专利名称：一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及生物学技术构建粉尘螨变应基因技术领域，尤其涉及一种生产重组粉尘螨变应原Der fl和Der f2融合蛋白的方法。
背景技术：
尘螨种类繁多，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具较强的变应原性，据估计，全球约10%的人口对尘螨过敏，约80%的外源性哮喘由尘螨引起，我国学者用粉尘螨粗提浸液对变态反应性疾病患者进行皮肤挑刺试验，47 92. 11%的成人哮喘患者、51. 64 78. 85%哮喘患儿、80%左右的鼻 炎患者、70%左右慢性荨麻疹患者呈阳性反应，1998年，美国由哮喘造成的直接和间接经济损失高达12. 7亿美元，近年来，建筑技术的发展和人民物质生活的丰富，室内居住环境发生了很大变化，但居室温、湿度相对稳定，空调环境使空气不能直接对外流通，环境为尘螨孳生提供了适宜条件，人们在室内逗留时间延长增加了尘螨过敏原接触,尘螨相关疾病的发生率随之增加，因此,开展尘螨源变态反应性疾病的预防、诊断、治疗及其发生机理等研究不仅具有重要的社会效益。过敏性哮喘是由免疫系统内淋巴细胞亚群Thl/Th2比例的失衡和其它ー些因素综合引起的，特异性免疫治疗被认为是目前唯一哮喘病因治疗方法，可以改变哮喘病程，能阻滞症状的恶化和防治对新的变应原产生过敏，其通过小剂量皮下注射尘螨变应原，并逐渐增加变应原剂量，提高患者对特异性变应原的免疫耐受カ，调节患者细胞免疫功能，增强Thl反应、抑制Th2反应，并产生高水平的IgG抗体阻断变应原结合到IgE，目前，临床采用尘螨变应原粗提浸液免疫治疗I型变态反应性疾病患者，由于变应原浸液包含成分较复杂如存在变应原、非过敏性或毒性蛋白及其它成分，在治疗过程中长期使用易导致红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、喉头水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应，此外，采用粗提浸液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。因此，变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫诊治的变应原应该是纯品而不宜为粗制浸液，但是，尘螨变应原主要存在于排泄物和皮壳中，采用生物化学方法提纯尘螨变应原，耗时长，过程繁琐，成本较高，且无法彻底去除溶剂等成份，不能从根本上提高变应原的纯度、避免免疫治疗中副反应的发生，随着分子生物学技术的发展和成熟，研制基因工程技术生产重组变应原成为变态反应学研究的主流，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。尘螨变应原组成复杂，约有30余种，其中第I组分和第2组分约占螨粗提浸液的90%;在螨过敏患者的血清中，80%以上患者的IgE结合这两类抗原，并呈现强反应性，因此诱导 Th2 型应答的主要是第 I 和 2 组分(Wayne R. Thomas, Wendy-Anne Smith, et al. Theallergenic specificities of the house dust mite[J]. Chang Gung Med J. 2004 ；27(8)563 569)，因此，重组粉尘螨变应原第1、2组分及二者的融合蛋白，可为临床诊治尘螨源变态反应性疾病提供制品。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产重组粉尘螨变应原Der fl和Der f2融合蛋白的方法，它耗时短，过程简单，成本较低，可以彻底去除溶剂等成份，从根本上提高变应原的纯度，避免免疫治疗中副反应的发生，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案它通过提取粉尘螨总RNA，根据GenBank公布的粉尘螨变应原第I组份(Der fl)和粉尘螨变应原第2组份(Der f2)核酸序列设计引物，用PCR扩增获得其编码基因，依次克隆至pMD19_T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱 导表达，以PMD 19-T-Der fl、PMD 19-T-Der f2为模板，PCR扩增后切胶、回收产物Der Π和Der f2，PCR搭链构建嵌合基因片段，切胶回收产物并命名为Der fm，克隆至pMD19_T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用IPTG诱导表达，所有表达产物经琼脂糖凝胶FF亲和柱层析纯化后，用SDS-PAGE和Western-blotting验证产物。所述的粉尘螨变应原第I组分Der f IRT-PCR扩增结果是从RNAiso Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，经两次PCR扩增获得的产物经琼脂糖凝胶电泳，见一条约966bp的条带，与理论值相符合，然后将PCR产物回收，与pMD19-T simple连接后，转化至E. coli Competent Cells JM109中，过夜培养,蓝白斑筛选并提取质粒,用BamH I和XhoI酶切鉴定获得与预期相符的結果，1.0%琼脂糖凝胶电泳结果，将pET28a(+)-Der f I质粒转化宿主菌E. coliBL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，在临近34kD处出现特异性条带，与预期分子量大小一致，用RNA isolation Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，RT-PCR扩增获得目的基因，经琼脂糖凝胶电泳，见一条约441bp的条带，与理论值相符合，用BamH I/Xho I双酶切测序正确的pMD19-T_Der f 2质粒，回收后获得目的基因，将其插入pET28a(+)载体，质粒提取后行琼脂糖凝胶电泳，挑选目的质粒用BamH I/Xho I进行酶切鉴定，有两质粒经1%琼脂糖凝胶电泳显示出两个条带，与预期相符，说明亚克隆获得成功，将pET28a(+)-Der f2质粒转化宿主菌E. coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，pET28a(+)-Der f 2全细胞和沉淀物在临近14kD处出现特异性条带，与预期分子量大小一致，说明pET28a(+)-Der f 2基因正常表达，但表达为包涵体。