Osbpl2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了OSBPL2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒，OSBPL2突变型基因，其在人的OSBPL2基因序列的第3外显子区第152位核苷酸C和155位核苷酸C之间存在核苷酸C和T的缺失，和/或在人的OSBPL2基因序列在第7外显子区第583位核苷酸C突变为核苷酸A。本发明利用人基因组外显子捕获技术发现遗传性疾病的致病基因。该方法方便、便捷，而且由于只需取一个或少量的基因突变样本进行人基因组外显子序列捕获，大大降低了成本。该基因的鉴定对NSHL的易感和发生人群的基因诊断具有重要价值，对探索NSHL发病机制和开辟新的治疗途径具有重要意义。
【专利说明】0SBPL2突变型基因、其鉴定方法和检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于遗传学、分子生物学，具体涉及遗传性疾病致病基因的鉴定方法，特别涉及遗传性非综合征型耳聋相关基因、其鉴定方法和检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]耳聋是一种较常见的人类感觉系统缺陷，是影响人类健康和造成残疾的常见疾病。耳聋的病因复杂，遗传因素占重要地位，超过60%的先天性耳聋是由遗传因素引起[1_2]。研究表明，分布在细胞核和线粒体中的约有60多个不同类型的基因变异参与了遗传性非综合征型耳聋(Nonsyndromic Hearing Loss, NSHL)的发生,这些基因主要排列在常染色体上，仅少数位于性染色体及线粒体DNA中，他们在耳聋遗传表型传递中，呈现典型的单基因遗传及线粒体母系遗传方式，与听觉功能相关的基因变异已是遗传性NSHL的最主要的分子发病基础[3_4]。由于听觉系统结构、功能的复杂性，涉及听觉相关的基因种类和数量多，至今定位与克隆的NSHL基因与预期的还相距甚远，且在世界范围内不断有新的DFNA大家系被定位及新的基因被发现。因此，对遗传性NSHL基因的定位、克隆及进一步的功能研究仍是任重而道远。
[0003]先前，研究疾病基因主要采取定位候选克隆的方法，通过家系收集和基因组扫描把与遗传病有关的基因定位到图谱的某一区域，然后利用已有数据筛选候选基因。这一过程非常繁琐，致使许多疾病的致病基因虽被定位于染色体某一区域但仍然未被找到。新一代测序技术一“外显子组测序(Exome sequencing)”为疾病基因组学研究开辟了新的方向，相关的研究成果也令人鼓舞。从2009年4月第I篇论文至迄今[5]，已有一系列高水平的相关外显子组测序用 于遗传性疾病的基因研究的报道这些研究表明，外显子组测序技术以其高通量、低成本和高准确率等特点，在疾病基因鉴定方面具有得天独厚的优势。
[0004]发明人采集到一个典型的常染色体显性遗传、迟发型、进行性的NSHL大家系，研究排除了已知的常染色体显性遗传性耳聋致病基因与家系耳聋表型的相关性，认为该家系是由一个新的耳聋基因致病。如果采用传统的单基因遗传性疾病基因的定位方法，由于连锁区域将涉及已知基因、未知基因和预测基因，这将是一个耗时费力的过程。因此，外显子组测序技术结合生物信息学分析、候选致聋基因新突变致病性分析等实现对耳聋性基因的鉴定。
[0005]参考文献:
[0006][I]Cohen MM，Gorlin RJ(1995)Hereditary hearing loss and its syndromes.1n:Gorlin RJj Toriello HVj Cohen MMj editors.1n Origins of Oxford monographs onmedical genetics, No28.New York:Oxford University Press, pp.9-21.[0007][2]Dror AAj Avraham KB (2009).Hearing loss: Mechanisms revealed bygenetics and cell biology.Annu Rev Genet43, 411-437.[0008][3]Keats BJBj Berlin Cl, Gregory P.Epidemiology of Genetic Hearing Loss.Seminars in Hearing, 2006，7:136-147.
