用于中和大肠杆菌毒素的寡糖的用途的制作方法

专利名称：：用于中和大肠杆菌毒素的寡糖的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及由病原性大肠杆菌感染引起的腹泻的治疗方法。更具体地说，本发明涉及用于中和与肠道大肠杆菌感染有关的类似志贺氏毒素(SLT)的方法，该方法抑制这种感染发展为溶血尿毒症综合征(HUS)。参考资料下列参考资料在本申请的相关部分中以括弧([])中的数字的方式引用。1．Karmali,M.A等，临床微生物学杂志22:614-619(1985)。2．Head,S.等，感染与免疫58:1532-1537(1990)。3．Samuel等，感染与免疫58:611-618(1990)。4．Altman,D.G.医学研究的实用统计学，第一版，纽约，Chapman和Hall:179-228(1991)。5．Calderwood等，国家科学院院报(USA),84:4364-4368(1987)。6．Jackson等，微生物病原学，2:147-153(1987)。7．Strockbine等，细菌学杂志，170:1116-1122(1988)。8．Robson等，小儿科学杂志，117:675-676(1990)。9．Cimolai等，小儿科学杂志，117:676(1990)。10．Armstrong等，国际专利申请出版物WO93/08209，在1993年4月29日出版的“细菌痢疾的诊断和处理”。11．Lemieux,R.U.等，“与血型路易斯A相关的合成抗原的性质”，美国化学会杂志，97:4076-83(1975)。12．Lemieux,R.U.等，“糖醚酯化合物”，美国专利4,137,401，公开于1979年1月30日。13．Lemieux,R.U.等，“人工寡糖抗原决定簇”，美国专利4,238,473,公开于1980年12月9日。14．Lemieux,R.U.等，“由烯糖合成2-氨基-2-脱氧葡萄糖和2-氨基-2-脱氧配糖物”，美国专利4,362,720，公开于1982年12月7日。15．Cox,D.等“4-O-α-D-吡喃半乳糖酰-D-半乳糖-吡喃糖的一种新的合成方法”，Carbohy.研究，62:245-252(1978)。16．Dahmln,J.等，“血型pk抗原的三糖部分[α-D-Gal-(1-4)-β-D-Gal(1→4)-β-D-Glc]的间隙臂、脂及乙基糖的合成糖原异蛋白质的制备”，糖研究，127:15-25(1984)。17．Garegg,P.J.等，“8-甲氧羰基辛-1-基O-α-D-吡喃半乳糖(1-3)-O-β-D-吡喃半乳糖(1-4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷的合成”，糖类研究，136:207-213(1985)。18．Garegg,P.J.等，“用于研究肾盂肾炎产生的缨状大肠杆菌对尿上皮细胞表面的粘着的抑制作用的甲基4-O-α-D-吡喃半乳糖-β-D-吡喃半乳糖苷的6-和6’-脱氧衍生物的合成”，糖类研究，137:270-275(1985)。19．Jacquinet,J.C.等，“血型物质的合成，第11部分，三糖O-α-D-吡喃半乳糖-(1-3)-O-β-D-吡喃半乳糖-(1-4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖的合成”,J.CS.Perlin,I:326-330(1981)。20．Koike,K.等，“Globotriaosyl-E和Z-酰基鞘氨醇和Isoglobotriaosyl-E-酰基鞘氨醇的完全合成”，糖研究，163:189-208(1987)。21．Schaubach,R.等，“与瘤有关的抗原合成Gal-α-(1-3)-Gal-β-(1-4)-GlcNAc表位的合成，转移性行进的特异性测定物？”,Liebigs化学年刊，607-614(1991)。22．Ratcliffe,RM.等，“唾液酸糖、抗原、免疫吸附剂及用于制备它们的方法”，美国专利5,079,353，公开于1992年1月7日。23．Okamoto,K.等，“唾液酸的糖化”，四面体，47:5835-5857(1990)。24．Abbas,S.A.等，“与瘤有关的寡糖Ⅰ:Sialyl-Lewis抗原决定簇的合成”，唾液酸，日-德Symp.柏林学报22-23(1988)。25．Paulsen，“选择性化学合成复杂寡糖的进展”，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.,21:155-173(1982)。26．Schmidt，“用于合成糖和寡糖的新方法，即，有替代Koenigs-Knorr的方法吗？”，Angew.Chem.T.Ed.Eng.,25:212-235(1986)。27．Fiigedi,P.等，“在寡糖合成中作为糖基化试剂的巯基糖”，糖轭合物杂志，4:97-108(1987)。28．Kameyama,A.等，“sialylLewisX的全部合成”，糖研究，209:cl-c4(1991)。29．EkborgG.等，“用于制备具有已知存在于糖蛋白的免疫决定簇的免疫原的三种二糖的合成”，糖研究，110:55-67(1982)。30．DahmCn.J.等，“2-溴甲基糖在间隔臂糖合成中的应用”，糖研究，118:292-301(1983)。31．Rana,S.S.