所述的粉尘螨变应原第I和2组分嵌合基因片段的扩增结果分别以pMD19-T-Derf I和为pMD19-T-Der f 2模板进行PCR扩增，回收产物Der fl和Der f2后搭链PCR合成得粉尘螨变应原第1、2组分的嵌合基因片段Der fm，使用Sal I/Xho I对测序正确的pMD19-T-Der fm质粒进行酶切，电泳后回收小片段即为Der fm ;使用Sal I/Xho I对pET28a(+)质粒进行酶切，对回收产物进行精制、去磷酸化；通过连接酶将二者连接，热转化至E. coli Competent CellsJM109中，涂布平板，37°C过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒即为pET28a(+)-Der fm，该质粒经Sal I/Xho I双酶切鉴定，将构建成功的原核表达质粒pET28a(+)-Der fm质粒转化宿主菌E. coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，pET28a(+)-Der fm全细胞和沉淀物在约52kD处出现特异性条带，与预期分子量大小相似，说明pET28a-Der fm基因正常表达，但表达为包涵体，从2000mL发酵液收集到菌体，超声波破碎后，离心收集沉淀即为粗制的包涵体，经洗涤、溶解、过滤后，上清液经过镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，并用不同浓度咪唑溶液洗脱并收集产物从2000mL发酵液收集到菌体，超声波破碎后，离心收集沉淀即为粗制的包涵体，经洗涤、溶解、过滤后，上清液经过镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，并用不同浓度咪唑溶液洗脱并收集产物，冷冻干燥后共获得约415mg重组蛋白纯品，发酵液产率为207. 5mg/L,经粉尘螨变应原粗提浸液皮肤挑刺试验阳性的哮喘患儿血清为ー杭，另取5份母亲无遗传过敏史脐血清混合物为阴性血清，二者分装后-80°C保存，生物素标记的抗人IgE抗体为ニ抗,Western-blotting分析表明该重组蛋白可与哮喘患儿血清IgE发生结合,有ー特异性的反应条带。本发明耗时短，过程简单，成本较低，可以彻底去除溶剂等成份,从根本上提高变应原的纯度，避免免疫治疗中副反应的发生，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。
具体实施例方式
本具体实施方式
采用以下技术方案它通过提取粉尘螨总RNA，根据GenBank公布的粉尘螨变应原第I组份(Der fl)和粉尘螨变应原第2组份(Der f2)核酸序列设计引物，用PCR扩增获得其编码基因，依次克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，以PMD19-T-Der
H、PMD 19-T-Derf2为模板，PCR扩增后切胶、回收产物Der fI和Der f2，PCR搭链构建嵌合基因片段，切胶回收产物并命名为Der fm,克隆至pMD19_T载体、亚克隆至表达载体pET-28a (+)并转化至大肠杆菌并用IPTG诱导表达，所有表达产物经琼脂糖凝胶FF亲和柱层析纯化后，用SDS-PAGE和Western-blotting验证产物。所述的粉尘螨变应原第I组分Der Π RT-PCR扩增结果是从RNAiso Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，经两次PCR扩增获得的产物经琼脂糖凝胶电泳，见一条约966bp的条带，与理论值相符合，然后将PCR产物回收，与pMD19-T simple连接后，转化至E. coli Competent Cells JM109中，过夜培养,蓝白斑筛选并提取质粒,用BamH I和XhoI酶切鉴定获得与预期相符的結果，I. 0%琼脂糖凝胶电泳结果，将pET28a(+)-Der fl质粒转化宿主菌E. coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，在临近34kD处出现特异性条带，与预期分子量大小一致，用RNA isolation Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，RT-PCR扩增获得目的基因，经琼脂糖凝胶电泳，见一条约441bp的条带，与理论值相符合，用BamH I/Xho I双酶切测序正确的pMD19-T_Der f2质粒，回收后获得目的基因，将其插入pET28a(+)载体，质粒提取后行琼脂糖凝胶电泳，挑选目的质粒用BamH I/Xho I进行酶切鉴定，有两质粒经1%琼脂糖凝胶电泳显示出两个条带，与预期相符，说明亚克隆获得成功，将pET28a(+)-Der f2质粒转化宿主菌E. coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，pET28a(+)-Der f2全细胞和沉淀物在临近14kD处出现特异性条带，与预期分子量大小一致，说明pET28a(+)-Der f2基因正常表达，但表达为包涵体。