一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体及其应用的制作方法

专利名称：：一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种基因工程亚单位疫苗，特别涉及一种产肠毒素大肠杆菌(ETEC)多价肠毒素免疫原，用于预防和治疗由ETEC等细菌引起的腹泻。
背景技术：
：产肠毒素大肠杆菌(ETEC)可引起幼龄动物(包括仔猪、犊牛、羔羊等)的急性、传染性腹泻，严重危害畜牧养殖业的健康发展，并且造成巨大的经济损失。ETEC还是发展中国家婴幼儿及旅游者腹泻的主要病原体，全球每年因ETEC感染的腹泻病例高达6.5亿人次，导致约38万5岁以下儿童死亡(Sizemore等，2004年，ExpertRev.Vaccines)。ETEC引起腹泻发生的作用机理是细菌首先借助其表面的菌毛等黏附素定植于小肠粘膜上皮细胞上，进而在肠道内大量繁殖并产生肠毒素，作为直接致病因子的肠毒素使肠上皮细胞代谢紊乱，分泌大量水分和电解质进入肠腔，最终导致腹泻的发生。ETEC的菌毛种类繁多，动物来源菌株的菌毛，较重要的有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F18、F41等；人源ETEC的菌毛更多，已鉴定的超过25种。但是ETEC分泌的肠毒素只有两种，不耐热肠毒素LT和耐热肠毒素ST，ST分为STa和STb两个亚型。对于ETEC性腹泻的治疗，生产中主要应用抗生素及化学药物。但控制此病的关键在于预防，预防的方法除了保持卫生、消毒环境外，主要使用疫苗免疫预防。目前商品化的ETEC疫苗有全菌灭活疫苗，菌毛亚单位疫苗和类毒素疫苗。以下列举获得我国农业部兽药产品批准文号的4个疫苗，它们是在生产实践中使用的兽用大肠杆菌疫苗的典型代表(1)羊大肠埃希氏菌病灭活疫苗，黑龙江省生物制品一厂，兽药生字(2006)080074009。(2)仔猪大肠杆菌三价灭活疫苗，齐鲁动物保健品保健公司，兽药生字(2006)150251028。(3)仔猪大肠杆菌病K88/K99双价基因工程灭活疫苗，上海海利生物药品有限公司，兽药生字(2007)090201027ο(4)仔猪大肠杆菌病Κ88、LTB双价基因工程活疫苗，中牧实业股份有限公司江西生物药厂，兽药生字(2008)140401025。不耐热肠毒素LT由两个亚基组成，A亚基(LTA)是毒性中心，B亚基(LTB)是一个五聚体结构，没有毒性且有良好的免疫原性，常常被用作疫苗的成分。耐热肠毒素STa和STb是分子量很小的半抗原，缺乏免疫原性，若直接用全菌灭活疫苗免疫无法诱导机体产生针对STa和STb的中和抗体。为了解决这一问题，可以将耐热肠毒素STa或STb偶联到大分子的载体蛋白上，使它们具备免疫原性(I.Klipstein等Developmentofavaccineofcross-linkedheat-stableandheat-labileenterotoxinsthatprotectsagainstEscherichiacoliproducingeitherenterotoxin.Infect.Immun.1982,37(2)550-557.II.Dubreuil等ArecombinantEscherichiacoliheat-stableenterotoxinb(STb)fusionproteinelicitingneutralizingantibodies,FEMSImmunol.Med.Microbiol.1996，13:317_323·)。虽然ST是导致腹泻发生的重要致病因子，但由于天然STa和STb分子没有免疫原性，现在上市的疫苗产品都不含有ST成分。在已知的现有技术中，为了制备有效的STa或STb类毒素，研究人员还构建了下列融合亚单位疫苗①LTB-STa二价融合肠毒素(张兆山等，不耐热肠毒素和耐热肠毒素基因的融合·中华微生物学和免疫学杂志，1994，14(04)=219-222.)