等，“苯基2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-α-L-岩藻糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷及有关化合物的合成”，糖研究，91:149-157(1981)。32．Amvam-Zollo,P.等，“肺炎双球菌型ⅩⅣ多糖具有Dioxa型间隔臂的重复分支的四糖的合成”，糖研究，150:199-212(1986)。33．Paulsen,H.,“合成冯寡糖定子套(von-determinantenmit)的中间间隔臂vom型重氢T抗原”，糖研究，104:195-219(1982)。34．Chemyak,A.Y.等，“一种包含合成抗原的新型糖包含聚丙烯酰胺异分子聚合物、具有0∶3和0∶4的沙门氏菌属因子特异性的糖的合成”，糖研究，128:269-282(1984)。35．Fernandez-Sanrana,V.等,“单丙烯基二乙烯乙二醇糖，一种新型的合成寡糖的间隔区基”，糖化学杂志，8(3):531-537(1989)。36．Lee,R.T.等，“3-(2-氨乙基硫)丙基糖”，糖研究，37:193-201(1974)。37．Cannon等，遗传微生物杂志，136:1125-1135(1990)。38．Weinstein等，细菌学杂志，170:4223-4230(1988)。39．Ito等，微生物病原学，8:47-60(1990)。40．Head等，FEMS微生物通讯，51:211-216(1988)。41．Schmitt等，感染免疫学，59:1065-1073(1991)。42．Scotland等，Lancet,ⅱ:885-886(1991)。43．Clot等，微生物病原学，6:113-122(2989)。44．Boyd等，肾单位，51:207-210(1989)。45．DeGrandis等，生物化学杂志，264:12520-12525(1989)。46．Waddell等，生物化学生物物理学研究通讯，152:674-679(1988)。47．Lingwood等，生物化学杂志，262:8834-8839(1987)。48．Waddell等，国家科学院院报(USA),87:7898-7901(1990)。49．Cohen等，生物化学杂志，262:17088-17091(1987)。50．Jacewicz等，实验医学杂志，163:1391-1404(1986)。51．Lindberg等，生物化学杂志，262:1779-1785(1987)。52．Armstrong,G.D.等，感染与免疫，55:1294-1299(1987)。53．Armstrong,G.D.等，感染疾病杂志，164:1160-1167(1991)。上述公开的出版物、专利及专利申请本文全部以相同程度一并参考，如同每个单个的出版物、专利及专利申请特别地和个别地包括在本文中一样。技术状况已发现由病原性大肠杆菌菌株引起的腹泻与各种肠毒素的产生有关。一些病原性大肠杆菌产生肠毒素，此毒素与志贺菌毒素密切相关，志贺菌毒素与造成志贺氏菌的痢疾有关。要分离的类似志贺氏毒素(SLT)族的第一种成分是非洲绿猴(Vero)细胞的细胞毒素，且最初称为vero细胞毒素。自从它与志贺菌毒素的结构相似性通过有关基因测序建立后，现在更普遍地称这种毒素为志贺样类似毒素I(SLTⅠ)[5,6,7]。以后，已分离出SLT族的其它成员，基于基因序列或对宿主的特异性[37-43]，这些成员在血清学上是可区别的。已描述了各种类型的SLTⅡ，并已依据从中分离的它们的大肠杆菌菌株和所感染的宿主指定了各种名称。因此，变体已指定为SLTⅡ、vtx2ha、SLTⅡvh、vtx2hb、SLTⅡc、SLTⅡVp等。所有的SLT是由酶促(A)亚基和复合(B)亚基组成的多聚体蛋白质。B寡聚体是毒素的结合部分，这使得毒素可结合宿主细胞受体。SLTⅠ、SLTⅡ和SLTⅡVh的B亚基识别宿主细胞的红细胞族(globoseries)糖脂受体，该受体在非还原性末端包含最小二糖亚单位αGal(1→4)βGal；SLTⅡvp已显示结合包含这种亚单位但对非还原性末端[2,44-51]不是必要的受体。这种A亚单位具有在哺乳动物细胞中脱去28核糖体RNA的脱嘌呤酶促活性(N-糖甙酶)。这种酶促活性消除毒素感染细胞的能力，以完成蛋白质的合成。SLT的作用位点是肾和肠系膜脉管系统中发现的内皮细胞，SLTs可造成破坏，此破坏可导致肾部衰竭和尿血红蛋白。SLTs在溶血尿毒症综合征中是病原体。SLTs也可部分地与出血性结肠炎(血液腹泻)病理有关。溶血尿毒症综合征(HUS)在儿童期是急性肾部衰竭的主导因子，且在以大肠杆菌0157:H7和其它大肠杆菌产生的vero毒素/志贺氏毒素类似物(VTEC)感染后5-10天影响大约7-10％的儿童。关于这类病原性大肠杆菌，最近的注意力已集中于某种肉的大肠杆菌污染和摄入这种肉后在人类中的随后感染的已知的相互关系。关于肉饼肉的问题特别紧急，摄入肉饼中未熟的肉已发现是感染的病原体。这种问题与事实符合，该事实是病原性大肠杆菌感染通过SLTs的表达迅速发展为HUS表明肠道的初始移生后为内皮的伤害以及随后通过SLT毒素的跨膜传递进入受感染个体的血液流介入肾的假说。由于复杂的因素，技术人员建议在肠出血性大肠杆菌感染[8]的治疗中不利用抗生素。抗能动性药物的利用看来似乎也是无益的[9]。一种已报导的用于治疗这类感染的方法是口服药物惰性亲和性支持体，该支持体包含对感染的患者有用的αGal(1→4)βGal亚单位[10]。