所述的粉尘螨变应原第I和2组分嵌合基因片段的扩增结果分别以pMD19-T-DerΠ和为pMD19-T-Der f2模板进行PCR扩增，回收产物Der f I和Der f2后搭链PCR合成得粉尘螨变应原第1、2组分的嵌合基因片段Der fm，使用Sal I/Xho I对测序正确的pMD19-T-Der fm质粒进行酶切，电泳后回收小片段即为Der fm ;使用Sal I/Xho I对pET28a(+)质粒进行酶切，对回收产物进行精制、去磷酸化；通过连接酶将二者连接，热转化至E. coli Competent CellsJM109中，涂布平板，37°C过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒即为pET28a(+)-Der fm，该质粒经Sal I/Xho I双酶切鉴定，将构建成功的原核表达质粒pET28a(+)-Der fm质粒转化宿主菌E. coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，pET28a(+)-Der fm全细胞和沉淀物在约52kD处出现特异性条带，与预期分子量大小相似，说明pET28a-Der fm基因正常表达，但表达为包涵体，从2000mL发酵液收集到菌体，超声波破碎后，离心收集沉淀即为粗制的包涵体， 经洗涤、溶解、过滤后，上清液经过镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，并用不同浓度咪唑溶液洗脱并收集产物从2000mL发酵液收集到菌体，超声波破碎后，离心收集沉淀即为粗制的包涵体，经洗涤、溶解、过滤后，上清液经过镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，并用不同浓度咪唑溶液洗脱并收集产物，冷冻干燥后共获得约415mg重组蛋白纯品，发酵液产率为207. 5mg/L,经粉尘螨变应原粗提浸液皮肤挑刺试验阳性的哮喘患儿血清为ー抗，另取5份母亲无遗传过敏史脐血清混合物为阴性血清，二者分装后_80°C保存，生物素标记的抗人IgE抗体为ニ抗,Western-blotting分析表明该重组蛋白可与哮喘患儿血清IgE发生结合,有ー特异性的反应条带。本发明耗时短，过程简单，成本较低，可以彻底去除溶剂等成份，从根本上提高变应原的纯度，避免免疫治疗中副反应的发生，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。实施例粉尘螨变应原第I组分全长基因克隆与表达所采用的质粒、菌株、试剂和仪器分别为 BamH I 酶、Xho I 酶、RNAiso Reagent (Code No. D312)、One Step RNA PCR Kit (CodeNo. DRR024A)、PrimeSTARTM HS DNA Polymerase (Code No. DROIOA)、Agarose Gel DNAPurification Kit Ver. 2. 0(Code No. DV805)、DNA A-Tailing Kit(Code No. D404)、DNA Fragment Purification Kit Ver. 2. 0(Code No. DV807)、DNA Ligation Kit(CodeNo. D6023)、pMD19_T simple (Code No. D104)、E. coli Competent Cells JM109(CodeNo. D9052)均购自 TaKaRa 公司；pET28a(+) (Kit Lot No. N72770)、TP3000PCR 仪(TaKaRabio inc. )，Mupid 电泳仪(advance-bio Co.，Ltd)，ImageMaster VDS 电泳成像装置
(Pharmacia Biotech)；尘螨主要变应原Der f I克隆和测序a、引物的设计与合成根据GenBankAB034946公布的序列设计引物，并在加入BamH I/XhoI酶切位点b、总RNA提取在解剖镜下挑取粉尘螨约600只，匀浆后用RNAiso Reagent试剂盒提取Total RNA ;c、cDNA合成及PCR 扩增-M Total RNA 为模板、F/R0 为引物，使用 One Step RNA PCRKit，进行 RT-PCR 合成cDNA，反应体系为Total RNA 4μ 1,2XOneStep RNA PCR Buffer 25 μ I、各2.5mM dNTPMixture 2 μl、40u/μ IRNase Inhibitor I μ1>5U/μ I M-MLV Reverse TranscriptaseXL 0·5μ1、5ιι/μ1 Ex Taq I μ l、20pmol/μ I 上游引物 F I μ l、20pmol/μ I 下游引物ROl μ 1，DEPC Η20 14. 5 μ 1，反应条件50°C 30min 反转录，94°C变性 2min 后，98°C 15sec、57 °C 30sec、72°C Imin条件下进行30个循环，72°C 5min延伸，取5μ I产物在含溴化こ锭的I. O %琼脂糖凝胶电泳，用ImageMaster VDS电泳成像装置观察结果并拍照，以上述RT-PCR 产物 I μ I 为模板，以 F/R 为引物，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 进行 PCR 扩增，反应体系2XPrimerSTARTM Buffer 25μ I、各 2. 5mM dNTP Mixture 4 μ 1,2. 5U/μ IPrimeSTARTM HS DNA Polymerase 0. 5 μ I、RT-PCR 产物 I μ I、上游引物 F O. 5 μ I、下游 RO. 5μ I dH20 18·5μ1。