②STa-LTB二价融合肠毒素(许崇波等，大肠杆菌肠毒素ST1_LT_B融合基因的构建·中国兽医学报，1998，18(05)=463-465.)③KSSac-STl-LTB三价融合肠毒素及菌毛蛋白(许崇波等，表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究.中国预防兽医学报，2003，25(01)9-12.)④LTB-STa-STb三价融合肠毒素(葛艳等，产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STI和STII融合基因的构建与表达研究.中国预防兽医学报，2002,24(05)=27-29.)⑤STa-STb-LTB三价融合肠毒素(武冬梅等，大肠杆菌肠毒素STI、STII、LTB融合基因植物表达载体的构建.西北农业学报，2006，15(05)150-154.)如前所述，致病菌ETEC的菌毛类型众多，分离到的临床致病株常常表达一些尚未鉴定的菌毛，因而只使用几种常见类型的ETEC制备多价灭活全菌疫苗，其保护范围是不够的，经常会遇到保护率偏低的问题。与多种多样的菌毛黏附素相比，肠毒素只有LT和ST两类，不论ETEC产生什么类型的菌毛，最终都是依靠这两种肠毒素引起发病，因此利用肠毒素制备疫苗可以实现针对所有类型ETEC菌株的目的，其优势是免去制备多种(针对不同的菌毛型别)ETEC疫苗的麻烦，简化了免疫方案，降低了成本；能引发机体产生更高水平的LT抗体，更重要的是能诱导ST抗体的产生(灭活疫苗无此功效)，因而能够提高免疫预防的效果，并且具有一定的治疗作用。上述文献①、②、③中的三类融合肠毒素没有包含STb，因而其免疫保护效果不全面；④和⑤包含了全部3种重要的肠毒素，但是其融合方案并非最优。当三种蛋白进行融合时，一般位于中间的蛋白会比位于两端的蛋白受到更大影响，其空间结构会因为两侧融合蛋白的作用而改变，从而改变其免疫原性。所以，对于文献④的设计的融合蛋白LTB-STa-STb，其不足是STa的抗原决定簇会受到两侧蛋白的影响而改变，从而无法呈现最佳的免疫原性。同理，文献⑤构建的STa-STb-LTB，缺陷是STb不能呈现最佳的免疫原性。针对它们的不足，本发明做了有效的改进，使STa和STb的免疫原性都得到提高。
发明内容本发明要解决的技术问题是克服现有产肠毒素大肠杆菌(ETEC)疫苗保护范围较窄、不能诱导产生高水平的抗耐热肠毒素(STa及STb)抗体的不足，提供一种多价融合肠毒素免疫原，可以作为疫苗用于控制由ETEC等细菌引起的腹泻，实现扩大保护范围、提高保护率的效果。本发明的技术方案如下获得产肠毒素大肠杆菌的三段肠毒素基因STa，STb及LTB，将三者首尾相接连接在一起形成多价融合肠毒素基因，其融合的顺序从5’端至3’端为STa-LTB-STb或STb-LTB-STa,即LTB位于中间、STa和STb位于两侧。为了增强多价肠毒素融合基因作为DNA疫苗免疫母鸡的效果，可以在其上游连接鸡的分泌性蛋白的信号肽基因。对于构建的融合基因，LTB可以由LTB的片段代替，或者由CTB(霍乱毒素B亚基)或CTB的片段代替；STa和STb可以是单个基因或多个基因串联在一起，或者是STa和STb的片段或多个片段的串连体。所述的肠毒素基因STa，STb,LTB,CTB的片段是指从全基因上截取的含有一个或多个抗原决定簇的基因片段，其长度至少是15个核苷酸，可通过相关生物软件来分析、预测并选取这些基因片段。将获得的多价基因插入适当的表达载体，再导入宿主细胞进行表达即可获得多价肠毒素融合蛋白。构建三价肠毒素融合基因STa-LTB-STb或STb-LTB-STa的技术方案及其应用如下(1)分别扩增STa、STb及LTB的基因以GenBank数据库中公布的STa(V00612.1)、STb(E00811.1)及LTB(M17873.1)的全基因序列，在需要连接的两个肠毒素基因上设计具有互补末端的引物，常规PCR反应扩增STa、STb及LTB的成熟基因。