这种支持体通过患者的肠道，因而αGal(1→4)βGal亚单位结合志贺样毒素。其后，把结合到这种固体支持体上的毒素作为部分粪从身体除去。这种方法是首先(如果不是仅有的话)报导的用于从身体中除去这类毒素(其依次抑制与毒素积累有关的疾病的出现)的方法之一。尽管，由这种报导的方法产生了显著的进步，但还需要对肠出血性大肠杆菌感染的治疗进行改进，以降低HUS的发生率及与其相联系的高死亡率水平。发明概要本发明涉及令人惊奇而意想不到地发现肠出血性大肠杆菌感染引起的HUS的临床发生率被一种药物组合物的及时施用显著地降低，该组合物包含药物惰性亲和性支持体，该支持体包含一种结合SLT的αGal(1→4)βGal亚单位。具体地说，现已发现当这种药物组合物在感染出现的3天内施用时，肠出血性大肠杆菌感染引起的HUS的临床发生率显著地降低。相反，这一时间范围后或当非肠的器官受感染时，施用这种药物组合物实质上降低这种组合物降低HUS发生率的能力。因此，在该方法的一个方面，本发明涉及抑制患者中溶血尿毒症综合征发展的方法，该溶血尿毒症综合征起因于由志贺氏类似物毒素介导的肠出血性大肠杆菌感染，该方法包括对所说的患者施用有效量的一种药物组合物，其中所说的药物组合物包含含有αGal(1→4)βGal亚单位的药物惰性亲和性支持体，其中所说的亚单位通过非肽基接头臂结合到所说的支持体上，且该亚单位结合SLT毒素，其中在感染出现的大约3天内施用这种药物组合物。在一个优选的实施方案中，在非肠器官受到感染之前，对患者施用该药物组合物。就本发明而言，鉴定至少一种与大肠杆菌感染介导的SLT联系的疾病后，确定感染的出现。例如，这类疾病包括患者具有腹泻和下列之一腹腔阻碍、粪中有血、肠下垂、在患者粪中检测到产生vero毒素的大肠杆菌；摄入怀疑包含产生vero毒素的大肠杆菌的食品或与已知具有SLT介导的感染的个体密切接触。优选地，感染的出现由带血的腹泻显示。具体地说，在一个优选的实施方案中，个体由于SLT介导的大肠杆菌感染的痛苦的初始临床评估通过粪的诊断评估确认。一种商业上的用于诊断SLT介导的大肠杆菌感染的诊断工具由Meridian诊断公司，Cincinnati，俄亥俄，美国45244，以商品名PremierEHEC出售。另一方面，本发明提供了一种抑制患者中溶血尿毒症综合征发展的方法，所说的综合征是由志贺氏样毒素介导的肠出血大肠杆菌感染引起的，该方法包括对所说的患者施用有效量的药物组合物，其中所说的药物组合物包含含有选自αGal(1→4)βGal、αGal(1→4)βGal(1→4)βGlcNAc和αGal(1→4)βGal(1→4)βGlc的寡糖的药物惰性亲和性支持体，其中寡糖通过非肽基接头臂结合到所说的支持体上，其中在感染出现的大约3天内施用这种药物组合物。在一个优选的实施方案中，在非肠器官受到感染之前，对患者施用该药物组合物。附图简要描述图1A和B表明就细菌提取物在存在和缺乏各种SYNSORBs时杀死Vero细胞的能力而言，利用聚堆囊粘菌素N-B获得的细菌提取物的毒性。图2A和B表明就细菌提取物在存在和缺乏各种SYNSORBs时杀死Vero细胞的能力而言，利用溶菌酶获得的细菌提取物的毒性。图3A表明如10mg那样少量的Pk三糖SYNSORB可从细菌提取物中除去＞90％的SLT毒素。图3B表明SLT毒素的结合发生在提取物与PkSYNSORB混合的5分钟之内。图4表明利用各种洗脱剂从各种SYNSORBs洗脱结合的I125标记的SLTⅠ的困难性。图5表明在仅有如10mg那样的少量Pk三糖SYNSORB存在下，通过Vero细胞和SLT提取物共温育三天，＞90％的SLTⅠ、SLTⅡ/Ⅱc和SLTⅡ活性得到中和。优选实施方案的描述如上所述，本发明涉及用于中和与肠大肠杆菌感染有关的志贺氏类似物毒素(SLT)的方法，该方法抑制这种感染发展为溶血尿毒症综合征(HUS)。然而，在进一步详细讨论本发明前，首先将定义下列术语A．定义本文所使用的下列术语具有下列意义术语“志贺氏类似物毒素”或“SLT”或“vero毒素”指由肠出血性大肠杆菌产生的一组毒素，这些毒素如本领域通常所了解的，类似于Shigella产生的志贺氏毒素。这些毒素包含具有酶促活性A亚单位和多聚体受体结合B亚单位。这类SLTs包括SLTⅠ和各种本领域命名为SLTⅡ的一组毒素。SLTs迅速紧密地结合到P1二糖、P1三糖或Pk三糖上由本文包含的vero细胞毒性中和试验说明。术语“器官受到感染”指临床上规定的由与疾病的天然发展相互关联的SLTs介导的器官感染。作为例子，非肠其它器官包括肾、心脏、中枢神经系统(“CNS”)元件(即，脑、脊髓等)、肝及类似器官。常规血液化学检验可评价肝、心脏及肾的感染，而临床症状(包括痴呆、大笑、迷失方向等)用于测定CNS的感染。如果有肾损伤和溶血作用或血小板降低，则认为“溶血尿毒症综合征”存在。肾损伤要求血清肌酸酐浓度的上升(要求小于5年内＞50μM或在5-6年内＞60μM)或在疾病的急性阶段期间记录的肌酸酐值(即，在尿显微镜上红细胞超过50％或每个高能区至少10个红细胞)不同。如果血红蛋白浓度≤105g/L或如果在血涂片上有红细胞片段或如果在血红蛋白降至105g/L之前进行红细胞输血，则认为溶血作用存在。血小板降低规定为＜150×109/L的血小板浓度。术语“生物学上相容的”指对动物或人组织或体液而言的化学惰性。生物学上相容的材料是非敏感性的。