反应条件为94°C 变性 5min 后，98°C 10sec、57°C 10sec、72°C Imin条件下进行30个循环，72 °C 5min延伸，取5μ I PCR产物上样电泳，观察目的条带；d、克隆载体构建、阳性克隆筛选及鉴定回收上述PCR产物，加“A”尾、DNA精制后，将目的基因片段与PMD19-T simple连接后，取连接产物转化感受态E. coli JM109，涂布于含氨苄青霉素(100yg/ml)的LB平板上，37°C培养过夜，从含氨苄青霉素的LB平板上随机挑取16个白色菌落，利用载体上的引物进行PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳，含有目的条带的菌落为阳性克隆菌，取阳性克隆后第23bp由C突变为T， 同源性99. 99%，联网到NCBI的ORF finder服务器对此序列进行可读框架分析，结果发现含-个完整的开放读码框，从起始密码子ATG到终止密码子TGA共966bp ;亚克隆及酶切鉴定用BamH I/Xho I双酶切pMD19-T_Der f I质粒，将纯化后的目的基因与pET28a(+)载体连接，质粒提取后行琼脂糖凝胶电泳，挑选目的质粒用BamH I/Xho I进行酶切鉴定,有两质粒经I %琼脂糖凝胶电泳显示出两个条带,与预期相符，说明亚克隆获得成功；将pET28a(+)-Der f I质粒转化宿主菌E. coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，在临近34kD处出现特异性条带，与预期分子量大小一致。粉尘螨变应原第2组分全长基因克隆与表达所采用的质粒、菌株、试剂和仪器分别为 BamH I/Xho I、RNAiso Reagent (Code No. D312)、High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit(Code No. DR027A)、PrimeSTAR_HS DNA Polymerase(Code No. DROIOA)、AgaroseGel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 (Code No.DV805)、DNA A-Tailing Kit (CodeNo.D404)、DNA Fragment Purification Kit Ver. 2. 0(Code No. DV807)、DNA LigationKit < Mighty Mix > (Code No. D6023)、pMD19_TSimple Vector (Code No. D104)、E. coliCompetent Cells JM109(Code No. D9052)、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0 (Code No. DV805)、TaKaRa DNA Ligation Kit < Mighty Mix > (Code No. D6023)、protein marker、E. coli BL21 (DE3) Stratagene 公司生产，pET28a(+) (Kit Lot No. N72770)及 Perfect protein marker,Precision Plus Protein Standards,True bIuePEROXIDASESubstrate, Isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside (IPTG) (Code No. D9030A)>CBB-R250 染色液、TP3000PCR 仪(TaKaRa BIO INC.)，超纯水仪(MILLIP0RE 型)，制冰机，琼脂糖凝胶水平电泳槽及电泳仪，_20°C冰箱，-80°C冰箱，高速冷冻离心机；双稳定菌置于含氨苄青霉素的TB培养液中，37°C振摇培养过夜，取重组阳性克隆，提取质粒DNA，用BamH I和XhoI双酶切鉴定pMDlOT-Derfl重组子，用I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段的大小，以重组质粒DNA为模板；尘螨变应原Der Π原核表达及鉴定a、表达质粒pET28a (+)-Derf I的构建及鉴定用BamHI和XhoI分别对阳性质粒及pET28a(+)载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，用TaKaRa DNA Ligation Kit将目的基因片段和pET28a (+)连接后，热转化至E. coli Competent Cells JM109，37°C培养过夜，挑取单个菌落，提取质粒后行琼脂糖凝胶电泳，对目的质粒行BamH I/XhoI双酶切鉴定；b、重组蛋白的诱导表达取pET28a(+)-DerΠ 阳性克隆 O. 5μ I 转入 Competent cell BL21 (DE3) 100 μ 1，涂布于 LB 平板(LB/抗生素Kana为50 μ 1/450 μ I)上，37 °C摇菌过夜，次日挑取单菌落至2mlLB/抗生素培养液中，37°C摇菌至 0D600nm 值约为 O. 6 O. 8，添加 IPTG50 μ I (final lmmol/L IPTG)，37°C诱导2hr后进行蛋白质抽提，取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)20μ 1，加入20μ 12XSDSsamplebuffer, 95°C加热 lOmin，IO μ I (约 0. IOD)上样进行 SDS-PAGE 电泳，剰余样品 _80°C保存。