(2)使用重叠延伸PCR法，先将LTB与STa(或STb)连接，再将得到的二价融合基因与第三个基因STb(或STa)相连，从而得到5，-STa-LTB-STb-3，或5，-STb-LTB-STa-3，形式的融合基因。(3)可选步骤扩增鸡的分泌性蛋白的信号肽基因(命名为L)，同样用重叠延伸PCR法将其融合到三价肠毒素融合基因的上游，得到如5，-L-STa-LTB-STb-3，或5’-L-STb-LTB-STa-3’形式的融合基因。优选的信号肽基因为鸡胰岛素基因的信号肽，长度是72个碱基，其序列为5‘-ATGGCTCTCTGGATCCGATCACTGCCTCTTCTGGCTCTCCTTGTCTTTTCTGGCCCTGGAACCAGCTATGCA-3’；或者为鸡的尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)基因的信号肽，长度是60个碱基，其序列为5‘-ATGAAGTTAATCATCTTTCTCACAGTAACTCTCTGCACACTTGTCACAGGACTTGATTCT-3’。(4)利用常规分子生物学技术，将三价肠毒素融合基因插入真核表达载体得到重组质粒，即可作为三价肠毒素DNA疫苗；或将三价肠毒素融合基因插入原核表达载体，得到的重组质粒在大肠杆菌中经表达获得融合肠毒素蛋白，即为肠毒素蛋白疫苗。(5)三价肠毒素疫苗的应用用得到的三价肠毒素DNA疫苗或三价肠毒素蛋白疫苗免疫怀孕母畜，可以为吸食母乳的新生幼仔提供被动免疫保护；这两类疫苗也可直接用于免疫幼畜，使幼畜产生主动免疫，预防腹泻的发生；两类疫苗还可以用于免疫蛋鸡，得到含有抗肠毒素卵黄抗体的免疫鸡蛋，再利用免疫鸡蛋中的抗体给幼畜口服，同样可以使其获得被动免疫保护。本发明的有益效果本发明的优势是将3段重要的肠毒素STa、STb和LTB连接在一起并进行了优化组合，采用的融合方案是“STa-LTB-STb”或“STb-LTB-STa”。也就是说本发明是将载体蛋白LTB置于中间，而两个半抗原STa和STb分居两端。上文“
背景技术：
”中文献④与⑤的融合肠毒素没有将LTB置于中间，而是将其置于一端，将STa或STb放在中间位置。为了克服灭活疫苗及LT类毒素不能诱导ST抗体的不足，增强STa和STb的免疫原性是构建高效肠毒素疫苗的关键，所以将STa和STb融合在载体蛋白的两端可以最大程度的保存其天然的抗原决定簇，使它们具有最大的免疫原性，因而本发明提供的肠毒素融合方式优于文献④与⑤的融合方案。具体而言，用文献④的LTB-STa-STb融合蛋白免疫动物后，诱导的STa抗体的活性相对不足；用文献⑤的STa-STb-LTB融合蛋白免疫动物后，诱导的STb抗体的活性相对不足。如果使用本发明提供的多价融合肠毒素“STa-LTB-STb”或“STb-LTB-STa”免疫动物，相比于现有的肠毒素疫苗，其优势在于能够诱导产生更高水平的STa抗体和STb抗体，从而获得更高的保护率，提高疫苗的保护效果，降低ETEC性腹泻的发生率。具体实施例方式实施例1.制备三价肠毒素DNA疫苗和蛋白疫苗(1)扩增肠毒素基因STa不使用模板、直接用如下引物进行常规PCR扩增，条件94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，25个循环，最后72°C延伸5分钟。STa-Fl:5，_agggaattcaccatgaacacattctactgctgcgagctgtgctgcaat_3，STa-R5'_tagcaggtgggtagcagccagcggcggcgggattgcagcacagc_3，(2)扩增肠毒素基因LTB及STb模板用K88ac菌株(C83902，购于中国兽医药品监查所)裂解物，使用引物如下，作常规PCR扩增，条件94°C预变性60秒，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸40秒，30个循环，最后72°C延伸5分钟。