 5 H2O I. 57 g /L;CoCl2 · 6H20 I. 61 g /L ；pH:7. 2。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于步骤2)中驯化菌液的0D_值为1.0。
5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于好氧反硝化培养基均在121°C下灭菌30 min以后使用。
6.根据权利要求I或者所述的低温好氧反硝化菌，其特征在于菌株应用于大規模的低温城市污水处理的脱氮过程中。
全文摘要
一株PseudomonaspsychrophilaDen-03低温好氧反硝化细菌，属于生物工程、环境工程技术领域，菌株适宜在中性(pH7.2)的培养介质中生长，生长温度为10℃，无鞭毛，细胞为黄白色，好氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，可进行反硝化作用，能够以硝态氮为能源生长，经筛选获得的该菌株解决了北方低温城市污水处理过程中存在生产效率低、提升冬季脱氮效率等问题，其对低温生活污水中的TN去除率达到74%，在保证脱氮效率稳定的前提下，提高了冬季城市污水处理系统脱氮率、提高了生产效率，降低了生产能耗，对于实现短程同步硝化反硝化的具有重大意义。
文档编号C12N1/02GK102690765SQ201210139980
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者孔祥震, 崔迪, 庞长泷, 张斯 , 李昂, 蔡蕊, 邱天, 马放 申请人:哈尔滨工业大学宜兴环保研究院