RNAiso Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，经两次PCR扩增获得的产物，经琼脂糖凝胶电泳，见一条约966bp的条带，与理论值相符合，回收的PCR产物与pMD19-Tsimple连接后,转化至E. coli Competent Cells JM109中，过夜培养,蓝白斑筛选并提取质粒，用BamH I和Xho I酶切鉴定获得与预期相符的結果，将初筛的2个阳性重组菌通过摇菌、质粒提取并纯化，使用引物BcaBESTPrimer M13-47、BcaBEST Primer RV-M对阳性重组质粒测序，去除原始测序结果5’和3’端的酶切位点后，与參考序列相比，其在ATG时电泳仪(DYY-8B);核酸电泳槽(HE-120);蛋白质电泳槽(DYCZ-24D) ImageMaster VDS 电泳成像装置(Pharmacia Biotech)。粉尘螨变应原第2组分全长基因克隆的方法a、根据GenBank(AB195580)公布 的Der f 2CDS序列设计引物，并加入BamH I/Xho I酶切位点，如下上游引物F :5’GGATCCATGATTTCCAAAATCTTGTGCC3’ ；下游引物 R :5’ CTCGAGTTAAT CACGGATTTTACCATGG 3’，解剖镜下挑取粉尘螨(Dermatophagoides farinae)约600只，勻衆后用Takara RNAisoReagent试剂盒提取Total RNA，操作按说明书进行；b、RT-PCR合成Der f2全长基因使用High Fidelity PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Code No. DR027A)进行反转录实验，反应体系TotalRNA 2 μ L、20 μ M 下游引物 R I μ L、各 IOmM dNTP Mixture I μ L、20 μ MRandom 6mersI μ L, RNase Free H20 5 μ L，反应条件65°C 5min后，立即冰上放置2min，然后加入下列组分5 XPrimeScript RTBuffer 4 μ L>40U/ μ L RNase Inhibitor 0. 5 μ L> PrimeScriptRTase (for 2St印)0. 5 μ L、RNase Free dH20 5 μ L，共 20 μ L，置 30°C 10min、42°C 30min、95°C5min，用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Code No. DR010A)进行 PCR 扩增，总反应体系50μ L，组成如下上述转录反应液2μ L、5XPrimeSTAR PCR Buffer 10 μ L、dNTPMixture (2. 5mMeach) 4 μ L、CTB069F Primer (20 μ M) I μ L、CTB069R Primer (20 μ M) I μ L、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/μ L) 0. 5 μ L、dH2031. 5 μ L，反应条件94で预变性3min，98°C 10sec、55°C 15sec、72°C 30sec 条件下进行 30 个循环，72°C IOmin 延伸，取 5yL进行琼脂糖凝胶电泳；c、粉尘螨变应原第2组分基因克隆及测序上述RT-PCR获得的产物全量上样电泳，切胶回收上述PCR产物、上A、精制后，与pMD19-T Simple Vector连接后，热转化至E._coli CompetentCells JM109中，涂布平板，37°C过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒pMD19-T-Der f 2，用BamH I和Xho I双酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段的大小；d、重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE :取原核表达质粒pET28a(+)-Derf 20. 5μ L 转化 CompetentCell BL21 (DE3) 100 μ L 中，取 50 μ L 转化液涂布 LB/抗生素Kana (50 μ g/mL)平板，37°C过夜培养后，挑取单菌落至2mL LB/抗生素培养基中进行种培养，37°C过夜培养，在glass tube中添加5mL LB/抗生素培养基，添加种培养菌液100 μ L，37°C 主培养至 0D600nm 值约为 O. 5-0. 7 时，添加 IOOmM IPTG 50 μ L (final ImM IPTG)，37°C诱导3hr，将主培养后培养液置4°C 3500Xg离心lOmin，收集菌体，取菌体添加PBSBuffer (200 μ L/tube)至50D/mL，悬浊，超声波破碎直至液体透明，取50 μ L为全蛋白样品；残余部分置4°C20000Xg离心lOmin，取上清为可溶性蛋白样品；在沉淀中添加PBS Buffer150 μ L悬浊即得不溶性蛋白样品，取全蛋白、可溶性蛋白、不溶性蛋白样品各IOyL,加Λ 5XSDS sample buffer 2· 5 μ L，95 °C 加热 lOmin，12. 5 μ L 上样进行 SDS-PAGE 电泳，20mA/ 枚，约 90min,使用胶为 12. 5% polyacrylamide gel (12well)，使用 Marker 为 TaKaRaprotein marker (Broad) 5 μ L/well,电泳结束后，CBB-R250染色,使用脱色液脱色；粉尘螨变应原第2组分全长基因克隆的結果a、目的基因的扩増用RNAisolation Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，RT-PCR扩增获得目的基因，经琼脂糖凝胶电泳，见一条约441bp的条带,与理论值相符合；b、克隆载体pMD19-T-Der f 2构建及测序回收 PCR 产物与 pMD19_T simple 连接后,转化至 E. coli Competent Cells JM109 中,过夜培养，蓝白斑筛选并提取质粒pMD19-T-Der f 2，用BamH I和Xho I酶切鉴定，将初筛的2个阳性重组菌通过摇菌、质粒提取并纯化，使用引物BcaBEST Primer M13-47,BcaBESTPrimerRV-M对阳性重组质粒测序，去除原始测序结果5’和3’端的酶切位点后，与參考序列相比，其在328bp处发生“G — A”有义突变引起“天冬氨酸一天冬酰胺”氨基酸突变，382bp处发生“G — A”突变和384bp处发生“T — C”突变引起“缬氨酸一异亮氨酸”，同源性99. 