LTB-F:5，-gctacccacctgctagcccagctccccagactattacag-3，LTB-R:5，_tggtgtggtgctggcgctgtttttcatactgattgcc_3，STb-F:5，-gccagcaccacaccaccctctacacaatcaaataagaaagat-3，STb-R:5，_cgctctagatcctcagcatccttttgctgcaaccat_3，(3)连接LTB与STb以获得LTB-STb模板用上一步的PCR产物LTB及STb的混合物，引物使用上一步用到的LTB-F，STb-R,PCR反应条件如步骤(2)。(4)连接STa与LTB-STb以获得STa-LTB-STb模板用步骤(1)与(3)的PCR产物STa与LTB-STb的混合物，使用引物如下，PCR反应条件如步骤(2)。STa-F25'-acc:|gaattc[accatgaacacattc-3‘,含有EcoRI位点STbRl:5，-acc板ctag^ltcctcagcatcc-3，，含有XbaI位点(5)构建三价肠毒素DNA疫苗pCI-STa-LTB-STb用常规分子生物学技术，将三价肠毒素融合基因STa-LTB-STb利用两端的酶切位点克隆入真核表达载体PCI(美国Promega公司)中，并转化入大肠杆菌DH5α中。(6)DNA疫苗pCI-STa-LTB-STb的制备大量培养含质粒pCI-STa-LTB-STb的E.coliDH5α，使用SDS碱裂解法分离质粒、聚乙二醇法纯化质粒(参考《分子克隆实验指南》第三版第一章方案3和方案8，作者为J.Sambrook和D.W.Russel1)，即可获得用于免疫动物的三价肠毒素DNA疫苗pCI-STa-LTB-STb。(7)构建三价肠毒素原核表达载体pET30-STa-LTB_STb使用如下一对引物，以构建好的pCI-STa-LTB-STb质粒作模板，扩增得到三价肠毒素融合基因STa-LTB-STb，再利用其两端的酶切位点克隆入原核表达载体pET30a(+)(美国Novagen公司)中，获得重组质粒pET30-STa-LTB_STb并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。ssFl:5，-gcctaca.catatg;aacacattctactg-3，，含有NdeI位点ssRl:5，-acg;ctcgag,gcatccttttgctgcaaccatta-3，，含有XhoI位点(8)表达融合肠毒素STa-LTB-STb并分离纯化培养重组大肠杆菌BL21(DE3)pET30-STa-LTB-STb,添加IPTG进行诱导表达，分离包涵体(其主要成分是融合肠毒素蛋白STa-LTB-STb)，充分洗涤除去杂质，再用高浓度的尿素缓冲液溶解包涵体，超滤法除去尿素并复性包涵体，即得到可溶性的融合肠毒素STa-LTB-STb，可以与合适的佐剂混合制成疫苗，也可不加佐剂单独使用。STa-LTB-STb包涵体还可以不经溶解、复性处理，只通过洗涤步骤后直接作为疫苗使用，这样也可以激发抗肠毒素抗体的产生，但比可溶性STa-LTB-STb蛋白的免疫原性稍弱。实施例2.构建含有鸡胰岛素信号肽的三价肠毒素DNA疫苗pCI-ins-STa-LTB-STb(1)扩增鸡胰岛素信号肽基因ins不使用模板、直接用如下引物进行常规PCR扩增，条件94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，25个循环，最后72°C再延伸5分钟。