专利名称：一种大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种利用酵母细胞表达大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法。
背景技术：
大肠杆菌热不稳定肠毒素(heat-labile enterotoxin，简称LT)是导致人畜腹泻的毒性因子，由产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia，ETEC)合成的六聚体蛋白。编码和翻译大肠杆菌热不稳定肠毒素的1t基因全长1148bp，位于野生型产毒性大肠杆菌的质粒上，分子量约61×106u。
LT是由A、B两种亚单位组成的，分别记为LTA、LTB，其中LT中含有同源五聚体的LTB。LTA有258个氨基酸，其中前18个氨基酸为信号肽；LTB124个氨基酸，前21个氨基酸是信号肽。LTB能够识别人或动物肠粘膜上皮细胞膜的神经节苷脂GM1，并与之结合形成复合物然后跨膜转运进入靶细胞浆中，LTA进入细胞，持续活化腺苷酸环化酶系统，水解ATP产生大量的cAMP，引起小肠液过度分泌超过肠道再吸收能力，从而导致人或动物腹泻。
除了很强的毒性以外，LT及其B亚单位也具有很强的免疫原性并且能够辅佐其他抗原通过粘膜免疫途径使机体产生特异抗体，是公认的强效粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂，迄今在人和动物实验中业已鉴定的最有效的粘膜免疫原之一。LT及其B亚单位与多种蛋白抗原或非蛋白抗原联合或融合经不同免疫途径共同免疫机体后，可增强机体的系统免疫及黏膜免疫应答；同时，还能消除机体对免疫原的耐受，诱发长期免疫记忆。因而LT全毒素，尤其是其无毒或低毒突变体作为粘膜免疫佐剂，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗开发中具有重要医学价值和经济价值。
由于LT有很高的毒性，因而阻碍了将野生型毒素作为疫苗的佐剂用于人体。目前常用基因突变的方法使野毒型LT脱毒同时保留其佐剂活性，现有超过60种不同的LT突变体已通过点突变方法改变其氨基酸序列而表现为低毒或无毒，其中的部分突变体与不同的抗原混合或融合在不同的动物模型上进行了佐剂实验，已有一些LT突变体作为疫苗的粘膜免疫佐剂用于临床试验。常见的LT A亚单位的突变体有LTR7K、LTH44A、LTV53D、LTS61F、LTS63K、LTA69G、LTA72R、LTE112K、LTG118E、LTR146E、LTR192G；B亚单位的突变体有LTG33D。
对于LT及其突变体或亚基的生物制备，公知的方法是在细菌中通过基因工程手段表达LT蛋白，但是在细菌中表达LT或其突变体、或其亚单位的产量较低，国外报道的LT产量均低于20ml/L(Rodighiero et al.J Biol Chem.1999，274(7)3962，Uesaka et al.Microb.Pathg，1994，16(1)71；Pronket al.J Biol Chem，1985，260(25)13580；Verwei j et al Vaccine，1998，16(20)2069；Ryan et al.Infect Immun，1999，67(4)1694；Haan et al.Vaccine，2001，19(20-22)2898)，国内王静等在水弧菌中分泌表达LTB，产率最高不超过26mg/L(王静等，中华微生物学和免疫学杂志，2003，23(6)432)；冯强等将LT突变体基因在强启动子的作用下，在大肠杆菌中的表达量提高到46mg/L(冯强，生物过程学报，2003，19(5)532；中国专利，CN1696291，2004)。
本发明人通过分析LT及其突变体的基因序列发现，野生型LT及其突变体的基因序列中含有大肠杆菌的稀有密码子较多，使得LT及其突变体在大肠杆菌中的表达水平较低。但是野生型LT及其突变体的基因序列使用酵母表达时没有稀有密码子，因此设想采用酵母细胞来表达野生型LT及其突变体。