【权利要求】
1.一种0SBPL2突变型基因，其在人的0SBPL2基因序列的第3外显子区第152位核苷酸C和155位核苷酸C之间存在核苷酸C和T的缺失，和/或在人的0SBPL2基因序列在第7外显子区第583位核苷酸C突变为核苷酸A。
2.根据权利要求1所述的0SBPL2突变型基因，其特征在于，突变后的人的0SBPL2基因序列的第3外显子区，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；突变后的人的0SBPL2基因序列的第7外显子区，其核苷酸序列如SEQ ID No:9所示。
3.—种重组载体，其含有权利要求1或2所述的0SBPL2突变型基因。
4.一种重组细胞，其含有权利要求3所述的重组载体。
5.一种非综合征型耳聋检测试剂盒，其至少包括:根据0SBPL2基因所有14个外显子及其外显子-内含子交界区序列设计的PCR引物；所述PCR引物用于PCR扩增，其扩增产物包含0SBPL2基因第3外显子区的核苷酸序列和/或0SBPL2基因第7外显子区的核苷酸序列； 所述的PCR引物序列为如下引物对中的至少一对:SEQ ID No: 17和SEQ ID No: 18、SEQ ID No:19 和 SEQ ID No:20、SEQ ID No:21 和 SEQ ID No:22、SEQ ID No:23 和 SEQ IDNo:24、SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26、SEQ ID No:27 和 SEQ ID No:28、SEQ ID No:29 和SEQ ID No:30, SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32, SEQ ID No:33 和 SEQ ID No:34, SEQ IDNo:35 和 SEQ ID No:36、SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38、SEQ ID No:39 和 SEQ ID No:40、SEQ ID No:41 和 SEQ ID No:42、SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ； 其中，引物SEQ ID No:21和SEQ ID No: 22，其扩增产物为OSBPL2基因第3外显子区的核苷酸序列；引物SEQ ID No:29和SEQ ID No:30，其扩增产物为OSBPL2基因第7外显子区的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的非综合征型耳聋检测试剂盒，其特征在于，它包括用于PCR的DNA扩增酶和相应缓冲液。
7.一种遗传性疾病的相关基因的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)利用人基因组外显子捕获和高通量测序技术对采集的遗传性疾病家系的患者以及正常个体全基因组DNA进行外显子捕获和分析，获得候选的遗传性疾病相关基因的突变位占.2)结合常规的测序方法对候选的遗传性疾病相关基因的突变位点进行鉴定: 2A)家系内未参与外显子捕获和测序的其余样本进行遗传共分离验证； 2B)对步骤2A)验证基因的外显子及外显子-内含子交界区的序列进行PCR扩增和检测； 2C)扩大样本量验证，以此鉴定遗传性疾病的相关基因。
8.根据权利要求7所述的遗传性疾病的相关基因的鉴定方法，其特征在于，所述的遗传性疾病为单基因遗传性疾病。
9.根据权利要求8所述的遗传性疾病的相关基因的鉴定方法，其特征在于，所述的单基因遗传性疾病为非综合 征型耳聋。
10.权利要求1或2的OSBPL2突变型基因、或权利要求5所述的试剂盒在制备非综合征型耳聋检测试剂中的应用。
11.一种鉴定OSBPL2突变型基因的方法，其包括以下步骤:1)测定待测样本中0SBPL2基因中外显子和外显子-内含子交界区序列； 2)与野生型相比较，如果存在缺失、替换、插入则认定该基因存在突变； 步骤I)中，采用如下引物中的至少一对分别扩增外显子或外显子-内含子交界区的序列:SEQ ID No: 17 和 SEQ ID No: 18、SEQ ID No: 19 和 SEQ ID No:20、SEQ ID No:21 和 SEQID No:22、SEQ ID No:23 和 SEQ ID No:24、SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26、SEQ ID No:27和 SEQ ID No:28,SEQ ID No:29 和 SEQ ID No:30,SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32,SEQ IDNo:33 和 SEQ ID No:34、SEQ ID No:35 和 SEQ ID No:36、SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38、SEQ ID No:39 和 SEQ ID No:40、SEQ ID No:41 和 SEQ ID No:42、SEQ ID No:43 和 SEQ IDNo:44。
12.根据权利要求11所述的鉴定OSBPL2突变型基因的方法，其包括以下步骤: 1)测定待测样品中OSBPL2基因第3外显子区和/或第7外显子区的序列； 2)OSBPL2基因第3外显子区第152位核苷酸C和155位核苷酸C之间的核苷酸为CT，以及第7外显子区第583位的核苷酸为C，则所述的非综合征型耳聋相关基因为野生型；OSBPL2基因第3外显子的上述对应位置发生CT的缺失，和/或第7外显子区的第583位的核苷酸C突变为核苷酸A，则所述的非综合征型耳聋相关基因为突变型。
13.根据权利要求12所述的鉴定OSBPL2突变型基因的方法，其特征在于，步骤I)中，OSBPL2基因第3外显子的152位核苷酸C和155位核苷酸C之间序列和/或第7外显子583位核苷酸序列的测定采用PCR的方法，所述PCR引物序列如SEQ ID NO:21与SEQ IDNO: 22、SEQ ID NO: 29 与 SEQ ID NO: 30 所示。
【文档编号】C12Q1/68GK103757028SQ201410031860
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】曹新, 邢光前, 魏钦俊, 姚俊, 陈智斌, 鲁雅洁 申请人:南京医科大学, 南京医科大学第一附属医院, 深圳华大基因科技有限公司