insF5'-aac；|gaattc|；accatggctctctggatccgatcactgcctcttctggctctccttgt-3',含有EcoRI位点insR5'-gcagtagaatgtgtttgcatagctggttccagggccagaaaagacaaggagagccag-3'(2)扩增耐热肠毒素基因STa不使用模板、直接用如下引物进行常规PCR扩增，反应条件同步骤(1)。STa-F:5，_aacacattctactgctgcgagctgtgctgcaatccc_3，STa-R5'_tagcaggtgggtagcagccagcggcggcgggattgcagcacagc_3，(3)连接ins与STa以获得ins-STa模板用前两步的PCR产物ins及STa的混合物，引物使用insF和STa_R，PCR反应条件如步骤(1)。(4)连接ins-STa与LTB-STb以获得ins-STa-LTB-STb模板用PCR产物ins-STa及LTB-STb(制备方法同实施例1)的混合物，引物使用insF和STb-R(见实施例1)，PCR反应条件如步骤(1)。(5)构建表达鸡胰岛素信号肽的三价肠毒素DNA疫苗pCI-ins-STa-LTB-STb用常规分子生物学技术，将ins-STa-LTB-STb利用两端的酶切位点克隆入真核表达载体PCI中，并转化入大肠杆菌DH5ci中。(6)DNA疫苗pCI-ins-STa-LTB-STb的制备制备方法同实施例1的步骤(6)。实施例3.构建含有鸡尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)信号肽的三价肠毒素DNA疫苗pCI-upa-STa-LTB-STb7(1)扩增鸡upa的信号肽基因upa不使用模板、直接用如下引物进行常规PCR扩增，条件94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，25个循环，最后72°C再延伸5分钟。upaF5'-aac|gaattc|;accatgaagttaatcatctttctcacagtaactctctgcac-3‘,含有EcoRI位点upaR:5，-gcagtagaatgtgttagaatcaagtcctgtgacaagtgtgcagagagttactg-3，(2)扩增肠毒素基因STa制备方法同实施例2的步骤(2)。(3)连接upa与STa以获得upa-STa模板用前两步的PCR产物upa及STa的混合物，引物使用upaF和STa_R(见实施例2)，PCR反应条件如步骤⑴。(4)连接upa-STa与LTB-STb以获得upa-STa-LTB-STb模板用PCR产物upa-STa及LTB-STb(制备方法同实施例1)的混合物，引物使用upaF和STb-R(见实施例1)，PCR反应条件如步骤(1)。(5)构建表达鸡upa信号肽的三价肠毒素DNA疫苗pCI-upa-STa-LTB-STb用常规分子生物学技术，将upa-STa-LTB-STb利用两端的酶切位点克隆入真核表达载体PCI中，并转化入大肠杆菌DH5ci中。(6)DNA疫苗pCI-upa-STa-LTB-STb的制备制备方法同实施例1的步骤(6)。实施例4.三价肠毒素DNA疫苗和蛋白疫苗免疫蛋鸡制备抗毒素卵黄抗体(IgY)及IgY对仔猪的保护效果用4种免疫原三价肠毒素DNA疫苗pCI-ins-STa-LTB-STb(pCI-ins-SLS)、pCI-upa-STa-LTB-STb(pCI-upa-SLS)、pCI-STa-LTB-STb(pCI-SLS)以及三价肠毒素蛋白疫苗STa-LTB-STb(SLS)免疫海兰褐母鸡，每组5只母鸡，在开产前半个月进行首次免疫，两周后二免，再隔三周后进行三免。免疫方式DNA疫苗——胸部肌肉两点加上大腿肌肉两点；蛋白疫苗——胸部肌肉两点，颈部皮下一点。免疫剂量/鸡/次200μg质粒DNA或400μg蛋白。三免后10天开始连续收集鸡蛋，用水稀释法分离IgY。水稀释法的主要步骤分离卵黄，加入6倍体积的蒸馏水，0.IM稀盐酸调节pH为5.0，4°C静置过夜，离心取上清，即为含有IgY的水溶性组分，硫酸铵盐析，超滤除盐。