近年来，有将LT的B亚单位分别在毕赤酵母(Fingerut et al.Vaccine，2005，234685)、酿酒酵母(Rezaee et al.Journal of microbiology(Seoul，Korea)，2005，43354；Schonberger et al.Molecular microbiology，1991，52663)中表达的报导，但产量较低，最高仅有5～8mg/L，均是采用了单拷贝表达盒，以及产生LTB时的酵母细胞密度OD600值仅有1.0～2.0，因此LTB的产量较低。此外，国外一些学者在植物中也表达了LTB(Wagner etal.J Immunol Methods，2004，287203；Kang et al.Transgenic Res，2003，12683；Walmsley et al.Plant Cell Rep，2003，211020；休.S.梅森，中国专利CN99814963.2，1999)，但是产率并不高，介于37.8～75μg/g之间。
目前产毒性大肠杆菌自身合成野生型LT以及通过基因工程方式在细菌、酵母或植物中表达的LT或其突变体或其亚单位的产率都较低，从而限制了LT及其突变体的规模化生产和临床应用。这是本领域一个急待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法。该法是一种在酵母细胞中表达LT的方法，这种表达可以有效地提高重组大肠杆菌热不稳定肠毒素表达水平。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
本发明提供了一种大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法，该法以野生型LT或其突变体或其亚单位中的一种LT和一种亚基LTB为例进行说明制备方法。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
本发明所提供的方法，采用下述顺序的步骤(1)在酵母细胞中进行胞内表达LT或LTB将LT的两个亚基A和B的基因通过PCR扩增和酶切分别重组到酵母细胞的表达载体pA0815上，形成重组表达载体LTA/pA0815和LTB/pA0815，这两个重组质粒经体外重组法构建10拷贝杂合重组载体(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815或10拷贝的重组载体(AOX-LTB)10/pA0815。多拷贝重组载体线性化后电转化毕赤酵母，营养缺陷型培养基筛选酵母转化子，PCR扩增确认转化子中是否含有目的基因。含有目的基因的酵母转化子进一步液体发酵并用甲醇诱导表达。收集并破碎酵母细胞，经亲和层析纯化就获得了LT或LTB蛋白，SDS-PAG和Western blot鉴定LT和LTB的分子量和免疫原性。
(2)在酵母细胞中分泌表达LT和LTBLT的A和B两个亚基的基因通过PCR扩增和双酶切后重组到分泌信号肽α因子基因的下游，构建成融合基因αLTA和αLTB，再经酶切后重组到酵母表达载体pA0815上，通过体外重组法构建多拷贝杂合表达载体(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815或10拷贝重组载体(AOX-αLTB)10/pA0815，多拷贝重组载体线性化后电转化毕赤酵母，营养缺陷型培养基筛选酵母转化子，PCR扩增确认转化子中是否含有目的基因。含有目的基因的酵母转化子进一步液体发酵并用甲醇诱导表达。培养上清超滤浓缩后亲和层析纯化就获得了LT蛋白或LTB，SDS-PAG和Western blot鉴定LT和LTB的分子量和免疫原性。
(3)LT或LTB蛋白性质的鉴定LT或LTB的生物学活性是用ELISA法来测定其与神经节苷脂GM1的结合能力。LT或LTB的佐剂活性采用LT或LTB与牛血清白蛋白(BSA)联合免疫小鼠，ELISA检测小鼠的唾液、肠胃冲洗液中是否含有分泌型sIgA，如果有sIgA，表明LT具有粘膜佐剂活性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果(1)在真核酵母细胞中外源表达LT及其突变体或其亚单位，能够大幅提高其表达水平，是因为本发明构建了多拷贝的LT或LTB亚基，并同时表达了LT的两个亚单位，增加了LT或LTB在酵母中的基因剂量；其次，原来LT及其突变体在大肠杆菌中的稀有密码子而在酵母细胞中却不是稀有密码子，不会影响LT在酵母细胞中的翻译及合成速度，最终提高LT及其突变体在酵母细胞中的表达水平；最后，本发明将LT或LTB基因重组在毕赤酵母表达载体的强启动子醇脱氢酶(AOX)启动子之后，由甲醇诱导外源蛋白高表达。
(2)使用酵母细胞制备LT，避免了传统方法由细菌制备时的内毒素污染而造成的后续纯化工艺的繁琐，使得下游纯化更为方便简单，临床使用更为安全可靠。