术语“可相容的接头臂”指一种组分，该组分用于分隔来自生物学上相容的固相支持体的寡糖结构，且是双功能的，其中一种官能团能够共价结合到该支持体的交互的官能团上，其它官能团能够结合到寡糖结构的交互的官能团上。本发明中优选的可相容的接头臂是非肽接头臂。这就是说接头臂不利用肽基将寡糖结构连接到固相支持体上。术语“固相支持体”指一种惰性的固体材料，寡糖序列通过一种可相容的接头臂结合到其上面。只要用于体内，该固相支持体将是生物学上相容的。本发明的寡糖结构结合到上面的固相支持体可以是颗粒的形式。大量各种生物学上相容的固相支持体材料在本领域是已知的。其例子是二氧化硅、合成硅酸盐(如多孔玻璃)、生物来源的硅酸盐(如硅藻土)、包含硅酸盐的矿物(如高岭石)以及合成聚合物(如聚苯乙烯、聚丙烯和聚糖)。由无机材料制成的固相支持体是优选的。优选地，体内利用的固相支持体具有大小约10至500微米的微粒。尤其优选的是具有100至200微米大小的微粒。术语“SYNSORB”指共价偶连在衍生化的硅石微粒CHROMOSORBPTM(Manville公司，Denver,Colorado)[11]上的合成8-甲酯基患籽跫柞辛基寡糖结构。共价连接于生物学上相容的固相支持体(例如，CHROMOSORBPTM(SYNSORB))上的合成寡糖序列可用于结合SLT毒素或vero毒素。这些组合物对抑制HUS和有关的疾病是有用的。SYNSORB是这些组合物中特别优选的，因为它是非毒性的，且能抵抗机械的和化学的分解。已发现SYNSORBs不受影响地穿过大鼠胃肠道。已发现在口服施用后，完全而迅速的除去它们(在72小时内99％的除去)。另外，SYNSORB中高浓度的寡糖组分特别利于结合vero毒素。对本申请而言，利用常规的三字母命名法命名所有提及的糖。除岩藻糖是L型外，除非指明，所有糖都假定为D型的。此外，所有糖都是吡喃糖型的。优选地，用于间接键合的连接组分是适当长度(至少一碳原子)的有机双功能分子，该分子只用于从固相支持体的表面隔开寡糖结构。本发明的组合物优选地由式(寡糖-Y-R)n-固相支持体表示，其中，寡糖包含αGal(1→4)βGal亚单位，并含有至少2个二糖单位，优选地为小于6个的糖单位，由此单位，寡糖结合到志贺氏类似毒素上，Y是氧、硫或氮，R是至少1个碳原子的糖苷配基连接臂，固相支持体是如上定义的，n大于或等于1。优选的糖苷配基是从1至大约10个碳原子。可利用包含大约2至10个糖单位的寡糖序列。具有大约2至3个糖单位的序列是优选的。优选地，n是使组合物含有大约0.25至2.50微摩尔寡糖/克组合物的值。许多糖苷配基连接臂在本领域是已知的。例如，一种包含对硝基苯基的连接臂(即，-OC6H4pNO2)已公开[29]。在合成过程中适当的时间，把硝基还原为可作为N-三氟醋酸酰氨基保护的氨基基团。在连接到支持体前，除去此三氟醋酸酰氨基，由此暴露出氨基基团。已公开了一种包含硫的连接臂[30]。具体地说，连接臂衍生自2-溴乙基基团，该基团与巯基亲核试剂的取代反应中，已显示导致产生具有各种末端官能团(如-OCH2CH2SCH2CO2CH3和-OCH2CH2SC6H4-pNH2)的连接臂。这些末端官能团使得与固相支持体上的互补官能团反应，因此，形成与固相支持体的共价连接。这类反应在本领域是众所周知的。已公开了6-三氟醋酸酰氨基-己基连接臂(-O-(CH2)6-NHCOCF3)[31]，其中三氟醋酸酰氨基保护基可除去，以暴露用于偶连的起始氨基基团。其它已知的连接臂的例子包括7-甲酯基患籽跫柞-3,6，二氧庚基连接臂[32](-OCH2-CH2)2OCH2CO2CH3)、2-(4-甲酯基患籽跫柞丁基羟酰氨基)乙基[33](-OCH2CH2NHC(O)(CH2)4CO2CH3)、烯丙基连接臂[34](-OCH2CH=CH2)，该烯丙基连接臂通过自由基与一适当单体的共聚合产生共聚体；其它烯丙基连接臂[35]已知为(-O(CH2CH2O)2CH2CH=CH2。此外，烯丙基连接臂可在2-氨基乙硫醇[36]存在时衍生，以提供一种连接臂-OCH2CH2CH2SCH2CH2NH2。其它合适的连接臂也已公开[12-14、16、17]。优选地，糖苷配基连接臂是疏水基团，最优选地，糖苷配基连接臂是选自-(CH2)8C(O)-、-(CH2)5OCH2CH2CH2-和-(CH2)8CH2O-的疏水基团。非肽连接臂优选的用作本发明的可相容的连接臂。糖肽的使用不是理想的，因为糖肽经常含有几个不同的与相同蛋白质连接的寡糖。大量获得糖肽也是困难的，且需要昂贵而乏味的纯化。同样地，例如，当口服施用时，由于在胃肠道中可疑的稳定性，BSA或HSA辍合体的使用也不理想。用于进行本发明方法的组合物包含αGal(1→4)βGal二糖亚单位，此亚单位可单独利用或与较高的寡糖(例如，αGal(1→4)βGal(1→4)βGlcNAc三糖或αGal(1→4)βGal(l→4)βGlc三糖)结合利用。优选地，αGal(1→4)βGal二糖亚单位在寡糖的非还原性末端发现。优选地，通过如由Lemieux等描述的[11]连接臂，把寡糖偶连或直接偶连到固相支持体。二糖和三糖单位也可直接与药学上可接受的载体偶连或构成与这类载体偶联的寡糖的组分。B．合成用于合成寡糖结构的化学方法可通过本领域已知的方法完成。这些材料通常利用适当保护的单个单糖组装。通常利用的特定的方法适应于每一要合成的个体结构并且是优化的。一般来说，全部或部分化学合成寡糖糖苷首先包括在还原性糖或单糖的端基异构碳原子形成糖甙键。具体地说，把天然存在或化学修饰的糖类结构(糖基供体)的适当保护形式选择性地在还原性单位的端基异构中心修饰，以引入包含卤化物、三氯乙酸味唑(trichloroacetimidate)、乙酰基、硫糖苷等的遗弃基团。