用间接ELISA法检测三种肠毒素STa、STb及LTB的特异性抗体的效价。ELISA实验中用于包被96孔板的抗原是用大肠杆菌表达的融合肠毒素GST(谷胱甘肽转移酶)-STa、Trx(硫氧还蛋白)-STb及LTB。二抗为HRP标记的兔抗鸡IgG，显色底物TMB，检测450nm下的OD值。抗体的效价定义为OD45tlnm值>0.2的IgY的最大稀释倍数。表1.三次免疫后抗三种肠毒素特异性卵黄抗体的效价序分组—[种肠毒素抗体的效价号STaSTbLTB1pCI-ins-SLS1,6006,40025,6002pCI-upa-SLS1,2006,40020,0003pCI-SLS8003,20016,0004SLS蛋白3,20012,80051,200仔猪攻毒保护试验每组8只新生仔猪，人工饲喂牛奶而不喂母乳，实验组每天口服IOml卵黄(来自于接受免疫的母鸡产的鸡蛋)，对照组口服普通卵黄10ml，服用3天。第4天口服ETECK88菌株IXIO12CFU/头进行攻毒。此后观察10天，记录发病和死亡情况，在此期间各组饲喂普通牛奶。从10天后的仔猪存活情况看，用三价肠毒素DNA疫苗和三价肠毒素蛋白疫苗免疫蛋鸡获得的卵黄抗体都能够起到有效的保护作用，预防ETEC引起的腹泻。表2.仔猪先服用抗肠毒素IgY、再经ETEC攻毒后的存活情况序号分组存活数数存活率1pCI-ins-SLS6/875%2pCI-upa-SLS6/875%3pCI-SLS5/862.5%4SLS蛋白8/8100%5对照组1/812.5%实施例5.三价肠毒素蛋白疫苗免疫妊娠母猪对仔猪产生的被动保护作用使用如下三种疫苗(1)商品化仔猪大肠埃希氏菌病三价灭活疫苗(由K88，K99，987P三种株菌组成)(2)三价肠毒素蛋白STa-LTB-STb(SLS)(3)三价肠毒素蛋白SLS与Κ88菌毛等质量混合(SLS+K88菌毛)热洗脱法制备Κ88菌毛将Κ88菌株接种于LB液体培养基，37°C震荡培养36h。离心收集菌体，PBS重悬，置60°C水浴30min，振荡lOmin，离心取上清，用直径0.22μm滤膜过滤，滤液即为K88菌毛粗提物。将粗提物用2.5%柠檬酸调pH至4.0，4°C静置2h，4°C11000r/min离心30min，弃上清，沉淀用PBS溶解，这一过程重复三次，最终获得纯化的9K88菌毛蛋白。实验共使用12头母猪，分为4组——3个疫苗免疫组和1个对照组，每组3头。妊娠母猪在产仔前40日和15日各肌肉注射1次。免疫剂量三价灭活疫苗按说明书使用，SLS蛋白组为IOmg/头，SLS+K88菌毛组为20mg/头。产仔后取各组母猪的乳汁混合，间接ELISA法检测乳汁中抗K88菌毛、STa,STb,LTB特异性抗体的效价，具体方法同实施例4。攻毒试验各组仔猪3日龄时口服ETECK88或F41菌株1XIO12CFU/头进行攻毒。此后观察10天，各组仔猪继续服用母乳，记录发病和死亡情况。由实验结果表3可见，本发明提供的三价肠毒素蛋白STa-LTB-STb免疫妊娠母猪后，可在其乳汁中检测到高效价的三种抗毒素，仔猪摄入这样的乳汁后，使其在遭到ETEC强毒株人工感染时能够获得有效的保护，存活率达到70-80%，摄入普通母乳的对照组仔猪存活率不及10%。商品化的三价灭活疫苗对于同源菌株的感染(本例中为K88)有较好的保护率(70%)，但对于异源菌株F41感染的保护率较低(40%)。相反，SLS重组肠毒素对各种菌毛类型的菌株(本例中为K88和F41)的保护率都很高，充分说明本发明提供的三价肠毒素SLS与传统灭活疫苗相比，不受ETEC菌毛类型的限制，有更广的保护范围。将三价肠毒素SLS与菌毛蛋白混合，制备的多价疫苗对同源菌株的保护效果更好，仔猪的存活率达到90%，因而本发明提供的三价肠毒素SLS可以作为其他多价或多联疫苗的一个组分而被使用。表3.