(3)如果使用酵母细胞分泌表达时，由于不受宿主菌体细胞内蛋白的影响，减少了纯化工艺，提高了回收率；同时酵母细胞结构简单、生长快速、易于培养和发酵、生产成本低、目的蛋白产量高，这对于规模化生产粘膜佐剂及其临床应用具有重要的现实意义。
图1是设计构建的毕赤酵母胞内表达LT的多拷贝杂合重组质粒；图2是设计构建的毕赤酵母分泌表达LT的多拷贝杂合重组质粒；图3是设计构建的毕赤酵母胞内表达LTB的多拷贝重组质粒；图4是设计构建的毕赤酵母分泌表达LTB的多拷贝重组质粒；图5是PCR扩增的LTA和LTB；(1.100bp DNA ladder Marker；2.LTA；3.LTB)图6是PCR扩增的αLTA和αLTB(1.DL2000+2700bp Marker；2.αLTA；3.αLTB)；图7是12拷贝(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815的酶切图谱(1.λ-EcoT14 I Marker；2.pA0815的Bgl II和BamH I酶切；3.(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815的Bgl II和BamH I双酶切；4.DL15000Marker)；图8是12拷贝(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815的双酶切图谱(1.λ-EcoT14 I Marker；2.DL15000 Marker；3.(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815的Bgl II和BamH I双酶切)；图9是10拷贝(AOX-LTB)10/pA0815的酶切图谱(1.pPIC9K/Pst IMarker；2.DL15000 Marker；3.(AOX-LTB)10/pA0815的Bgl II和BamH I双酶切)；图10是10拷贝(AOX-αLTB)10/pA0815的酶切图谱(1.DL15000 Marker；2.(AOX-LTB)10/pA0815的BamH I酶切；3.AOX-LTB)10/pA0815的Bgl II和BamHI双酶切；4.pPIC9K/Pst I Marker)；图11是重组酵母表达并纯化的LT的SDS-PAGE和Western blot；图12是重组酵母表达并纯化的LTB的SDS-PAGE和Western blot。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。由于篇幅所限，为了表述方便，实施例以毕赤酵母(P.pastoris)及其表达载体pA0815进行构建胞内表达和分泌表达野生型LT或LTB来说明。但是，需要指出的是，本发明所提供的制备方法也完全适用于其它LT突变体，例如LTR7K、LTH44A、LTV53D、LTS61F、LTS63K、LTA69G、LTA72R、LTE112K、LTG118E、LTR146E、LTR192G、LTG33D。
实施例1——毕赤酵母细胞中进行胞内表达LT(1)重组表达载体LTA/pA0815和LTB/pA0815的构建LT A及B亚单位基因分别用其上下游特异的引物进行PCR扩增不含其信号肽序列的基因，并在引物两端引入EcoR I酶切点，PCR产物大小LTA(727bp)、LTB(320bp)纯化后用EcoR I于37℃酶切2小时，回收纯化；酵母表达载体pA0815同样用EcoR I酶切，再经碱性磷酸酶于37℃处理1小时，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，TE悬浮载体DNA片段，与EcoR I酶切的LTA和LTB分别用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物通过热休克法转化用CaCl2制备的E.coli DH5α，涂布Amp+-LB平板，37℃培养16小时，挑取数个单菌落接种Amp+-LB培养液，37℃振荡培养12小时，碱裂解法抽提质粒，EcoR I酶切质粒鉴定是否含有LTA、LTB，然后酶切鉴定目的基因的插入方向，对于LTA/pA0815重组质粒使用HindIII单切，琼脂糖电泳后出现条带大小为579、7847bp时，则LTA为正向插入，若条带为280、8146bp时，则为反向插入；用内切酶Mun I单切重组质粒LTB/pA0815，电泳后出现条带大小为119、368、829、1834、4877bp时表明LTB为正向插入，若出现108、119、829、2094、4877bp的条带，表明是反向插入。挑选正向插入目的基因的重组质粒LTA/pA0815、LTB/pA0815，用于下一步的亚克隆。