然后，把供体在本领域众所周知的催化条件下与糖苷配基或糖受体的适当的形式反应，其中所说的糖受体在糖苷连接将要建立的位置具有一游离羟基基团。许多种糖苷配基组分在本领域是已知的，并可以适当的构型连接到还原单位的端基异构中心上。本领域众所周知的糖合成的可容性阻断基团的适当利用将使得可以选择性修饰合成的结构或进一步对受体结构连接附加的糖单位或糖阻断。在糖苷连接形成后，糖苷可用于影响附加糖单位的偶连或选择性位置的化学修饰；或在常规脱保护后，可用于酶促合成。一般来说，化学偶连天然存在的或化学修饰的糖单位到糖苷通过使用已出版的文献[12-28]中充分建立的化学方法完成。寡糖结构是共价结合或非共价(被动)吸附在固相支持体上。共价结合可以是通过支持体上的官能团和寡糖结构的可容性接头臂之间的反应。利用本领域已知的方法[11,12]制造包含αGal(1→4)βGal亚单位的惰性亲和性支持体如下，其中所说的亚单位通过本发明的方法中利用的非肽接头臂结合到所说的支持体上。在每种情况下，把各个半抗原的8-甲酯基患籽跫柞辛基糖苷活化并连接到甲硅烷氨化的固相支持体上，其中，基质包括SiO2，接着乙酰化固相支持体上的剩余胺基团。这些配方是P1-di，其含有至少0.60μmol/gαGal(1→4)βGal二糖；P1-tri，其含有至少0.91μmol/gαGal(1→4)βGal(1→4)βGlcNAc三糖；Pk-tri，其含有至少0.74μmol/gαGal(1→4)βGal(1→4)βGlc三糖。C．药物组合物本发明的方法通过利用包含连接到固相支持体上的一种或多种寡糖结构的药物组合物完成，其中所说的寡糖结合SLT毒素和/或vero毒素。当用于口服时，这是优选的，这些组合物可以各种方法配制。优选地，将是液体或半固体形式。包括液态的药物惰性载体(如水)的组合物可认为用于口服施用。其它药学上可相容的液体或半固体也可利用。这类液体和半固体的用途对本领域技术人员是众所周知的。可与半固体食品(如苹果汁、冰激凌或布丁)混合的组合物也可以是优选的。配方(如SYNSORBs)没有不适宜的味道或回味是优选的。鼻胃管也能用来传送组合物直接进入胃部。固体组合物也可以利用，并且可选择性的方便地用于包含一种(包括常规的固体载体(如乳糖、淀粉、糊精或硬脂酸镁))的制剂，这些制剂方便地以药片或胶囊形式出现。SYNSORB本身也可在不加入药物惰性载体时利用，特别以胶囊形式利用。当使用一种药物惰性载体时，该载体典型地以基于组合物总重量的大约1-99％的量使用，更优选地，以大约75％至大约95％的重量百分比使用。选择剂量以提供SLT毒素的中和并除去，和/或除去受感染的患者肠中发现的大肠杆菌。优选的剂量是大约0.25至1.25μmol寡糖/kg体重/天，更优选地为大约0.5至1.0μmol寡糖/kg体重/天。利用上述的SYNSORB组合物时，大约0.5至1.0克SYNSORB/kg体重/天，这给出肠中大约20mg/ml的SYNSORB浓度。预期每日施用2至4次，优选地共施用一周。当然，施用的特定剂量水平与进度将依据每一个体的因素(如所使用的特殊的寡糖结构、年龄和受治疗者的疾病、疾病的严重程度)而变化，所有这些都在本领域技术人员的知识范围内。在多达七天的时期内，施用包含本发明的组合物的寡糖将利于治疗与SLT有关的腹泻及相关的疾病。如前所讨论的，口服施用是优选的，但制剂也可以其它方式施用，如通过直肠。这些制剂的有效性可取决于所利用的特殊组合物及接收治疗的特定受治疗者。这些制剂可含有一种液态载体(它可以是油状的、含水的、乳化的)或含有一定的适于施用方式的溶剂。组合物可以单位剂量形式或以多单位或亚单位剂量形式配制。对于前述的预期剂量，口服施用的液态组合物优选地应含有大约1微摩尔寡糖/毫升。D．方法SLT毒素可由寡糖序列中和，该序列包含αGal(1→4)βGal亚基，且该序列结合毒素。具体地说，这类通过非肽的可相容接头臂共价连接到固相支持体的寡糖序列已发现可有效地中和SLT毒素。这类组合物的例子是某些的SYNSORBs，它们结合并中和SLT毒素活性。通过8-甲酯基患籽跫柞辛基(MCO)间隔臂连接到ChromosorbP的几种寡糖序列中和SLT毒素的能力已检验。连接到在本发明中有用的固相支持体上的寡糖序列包括那些结合SLT毒素的序列。寡糖对SLT毒素的结合亲和性通过一种简单的体外检验是容易检测的，例如，如以下实施例1中所述的。就本发明而言，结合到固相支持体(其结合SLT毒素)上的寡糖序列指那些组合物，利用实施例部分中所述的测定，这些组合物从vero细胞测定中的细胞毒性活性以至少50％，优选地至少95％降低终点滴度。其它在本发明中有用的连接到固相支持体的寡糖序列是比对照支持体可显著更好地结合SLT毒素(p≤0.05，利用适合的标准统计方法，如Wilcoxon或Student’sT检验)的那些，其中所说的对照支持体不含有任何连接的寡糖序列(例如，CHROMOSORBP)。本发明的组合物中和SLTs的效果可通过比较以该组合物治疗或不治疗后SLT的活性测定。SLTs的活性可通过利用这些化合物对Vero细胞的毒性测定。Vero细胞(ATCCCCL81)可从美国典型培养物保藏中心，RockvilleMD获得。以本发明的方法，现已发现当以上所述的药物组合物在感染出现的3天内并在非肠器官受到感染之前施用时，由肠出血性大肠杆菌感染引起的HUS的临床发生率降低。