3 %，联网到NCBI的ORF finder服务器对此序列进行可读框架分析，结果发现含ー个完整的开 放读码框，从起始密码子ATG到终止密码子TAA共441bp ;c、原核表达质粒pET28a (+) -Derf 2的构建及鉴定用BamH I/Xho I双酶切测序正确的pMD19-T_Der f 2质粒，回收后获得目的基因，将其插入pET28a(+)载体，质粒提取后行琼脂糖凝胶电泳，挑选目的质粒用BamHI/Xho I进行酶切鉴定，有两质粒经I %琼脂糖凝胶电泳显示出两个条帯，与预期相符，说明亚克隆获得成功。粉尘螨变应原第1、2组分嵌合基因的克隆和原核表达所采用的质粒、菌株、试剂、血清和仪器分别为PMD19-T Simple Vector (Code No. D104)，pET28a (+) (Kit LotNo. N72770)，E. coli Competent Cells JM109(Code No. D9052)，E. coli BL21(DE3)DSal I/Xho I、PrimeSTAR_HS DNA Polymerase (Code No. DRO10A)>Agarose Gel DNA PurificationKit Ver. 2. 0(Code No. DV805)、DNA A-Tailing Kit(Code No. D404)、DNA FragmentPurification Kit Ver. 2. 0(Code No. DV807)、DNA Ligation Kit < Mighty Mix > (CodeNo. D6023) > Dephospharylation Kit (Code No. D403)、prote in marker (Broad)。Isopropyl- β -D-thiogalactopyranoside (IPTG) (Code No. D9030A)、PVDF 膜、Western-blotting膜封闭液、CBB-R250染色液，马抗人IgE抗体，HRP-马抗人IgE结合物，亲和色谱填料镍琼脂糖凝胶FF, TP3000PCR仪(TaKaRa BIO INC.)，超纯水仪(MILLIPORE型)，制冰机，琼脂糖凝胶水平电泳槽及电泳仪，_20°C冰箱，_80°C冰箱，高速冷冻离心机；双稳定时电泳仪(DYY-8B);核酸电泳槽(HE-120);蛋白质电泳槽(DYCZ-24D) ； ImageMaster VDS 电泳成像装置(Pharmacia Biotech)。临床诊断为过敏性哮喘、并经经粉尘螨变应原粗提浸液皮肤挑刺试验阳性患儿5例,分别采集静脉血各5mL，5000g离心5min收集血清，并以其混合物为阳性血清，另取5名母亲无遗传过敏史脐血清混合物为阴性血清，二者分装后_80°C保存。粉尘螨变应原第1、2组分嵌合基因的克隆和原核表达所采用的方法a、粉尘螨变应原第I和2组分基因克隆根据GenBank (Accession No. AB034946)公布的粉尘螨变应原第I组分核酸序列，去除终止密码子设计引物Fl 5/ -GTCGACAAGGCGGTATGAAATTCGTTTTGGCCATTG-3'(下划线为 Sal I 酶切位点)和下游引物 Rl 5/ -AGAGCCACCACCGCCCATGATTACAACATATGGATATT-3 '。以作者保存的pMD 19-T-Der f I质粒为模板进行PCR扩增，反应体系为pMD19-T-Der f I 质粒(1000 倍稀释液)I μ L、5 X PrimeSTAR PCRBufferlO μ L、dNTP Mixture (2. 5mM each) 4 μ L、上游引物 Fl (20 μ Μ) I μ L、下游引物Rl (20 μ Μ) I μ L、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/μ L) 0· 5 μ L、dH20 32. 5 μ し反应条件为94°C变性3min后，98°C 10sec、55°C 15sec、72°C Imin条件下进行30个循环，72°C IOmin延伸，取5yL PCR产物上样电泳，切胶回收产物得Der f I。同理，以GenBank(Accession No. AB195580)公布的Der f 2CDS序列为參考，设计并合成上游引物 5 ' -GGCGGTGGTG GCTCTATGATTTCCAAAATCTTGTGCC-3 '(柔性接头)和下游引物 R2 :5 ' CTCGAGTTAATCACGGATTTTACCATGG 3 '(划线为 Xho I 酶切位点)，以作者保存的 PMD
19-T-Der f 2质粒为模板，用HS DNA Polymerase进行PCR扩增，反应体