(2)体外重组构建多拷贝表达盒的重组质粒(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815LTB/pA0815重组质粒使用BglII和BamHI双酶切37℃2小时，胶回收小片段(AOX-LTB)(1596bp)，再插入到用BamH I酶切和碱性磷酸酶处理的LTB/pA0815质粒上，T4 DNA连接酶16℃连接过夜，并以热休克法转化CaCl2制备的E.coli DH5α感受态细菌，涂布Amp+-LB平板，37℃培养16小时，挑取单菌落，接种Amp+-LB培养液，振荡培养12小时，碱裂解法抽提质粒，用Bgl II和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定是否含有3192bp的2拷贝表达盒(AOX-LTB)，获得的2(AOX-LTB)/pA0815重组质粒，进一步在其基础上，按上述同样的方法构建含有5拷贝表达盒的重组质粒5(AOX-LTB)/pA0815；然后用Bgl II和BamH I双酶切LTA/pA0815，回收大小为1995bp的(AOX-LTA)，将其按上述方法插入到5(AOX-LTB)/pA0815中，形成杂合多拷贝表达盒重组质粒(AOX-LTB)5(AOX-LTA)/pA0815，再次用Bgl II和BamH I将(AOX-LTB)5(AOX-LTA)双切下，重组到(AOX-αLTB)5(AOX-LTA)/pA0815上，最终构建成(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815杂合多拷贝重组质粒。
(3)(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815电转化毕赤酵母及重组酵母的鉴定(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815经Sal I于37℃酶切2小时，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，20μ1ddH2O悬浮DNA，使用电转仪于电压1500V、电阻200Ω、电容25μF下将线性化质粒转化山梨醇制备的毕赤酵母GS115感受态(按Invitrogen公司的毕赤酵母说明书操作)，涂布MD平板，28℃培养3天，挑取较大的菌落少许，用Lyticase酶消化10分钟，取10μl用5AOX和3AOX引物进行PCR扩增，在琼脂糖电泳凝胶上出现大小为913bp、514bp的条带时，表明该酵母转化子中含有LTA和LTB基因。这样就可筛选出含有多拷贝表达盒目的基因的重组酵母。
(4)毕赤酵母细胞内LT的诱导表达、纯化及鉴定挑取重组酵母菌落，接种到BMGY培养液中，30℃振荡(250～300rpm)培养，OD600达到3～5时，3000rpm离心5分钟收集重组酵母细胞，用BMMY培养液悬浮，继续振荡培养5天，离心收集酵母细胞，玻璃珠研磨破碎细胞，TEAN(pH7.3)悬浮，13000rpm、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液用Immobilized D(+)-galactose亲和层析纯化，洗涤纯化柱，半乳糖洗脱缓冲液洗脱LT，这样就得到了纯化的LT蛋白。通过上述实验程序每升发酵液可获得101.3mg的纯化LT蛋白。LT与上样缓冲液混和煮沸5分钟，取10μl用10％的聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳(SDS-PAGE)，考马斯亮兰染色，观察LTA和LTB的分子量大小分别为27KD和11KD。将SDS-PAGE上的LT通过半干电转法转移到PVDF膜上，按照Western blot的操作程序对LT进行免疫学鉴定，结果表明LT可与抗LT抗体发生免疫反应。