反之，当非肠的其它器官感染的这一时间之后施用这种药物组合物时，实质上降低这种组合物降低HUS发生率的能力。优选地，个体受SLT介导的大肠杆菌感染的折磨的初始临床评估通过粪的诊断评估确认。一种商业上可得的用于检测SLT介导的大肠杆菌感染的诊断工具由MeridianDiagnostic公司，Cincinnati,Ohio,USA45244以商品名PremierEHEC出售。如从以上公开的内容可知，本发明具有各种广泛的应用。因此，下列实施例以描述的方式而不是以限制的方式提供。实施例在以下实施例中，所有的温度以摄氏度给出，下列缩写有下列含义。如果以下没有规定，那么缩写具有它们本领域规定的含义。ASA=乙酰化的甲硅烷氨化的疏水8-甲酯基患籽跫柞辛基连接臂BSA=牛血清清蛋白cm=厘米dpm=每分钟衰变EDTA=乙二胺四乙酸g=克HUS=溶血尿毒症综合征kg=千克L=升LPS=脂多糖M=摩尔MEM=基本Eagles培养基mg=毫克mL=毫升min.=分钟mm=毫米nm=纳米PBS=磷酸缓冲盐水pg=微微克SDS=十二烷基硫酸钠SLT=志贺样毒素μg=微克μL=微升μmol=微摩尔在以下实施例中，实施例1-3来自Armstrong等[10]，并包括在本文中，以说明包含αGal(1→4)βGal亚单位的寡糖具有类似的体内性质。以下实施例4表明了Pk三糖的体内结果，且表明施用该组合物的时间对降低HUS发生率的影响。实施例1．SYNSORB-Vero细胞毒性的中和试验把产生SLTⅡ/SLTⅡc的大肠杆菌菌株0157:H-(E32511)和仅产生SLTⅠ的026:H11(H19)或仅产生SLTⅡ的菌株C600(933W)在37℃下，在胰蛋白酶的酱油肉汤(Difco，底特律，MI)琼脂平板上生长过夜。如前所述制备多粘菌素和溶菌酶提取物[1,2]。设计第一个中和测定以检验SYNSORBs从大肠杆菌提取物在室温下在1.5ml微离心管(Fisher)中，与2-50mgSYNSORB在连续循环的旋转仪上达30分钟，吸收SLT活性的能力。然后，把管子从装置除去，把SYNSORB安置到底部(几秒)后，以未补充的MEM制备吸收提取物的系列5倍稀释液。把二十(20)μL每种稀释液加至包含Vero细胞的96孔微滴定平板中适当的孔中。未加入SYNSORB的细菌提取物作为对照。一旦细胞毒性影响变得明显(在温箱中2至3天)，把生长培养基从每孔吸出，并把保持活性的Vero细胞以95％甲醇固定，以Giemsa染色剂(Fisher)染色。然后，如前[3]所述，利用微滴定板读数装置，以620nm的波长记录结果。然后，将吸收数据对抽提物稀释液的对数作图。导致单分子层50％致死(CD50)的提取物稀释液通过从导致Vero细胞致死的曲线推知确定。除非特别表明，通常单个试验完全相同的进行，至少重复两次。中和的百分比从方程式100-(100[CD50寡糖SYNSORB处理的提取物+CD50乙酰化的甲硅烷氨化的(ASA)SYNSORB处理的提取物]计算。利用两个尾的统计学T，无参数的Mann-Whitney检验用于计算独立观察组[4]间差别的显著水平。设计第二个中和测定(共温育测定)以检验Pk三糖SYNSORB在37℃下超过3天后，从SLT活性保护Vero细胞的能力。这种测定包括在每个包含2、5或10mgPk三糖SYNSORB、乙烯氧化物灭菌的1.5mL微离心管中，温育180μL多粘菌素提取物的系列五倍稀释液。与SYNSORB温育1小时后，把每个微离心管的全部内容物加到如上述制备的微滴定板中的Vero细胞单分子层。然后，把微滴定板在37℃下温育3天，如上所述记录实验结果(图1和2)。利用Pk-三的变化量和各种温育的时间，重复前述的测定，结果如图3A和3B显示。如图3A表明的，如5mgSYNSORB少的量能够中和E32511和H19两种菌株提取物的活性；同样，如图3B表明的，仅需要约5分钟的温育达到任一抽提物的这种结果。实施例2碘化的SLTⅠ结合测定把纯化的SLTⅠ在12×75mm酸洗涤的以40μgIodoGen(Pierce化学公司，Rockford,Illinois，美国)涂布的玻璃培养试管中碘化。把大约6μg纯化的SLTⅠ与20MBq125-I标记的碘化钠在100μLPBS中温育1分钟。把反应混合物穿过羊毛塞住的玻璃巴斯德移液管至200μLPBS，该试管如由Armstrong,G.D等[52]描述，PBS中包含半胱氨酸的溶液(1mg/mL)。1分钟之后，把200μL包含1％BSA的PBS加至混合物，并把碘化的SLTⅠ通过穿过PBS中具有0.1％的BAS的一个1cm×30cm的Sephadex-G25凝胶过滤柱纯化。碘化反应的效率通过测定掺入三氯乙酸沉淀的蛋白质的数量测定。把碘化的SLTⅠ的等分样在-90℃保存。试验在包含0.15％BSA的PBS中进行，以降低非特异性结合。把2mgSYNSORB在连续循环的旋转仪上与大约20,000dpm上述制备的碘化的SLTⅠ(在0.5mLPBS/BSA中，在Vero细胞毒性测定中，特异性活性2.2×107dpm/μg,CD50为0.4pg/mL)一起温育30分钟。然后，以3×1mL部分PBS/BSA洗涤SYNSORB以除去未结合的量。衍生的SYNSORB以LKBRackgamma型1270Gamma计数器计算。同样，ASA也利用这种材料的作用测定。结果在表1中显示表1SYNSORB％结合的SLTTPk-三93ASA5结合至Pk-三糖SYNSORB的SLT可用0.1M乙酸、6M盐酸胍，或通过在10％SDS中，在沸水浴中加热30分钟部分释放。