系及反应条件同上，取5yL PCR产物上样电泳，切胶回收产物得Der f2;b、PCR合成粉尘螨变应原第I和2组分嵌合基因片段取上述回收产物Der f I和Der f 2，PCR搭链构建嵌合基因片段，反应体系如下Der f I (10倍稀释液)lyL，Der f 2(10倍稀释液)111し5 X PrimeSTAR PCR Buffer 10 μ L、dNTP Mixture (2. 5mM each) 4 μ L、引物 Fl (20 μ Μ) I μ L、引物 R2(20y Μ) I μ L、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2· 5U/μ L) O. 5 μ L 和 dH20 31. 5 μ し反应条件为94°C变性3min后，98°C 10sec、55°C 15sec、72°C I. 5min条件下进行30个循环，72°C IOmin延伸，取5yL PCR产物上样电泳，切胶回收产物并命名为Der fm ;c、嵌合基因Der fm的克隆及测序切胶回收上述PCR产物得Der fm、上“ A”精制后，与pMD19_TSimple Vector 连接,热转化至 E. coli Competent Cells JM109 中，涂布平板,37°C过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒pMD19-T-Der f m，委托宝生物工程(大连)有限公司用BcaBEST Primer M13-47,BcaBEST Primer RV-M通用引物以及本文设计并合成的Rl进行测序；d、嵌合基因Der fm原核表达质粒的构建及鉴定用Sal I/Xho I分别对pMD19-T_Der fm和pET28a(+)质粒进行双酶切，反应体系为质粒pMD19_T_Der f m或pET28a(+) 10 μ L、Sal Ι(10υ/μ L)5y L、Xho I (IOU/ μ L) 5 μ LUO X H Buffer 10 μ L、dH20 70yL，37°C 水浴4h,pET28a(+)质粒经双酶切后，上样电泳并回收目的片段,用DNA Fragment PurificationKitVer. 2. O进行精制、用Dephospharylation Kit将5’末端去磷酸化,全量电泳后切胶回收目的片段，质粒pMD19-T-Der fm双酶切后，电泳并回收小分子片段命名为Insert，用DNA Ligation Kit < MightyMix > 中的连接酶，将 Insert 与 pET28a(+) Vector 连接后，热转化至E. coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37°C过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒并命名为pET28a(+)-Der fm，使用Sal I/Xho I对其双酶切鉴定；e、重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE取原核表达质粒pET28a(+)-Der fm O. 5 μ L转化CompetentCellBL21 (DE3) 100 μ L 中，取 50 μ L转化液涂布 LB/ 抗生素 Kana(50 μ g/mL)平板，37°C过夜培养后，挑取单菌落至2mL LB/抗生素培养基中进行种培养，37°C过夜培养，在glass tube中添加5mL LB/抗生素培养基，添加种培养菌液10(^し37で主培养至0060011111值约为0. 5-0. 7 时，添加 IOOmM IPTG 50 μ L(final ImM IPTG)，37°C诱导 3hr，将主培养后培养液置4°C 3500 X g 离心 IOmin,收集菌体，取菌体添加 PBSBuffer (200 μ L/tube)至 50D/mL,悬池，超声波破碎直至液体透明，取50 μ L为全蛋白样品；残余部分置4°C 20000Xg离心lOmin，取上清为可溶性蛋白样品；在沉淀中添加PBS Buffer 150 μ L悬浊即得不溶性蛋白样品，取全蛋白、可溶性蛋白、不溶性蛋白样品各10 μ L,加入5XSDS sample buffer 2. 5 μ L, 95°C加热lOmin，10 μ L上样进行SDS-PAGE电泳，20mA/枚，约90min，使用胶为12.5%polyacrylamide gel (12welI)，使用 Marker 为 TaKaRa protein marker (Broad) 5 μ L/well,电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色，pET28a(+) vector为负对照进行同样操作；f、重组蛋白的分离纯化取工程菌的穿刺管，在含有Amp(100 yg/uL)的LB琼脂平板上进行划线，37 °C恒温过夜培养活化；次日从平板上挑单个菌落接种于50mL含Amp (100 μ g/UL)的LB培养基中，37°C，250r/min振荡培养过夜，以此作为发酵的种子液df50mL种子液接种到2000mL含Amp (100 μ g/ μ L)的LB培养基置30°C，250r/min振荡培养发酵，当菌液的0D600达到O. 8-1. O时，加入IOOmM IPTG至终浓度为lmmol/L，然后30°C继续培养4h。收集诱导后的菌体，按10ml/g菌体的量重悬于50mmol/L PBS (pH7. 4)中，在冰浴条件下超声波破碎至液体透明。将细胞破碎液以7000rpm/min,4°C离心15min,收集沉淀即为粗制的包涵体；将粗制包涵体用含2mol/L尿素的PBS缓冲液中(pH8. O)洗涤5次，得比较纯净的包涵体；将较纯净的包涵体悬于含8mol/L尿素、5mmol/L DTT的PBS缓冲液(pH 8. O)中，4°C轻微搅拌过夜；1000r/min离心IOmin,上清液经O. 22 μ m滤膜超滤,将此蛋白抽提产物以4. Oml/min流速上镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，用PBS缓冲液以6ml/min流速洗涤2_5个柱床体积，直到洗脱曲线到达基线为止，分别用含25、50、75、100、125、150臟01/1咪唑洗脱液进行阶段洗脱，收集洗脱液，用SDS-PAGE检测其分子量大小和纯度，冷冻干燥后制备成蛋白冻干粉，用梯度透析法进行复性，先用含2mol/L尿素的复性液(50mmol/L Tris-HCL 1 SOmmoI /T, NaCl、lmmol/LGSH、0. 