实施例2——毕赤酵母分泌表达LT的构建和鉴定(1)重组表达载体αLTA/pA0815和αLTB/pA0815的构建对不含信号肽序列的LT A及B亚单位基因分别进行PCR扩增，并在引物上下两端引入Xho I和EcoR I酶切点，PCR产物LTA(727bp)、LTB(328bp)纯化后用Xho I和EcoR I于37℃酶切2小时，回收纯化；含有酵母分泌信号肽α-因子重组载体pALPHA同样用Xho I和EcoR I双酶切，胶回收大片段，与双酶切并纯化的LTA和LTB分别用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物通过热休克法转化用CaCl2制备的E.coli DH5α，涂布Amp+-LB平板，37℃培养16小时，挑取数个单菌落接种Amp+-LB培养液，37℃振荡培养12小时，碱裂解法抽提质粒，Xho I和EcoR I双酶切质粒鉴定是否含有LTA、LTB。对于构建成功的重组质粒分别对应记为pαLTA、pαLTB，LTA和LTB分别连接在α-因子之后。然后再次用引物通过PCR扩增αLTA、αLTB，在引物两端都引入EcoR I酶切位点，αLTA、αLTB大小分别为982bp、583bp。按照实施例1中(1)的方法将αLTA和αLTB重组到酵母表达载体pA0815上，构建成αLTA/pA0815、αLTB/pA0815重组载体。对于αLTA/pA0815上的αLTA插入方向鉴别，使用Xho I和EcoR I双酶切，若电泳条带上出现1058、7623bp时则为正向插入，而出现584、8097bp时则是反向插入；对于αLTB/pA0815上的αLTB插入方向使用Mun I单酶切鉴定，如果电泳条带上出现119、623、829、1834、4874bp则是正向插入，如果出现108、119、829、2349、4877bp则为反向插入。挑选正向插入目的基因的重组质粒αLTA/pA0815、αLTB/pA0815，用于下一步的亚克隆。
(2)体外重组构建多拷贝表达盒的重组质粒(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815按照实施例1中(2)的方法构建多拷贝重组载体(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815，不同之处是几个DNA片段大小不同AOX-αLTA为2250bp，AOX-αLTB为1848bp，2拷贝表达盒(AOX-αLTB)为3696，5(AOX-LTB)为9240bp，DNA片段(AOX-LTB)5(AOX-αLTB)大小为11490bp，DNA片段(AOX-LTB)10(AOX-αLTB)2大小为22980bp。
(3)重组质粒(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815电转化毕赤酵母及重组酵母的鉴定按照实施例1中(3)的方法将(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815重组质粒电转化毕赤酵母，同样用5AOX和3AOX引物进行PCR扩增毕赤酵母转化子，电泳凝胶上出现大小为1168bp、769bp的条带时，表明该酵母转化子中含有αLTA和αLTB基因。这样就可筛选出含有多拷贝表达盒目的基因的重组酵母。
(4)毕赤酵母分泌LT的诱导表达、纯化及鉴定挑取重组酵母菌落，接种到BMGY培养液中，30℃振荡(250～300rpm)培养，OD600达到3～5时，3000rpm离心5分钟收集重组酵母细胞，用BMMY培养液悬浮，继续振荡培养5天，13000rpm、4℃离心30分钟，收集培养上清，用TEAN(pH7.3)缓冲液于4℃透析3次，透析液用0.22μm滤膜过滤，滤液按照实施例1中(4)的方法进行亲和层析纯化及鉴定。毕赤酵母分泌表达LT每升发酵液可获得126.3mg的纯化蛋白。
实施例3——LTB亚单位在毕赤酵母细胞中的胞内表达和分泌表达(1)LTB在毕赤酵母细胞内表达的构建、诱导表达及鉴定由实施例1中构建成功的5拷贝表达盒(AOX1-LTB)5/pA0815重组质粒，继续按照实施例1中的方法构建10拷贝表达盒(AOX1-LTB)10/pA0815重组质粒、电转化毕赤酵母GS115、鉴定毕赤酵母转化子(用引物5AOX和3AOX扩增的片段为514bp)、用甲醇诱导表达、亲和层析纯化以及进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。在10％SDS-PAGE凝胶上大小为11KD，LTB的胞内表达产率为116.8mg/L。
(2)LTB在毕赤酵母细胞中分泌表达的构建、诱导表达及鉴定由实施例2中构建成功的5拷贝表达盒(AOX1-αLTB)5/pA0815重组质粒，继续按照实施例1中的方法构建10拷贝表达盒(AOX1-αLTB)10/pA0815重组质粒、电转化毕赤酵母GS115、鉴定毕赤酵母转化子(用引物5AOX和3AOX扩增的片段为769bp)、用甲醇诱导表达、亲和层析纯化以及进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。在10％SDS-PAGE凝胶上大小为11KD，毕赤酵母分泌表达LTB的产量为143.7mg/L。