然而，0.5M乳糖、0.5M半乳糖或0.2MEDTA都不能转移结合的SLTⅠ(图4)。随后的实验表明2mgPk-三糖中和大约90％大肠杆菌H19(SLTⅠ)的活性，但中和大肠杆菌32511(SLTⅡ/SLTⅡc)或大肠杆菌C600/933W(SLTⅡ)到类似的程度需要约10mgPk-三糖SYNSORB(图5)。实施例3在消化道疾病下的效能把Pk三糖SYNSORB在37℃下在0.01MHCl中温育多次，以模拟胃部疾病，然后，以PBS充分洗涤以除去HCl。然后，检验以HCl处理的SYNSORB在本文如上由Armsuong,G.D.等[53]描述的Vero细胞毒性测定中SLTⅠ和SLTⅡ的中和活性。简言之，把大肠杆菌026:H11(SLTⅠ)或0157:H(SLTⅡ)在37℃下在胰蛋白酶酱油琼脂(TSA)上生长过夜。在3.0mL包含0.1mg/mL多粘菌素B硫酸盐的PBS中收获5个平板的细菌。然后，通过离心澄清产生的悬浮液。把5mgPk三糖SYNSORB与约1mL下表中所列的细菌菌株的多粘菌素抽提物混合。数据代表两个独立测定的平均值，每次完全相同进行。括弧中的值给出每一值的范围。表2HCl处理的Pk三糖SYNSORB在Vero细胞测定中中和SLT活性的能力如表2中显示的，与HCl的温育不能显著降低中和活性。为刺激肠疾病，把各种SYNSORBs在缓冲液或在大鼠肠囊中在37℃下温育2小时。通常如上述，检验温育的SYNSORBs对SLTⅠ和SLTⅡ的中和活性。简言之，由大鼠肠回收的SYNSORBs在Branson型B-220超声清洁器中以声波处理30至60秒，以破坏聚合材料块。然后，以5mL加倍蒸馏的去离子水洗涤声波处理的SYNSORBs4次，并在真空下干燥。以类似方式处理对照SYNSORBs。把如上述的多粘菌素提取物以PBS稀释为8mL。把5mgSYNSORB加至0.9mL稀释的多粘菌素抽提物部分中。然后，在室温下，在连续循环的旋转仪上温育这些物质1小时。分析产生的上清液稀释液的SLTⅠ或SLTⅡ活性。计算相对于与ASA对照SYNSORB温育的多粘菌素提取物的CD50的中和百分数。这些结果在表3-6中显示。表3显示由缓冲液中温育的SYNSORB中和SLTⅠ活性的结果；表4显示由肠囊中温育的SYNSOI中和SLTⅠ活性的结果；表5显示由缓冲液中温育的SYNSORB中和SLTⅡ活性的结果；表6显示由大鼠肠囊中温育的SYNSORB中和SLTⅡ活性的结果。表3SYNSORB中和的SLTⅠ活性的百分数aASASYNSORBb0P1二糖93(88-97)P1三糖98(96-100)a．完全相同测定的平均值，范围在括弧中。b．对照SYNSORB仅包含乙酰化的甲硅烷氨化的(ASA)疏水8-甲酯基患籽跫柞辛基连接臂。表4SYNSORB中和的SLTⅠ活性百分数aASASYNSORBb0P1二糖82±6P1三糖98±2a．三次重复测定的平均值±平均标准偏差。b．对照SYNSORB仅包含乙酰化的甲硅烷氨化的(ASA)疏水8-甲酯基患籽跫柞辛基连接臂。表5SYNSORB中和的SLTⅠ活性的百分数aASASYNSORB0P1二糖84P1三糖98a．一次测定的结果。表6SYNSORB中和的SLTⅠ活性的百分数ASASYNSORB0P1二糖65±9aP1三糖96ba．三次相同测定的平均值±平均标准偏差。b．一次测定的结果。如上显示，胃部疾病和小肠疾病对衍生的SYNSORBs中和SLTⅠ或SLTⅡ的活性都不是有害的。实施例4在人类患者中的效能把包含PkSYNSORB的药物组合物施用于加拿大13个地方的孩子。为使得在胃肠疾病尽可能最早点治疗，在粪培养结果已知之前，孩子有资格进行这种研究。孩子限制在从6个月到15岁的年龄。如果孩子有腹泻(在24小时前已通过至少2次送粪)及下列之一腹腔阻碍、粪中有血、肠下垂、与已知具有VTEC感染或HUS或从粪培养的大肠杆菌0157:H7的个体密切接触，有资格进行研究它们。如果患者具有慢性肾或血液疾病或如果它们有任何急性或慢性溶血作用、肾损伤或血小板降低的证明，如果它们有慢性肠疾病，如果它们有抑制口服药摄入的脑病，或如果它们正在接受抗惊厥剂药疗或胰酶补充物，这些患者就排除在外。除非粪培养物鉴定为无VTEC粪病原体，对患者仍然进行研究。一种完全的血液计数、外周血涂片、血清尿素和抗0157抗体的肌酸酐尿分析和血清在登记前从所有受治疗者获得。利用被动的血凝结测定，检验来自登记时及登记后60天的血清样品的抗0157LPS抗体。一种抗0157LPS滴度大于1∶500认为与最近的感染一致。来自所有患者的粪样品向医院的微生物学实验室提交，并按常规接种在一改进的山梨醇MacConkey琼脂上。不能发酵山梨醇的菌落通过标准生化检验鉴定为大肠杆菌，分离物利用0157抗血清通过凝集作用形成血清组。把来自具有阴性常规培养的那些患者的粪样品提交到加拿大渥太华疾病控制中心的肠病原体国家实验室。估价这些样品中其它产生vero毒素的大肠杆菌的存在。基于年龄和中心，对合格的受治疗者分出层次，并且然后随机化。患者接收婴儿食品中混合的SYNSORB-Pk或等体积具有类似味道和结构的磨过的玉米粉安慰剂。初步的有益结果是以在治疗的第七天具有HUS证据的患者的比例。把研究药物每日施用两次，共七天。SYNSORB-Pk的剂量是大约500mg/kg/天。安慰剂是选择的磨过的玉米粉，因为它具与SYNSORB-Pk类似的中等坚硬结构，且如SYNSORB-Pk没有味道。为改进适口性，把SYNSORB-Pk和玉米粉安慰剂与市售的婴儿食品(水果)混合。