妊娠母猪乳汁中特异性抗体的效价及仔猪经攻毒后的存活情况权利要求一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体，其特征是含有3种不带信号肽序列的成熟基因不耐热肠毒素LT、耐热肠毒素STa及STb，其融合的顺序是LT居中，STa和STb在两侧，此多价融合基因是“5’STaLTSTb3’”或“5’STbLTSTa3’”。2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体，其特征在于不耐热肠毒素LT是指不耐热肠毒素LT的B亚基LTB、LTB的突变体、含有LTB抗原决定簇的基因片段或LTB的类似物霍乱毒素B亚基。3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体，其特征在于STa、LT和STb任意两个融合基因之间由超过15个核苷酸长度的连接序列连接。4.根据权利要求1、2或3所述的一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体，其特征在于3种肠毒素基因LT、STa或STb是其正常基因、突变基因、基因的片段、多个基因的串联体或多个基因片段的串联体。5.根据权利要求4所述的一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体，其特征在于在其5’端加上信号肽序列。6.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体，其特征在于所述的信号肽序列是指鸡的胰岛素的信号肽，其序列长度为72个碱基，其序列为ATGGCTCTCTGGATCCGATCACTGCCTCTTCTGGCTCTCCTTGTCTTTTCTGGCCCTGGAACCAGCTATGCA。7.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体，其特征在于所述的信号肽序列是指鸡的尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)的信号肽，其序列长度为60个碱基，其序列为ATGAAGTTAATCATCTTTCTCACAGTAACTCTCTGCACACTTGTCACAGGACTTGATTCT。8.应用权利要求1或5所述的一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体，其特征在于将它克隆至适当的真核表达载体中，制成核酸疫苗，免疫动物用于防治产肠毒素大肠杆菌引起的腹泻。9.一种产肠毒素大肠杆菌的多价融合肠毒素蛋白，其由权利要求1所述的一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体在适当的宿主细胞内表达产生。10.根据权利要求9所述的多价融合肠毒素蛋白，其特征在于单独作为疫苗使用，或者作为一个组分被加入其他多价或多联疫苗中，免疫动物或人防治由产肠毒素大肠杆菌引起的腹泻。全文摘要本发明涉及一种大肠杆菌(E.coli)三价肠毒素融合基因及其应用，属于基因工程亚单位疫苗领域。产肠毒素E.coli(ETEC)是引起幼畜及婴幼儿腹泻的主要病原，针对现有ETEC疫苗保护范围窄、不能诱导高水平抗毒素的不足，本发明设计一种三价E.coli肠毒素融合体，其融合模式为5’-STa-LT-STb-3’或5’-STb-LT-STa-3’，用这种多价肠毒素基因或蛋白免疫动物后能够诱导高水平的抗STa、STb、LT抗体的产生，因而能够中和关键致病因子肠毒素的毒性，提高免疫保护率，扩大保护范围(不受E.coli菌毛类型的限制)，从而有效防治ETEC性腹泻。文档编号C12N15/62GK101914564SQ20101023664公开日2010年12月15日申请日期2010年7月26日优先权日2010年7月26日发明者吴菲菲,尤建嵩,徐永平,李化强,李晓宇,王林会,金礼吉,马永生申请人:大连理工大学