实施例4
——LT或LTB的生物学活性以及免疫佐剂活性鉴定LT或LTB的生物学活性是将其100μl加入到用GM1神经节苷脂包被的ELISA板孔中，37℃1小时，PBST洗板三次，加入小鼠抗LB抗体100μl，37℃1小时，PBST洗板三次，加入100μl HRP标记的羊抗小鼠抗体，37℃1小时，PBST洗板三次，用100μl邻苯二胺显色液显色5分钟，加入20μl 2NH2SO4终止显色，用酶标仪波长为492nm测定OD值。结果表明LT和LTB都具有与GM1神经节苷脂结合的能力。
LT或LTB与抗原牛血清白蛋白(BSA)被Al(OH)3胶体吸附后，通过口服进行0、2、4周三次免疫小鼠，收集小鼠的唾液和肠粘液的冲洗液以及血清。通过ELISA试剂盒可检测到血清中含有抗BSA的抗体，而且唾液和肠粘液中含有抗BSA的sIgA抗体，表明酵母细胞表达的LT或LTB具有粘膜佐剂活性。
权利要求
1.一种大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法，该方法采用下述顺序的步骤(1)在酵母细胞中进行胞内表达LT或LTB将LT的两个亚基A和B的基因通过PCR扩增和酶切分别重组到酵母细胞的表达载体pAO815上，形成重组表达载体LTA/pAO815和LTB/pAO815，这两个重组质粒经体外重组法构建包含10拷贝LTB和2拷贝LTA的杂合重组表达载体或10拷贝LTB的重组表达载体；多拷贝重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母，营养缺陷型培养基筛选酵母转化子，PCR扩增确认转化子中是否含有目的基因；含有目的基因的酵母转化子进一步液体发酵并用甲醇诱导表达；收集并破碎酵母细胞，经亲和层析纯化就获得了LT或LTB蛋白，SDS-PAG和Western blot鉴定LT和LTB的分子量和免疫原性；(2)在酵母细胞中分泌表达LT或LTBLT的A和B两个亚基的基因通过PCR扩增和双酶切后重组到分泌信号肽α因子基因的下游，构建成融合基因αLTA和αLTB，再经酶切后重组到酵母表达载体pAO815上，通过体外重组法在pAO815上构建含10拷贝αLTB和2拷贝αLTA杂合重组表达载体或10拷贝αLTB重组表达载体，多拷贝重组载体线性化后电转化毕赤酵母，营养缺陷型培养基筛选酵母转化子，PCR扩增确认转化子中是否含有目的基因；含有目的基因的酵母转化子进一步液体发酵并用甲醇诱导表达；培养上清超滤浓缩后亲和层析纯化即获得了LT或LTB蛋白，SDS-PAG和Western blot鉴定LT和LTB的分子量和免疫原性。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法，其中所述的酵母细胞为毕赤酵母属。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法，其中所述的大肠杆菌热不稳定肠毒素包括了野生型、各种突变体LTR7K、LTH44A、LTV53D、LTS61F、LTS63K、LTA69G、LTA72R、LTE112K、LTG118E、LTR146E、LTR192G、LTG33D和其B亚单位。
全文摘要
本发明公开了一种大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法，该法通过在酵母细胞中进行胞内表达或者分泌表达LT或LTB。在真核酵母细胞中外源表达LT及其突变体或其亚单位，能够大幅提高其表达水平。本发明构建了多拷贝的LT或LTB亚基表达盒，增加了LT或LTB在酵母中的基因剂量，同时将LT或LTB基因重组在毕赤酵母表达载体的强启动子醇脱氢酶(AOX)启动子之后，由甲醇诱导外源蛋白在酵母细胞中高表达，最终提高了LT及其突变体或LTB在酵母细胞中的表达水平，使得下游纯化更简单，临床使用更安全。本发明生产成本低、目的蛋白产量高，这对于规模化生产粘膜佐剂及其临床应用具有重要的现实意义。
文档编号C12R1/84GK1821398SQ20061001073
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月9日 优先权日2006年3月9日
发明者井申荣, 魏云林, 林连兵, 李光 申请人:昆明理工大学