如果一个剂量在30分钟内呕吐，再次施用。如果受治疗者的粪培养结果鉴定有大肠杆菌0157或如果未鉴定到细菌病原体，则他们继续接收研究药物共七天。如果粪培养物鉴定为有症状的其它病原体(如沙门氏菌、志贺氏菌属、弯曲杆菌属或耶尔森氏菌属物种)，则受治疗者停止正采取的药疗法。试验的初步测定结果是通过感染后8-10天的实验室时间重新评估的具有溶血尿毒症综合征的受治疗者的比例。如果有肾损伤和溶血作用或血小板降低，则认为存在溶血尿毒症综合征。肾损伤要求血清肌酸酐浓度的升高(对于不到5岁的患者＞50％μM，或对于5-6岁的患者＞60μM)，或在急性病期间，所记录的肌酸酐值不同(在尿显微分析中大于50％或至少10个红细胞/高效场)。如果血红蛋白浓度≤105g/L或如果血涂片上有红细胞片段或如果在血红蛋白降至≤105g/L之前施用红细胞输血，则判断溶血作用存在。把所有的外周血涂片提交渥太华的东方安大略儿童医院的中心研究实验室，在那儿，由对受治疗者的治疗状态无所知的实验室技术员对它们分级。血小板降低规定为不到150×109/L的血小板浓度。如果肌酸酐浓度峰的上升不到100μmol/L，存在轻的HUS；中等HUS需要101-400μmol/L肌酸酐浓度及透析不到七天；严重的HUS需要肌酸酐浓度高于400μmol/L或透析七天或更多天或死亡。除这些初步结果之外，患者也常作为具有如前规定的分离的溶血贫血、分离的血小板降低或分离的肾损伤的次级结果分类。父母亲在日记中记录腹泻的频率、呕吐的药剂量以及可能的不利事件的频率。分析这种评估结果以测定这种方案对具有已证明的SLT介导的病原性大肠杆菌感染的那些患者的效果，及谁适应这种治疗制度。这些结果的分析划分为两组，即三天内治疗的首先表现出大肠杆菌感染症状的组和三天之后治疗的首先表现大肠杆菌感染症状的组。以下表7和8显示了这种评估结果。表7．分组的结果-仅具有大肠杆菌或粪阳性和在综合征后3天内治疗的那些</tables>上述结果表明当对具有由于SLT介导的大肠杆菌感染的疾病症状的患者在这些症状出现三天内治疗时，治疗的患者中HUS全面发生率为13.5％，这可与以安慰治疗的患者中全面发生率为29.4％比较，或相对降低风险54.1％。上述结果还表明当对具有由于SLT介导的大肠杆菌感染的疾病症状的患者在这些症状出现三天后治疗时，与安慰相比，没有HUS发展风险的相对降低。因此，这些结果表明用本发明的方法早期治疗SLT介导的大肠杆菌感染的关键性。参照被认为是优选的实施例的那些描述了本发明，应当理解本发明不限于所公开的实施例。反之，本发明旨在覆盖各种包括在附加的权利要求的精神及范围内的修改和等同的变化。权利要求1．一种抑制患者中溶血尿毒症综合征发展的方法，所说的综合征是由志贺氏样毒素介导的肠出血大肠杆菌感染引起的，该方法包括对所说的患者施用有效量的一种药物组合物，该药物组合物包含含有αGal(1→4)βGal亚单位的药物惰性亲和性支持体，其中所说的亚单位通过非肽基接头臂结合到所说的支持体上，且该亚单位结合SLT毒素，其中在感染出现的大约3天内施用这种药物组合物。2．权利要求1的方法，其中所说的接头臂包含1至10个碳原子。3．权利要求2的方法，其中所说的接头臂是-(CH2)8C(O)-。4．权利要求1的方法，其中所说的固体惰性亲和性支持体是二氧化硅。5．权利要求1的方法，其中在非肠器官受到感染之前给患者施用所说的药物组合物。6．一种抑制患者中溶血尿毒症综合征发展的方法，所说的综合征是由志贺氏样毒素介导的肠出血大肠杆菌感染引起的，该方法包括对所说的患者施用有效量的一种药物组合物，该药物组合物包含含有选自αGal(1→4)βGal、αGal(1→4)βGal(1→4)βGlcNAc和αGal(1→4)βGal(1→4)βGlc的寡糖的药物惰性亲和性支持体，其中所说的寡糖通过非肽基接头臂结合到所说的支持体上，其中在感染出现的大约3天内施用这种药物组合物。7．权利要求6的方法，其中所说的寡糖序列是αGal(1→4)βGal。8．权利要求6的方法，其中所说的寡糖序列是αGal(1→4)βGal(1→4)βGlcNAc。9．权利要求6的方法，其中所说的寡糖序列是αGal(1→4)βGal(1→4)βGlc。10．权利要求6的方法，其中所说的接头臂包含1至10个碳原子。11．权利要求10的方法，其中所说的接头臂是(CH2)8C(O)-。12．权利要求6的方法，其中所说的固相惰性亲和性支持体是二氧化硅。13．权利要求6的方法，其中在非肠器官受到感染之前对患者施用所说的药物组合物。全文摘要本发明涉及令人惊奇而意想不到地发现:肠出血性大肠杆菌感染引起的HUS的临床发生率被一种药物组合物的及时施用显著地降低,所说的组合物包含药物惰性亲和性支持体,该支持体包含一种结合SLT的αGal(1→4)βGal亚单位。具体地说,现已发现:当这种药物组合物在感染出现的3天内施用时,由肠出血性大肠杆菌感染引起的HUS的临床发生率显著地降低。相反,在这一时间范围后或当非肠器官受感染时,施用这种药物组合物实质上降低这种组合物降低HUS发生率的能力。文档编号A61K47/48GK1209752SQ97191921公开日1999年3月3日申请日期1997年6月20日优先权日1996年6月21日发明者D·J·拉菲特,B·P·托马斯,P·N·麦可莱内,P·C·罗威,E·奥比尼,T·P·可拉森,G·D·阿穆斯托,P·R·古笛耶,A·M·麦肯茨,G·A·威勒斯,H·里,F·奥可莱尔申请人:辛索尔布生物技术有限公司