2mmol/L GSSG)透析，再用含 0. 2mol/L尿素的复性液透析，最后用含O. 2mol/L EDTA的PBS透析；g、Western blotting鉴定重组蛋白的变应原性按上述方法进行SDS-PAGE电泳，按阳极、滤纸A、滤纸B、PVDF膜、PAGE Gel、滤纸C、阴极顺序进行转印，将蛋白质转移到PVDF膜，再将PVDF膜置于IOmL Blocking buffer (I. 5%BSA,20mMTri s-HCl (pH8. 0) U50mM NaCl、0· I % Tween)中，4°C 平放过夜封闭，用 Blocking Buffer按I : 1000稀释ー抗哮喘患儿血清混合物(阳性血清)，取5mL抗体溶液置PVDF膜上静置Ih,然后用洗涤 Buffer (含 20mM Tris-HCl 和 150mM NaCl) +0. I % Tween 洗涤 2 次，再用洗漆Buffer冲洗2次去除多余的抗体,取Blocking Bufferl 1000稀释后的ニ抗马抗人IgE抗体5mL置膜上,静置Ih,同前法洗漆去除多余的抗体,用ImL TrueBlue PeroxidaseSubstrate显色lmin，将PVDF膜置于水中终止反应。粉尘螨变应原第1、2组分嵌合基因的克隆和原核表达的结果a、目的基因扩增分别以pMD19-T-Der fl和为pMD19_T_Der f2模板进行PCR扩增，回收产物Der fI和Derf2后搭链PCR合成得粉尘螨变应原第1、2组分的嵌合基因片段Der fm ;b、粉尘螨变应原嵌合基因片段Der fm克隆及测序将回收获得的Der fm基因片段上“ A”、精制后，插入pMD19-T simple Vector,构建重组质粒pMD19_T_Der fm,提取质粒测序,全长为1419bp,其中第l-963bp编码粉尘螨变应原第I组分，第978-1419bp编码粉尘螨变应原第2组分，964-977为本文作者添加的柔性接头；c、原核表达质粒pET28a(+)-Der fm的构建及鉴定使用Sal I/Xho I对测序正确的pMD19-T-Der fm质粒进行酶切，电泳后回收小片段即为Der fm;使用Sal I/Xho I对pET28a (+)质粒进行酶切，对回收产物进行精制、去磷酸化；通过连接酶将二者连接，热转化至E. coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37°C过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒即为pET28a(+)-Der fm，该质粒经Sal I/Xho I双酶切鉴定；d、重组变应原的诱导表达及纯化将构建成功的原核表达质粒pET28a(+)-Der fm质粒转化宿主菌E. coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，pET28a (+)-Der fm全细胞和沉淀物在约52kD处出现特异性条带，与预期分子量大小相似(
图10)，说明pET28a-Der fm基因正常表达，但表达为包涵体。从2000mL发酵液收集到菌体，超声波破碎后，离心收集沉淀即为粗制的包涵体，经洗涤、溶解、过滤后，上清液经过镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，并用不同浓度咪唑溶液洗脱并收集产物，冷冻干燥后共获得约415mg重组蛋白纯品，发酵液产率为207. 5mg/Lば、Western-blotting鉴定重组蛋白变应原性经粉尘螨变应原粗提浸液皮肤挑刺试验阳性的哮喘患儿血清为ー抗,另取5份母亲无遗传过敏史脐血清混合物为阴性血清。二者分装后-80°C保存。生物素标记的抗人IgE抗体为ニ抗。Western-blotting分析表明该重组蛋白可与哮喘患儿血清IgE发生结合,有ー特异性的反应条带。·
权利要求
1.一种生产重组粉尘螨变应原Der Π和Der f2融合蛋白的方法，其特征在于它通过提取粉尘螨总RNA，根据GenBank公布的粉尘螨变应原第I组份(Der Π)和粉尘螨变应原第2组份(Der f2)核酸序列设计引物，用PCR扩增获得其编码基因，依次克隆至pMD19_T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用异丙基_β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，以PMD19-T-Der fl、PMD19-T_Der f2为模板，PCR扩增后切胶、回收产物Der fl和Der f2，PCR搭链构建嵌合基因片段，切胶回收产物并命名为Der fm，克隆至PMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用IPTG诱导表达。所有表达产物经琼脂糖凝胶FF亲和柱层析纯化后，用SDS-PAGE和Western-blotting验证产物。
全文摘要
一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法，它涉及生物学技术构建粉尘螨变应基因技术领域。它通过提取粉尘螨总RNA，用PCR扩增获得其编码基因，切胶回收产物并命名为Der fm，克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用IPTG诱导表达。它耗时短，过程简单，成本较低，可以彻底去除溶剂等成份，从根本上提高变应原的纯度，避免免疫治疗中副反应的发生，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。
文档编号C12R1/19GK102676568SQ201210139240
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者崔玉宝, 杨庆贵, 王运刚, 蔡红星 申请人:崔玉宝, 杨庆贵, 王运刚, 蔡红星