一种溶解藻类的溶藻细菌lr5原生质体制备与再生的方法
【专利摘要】本发明一种溶解藻类的溶藻细菌LR5原生质体制备与再生的方法，牵涉到生物细胞工程里的制备原生质体与原生质体再生的【技术领域】。采用此次发明的制备与再生原生质体技术，操作简便，实验环境要求不高，可进行重复实验；在本次实验中所得到的最佳实验条件下的溶藻细菌LR5原生质体形成率是72.41%，并且再生率达到了最大值51.19%，溶藻细菌LR5原生质体形成效果一般但溶藻细菌LR5原生质体恢复细胞壁能力即再生能力较强，这为后续的溶藻细菌原生质体融合以及转化溶藻细菌构成高效溶藻功能菌做了很好的铺垫。
【专利说明】一种溶解藻类的溶藻细菌LR5原生质体制备与再生的方法
【技术领域】
[0001]此次发明牵涉到生物细胞工程里的制备原生质体与原生质体再生的【技术领域】。特别的是溶解藻类的溶藻细菌LR5原生质体制备与再生。
【背景技术】
[0002]近年来，我国频繁暴发蓝藻水华灾害，给我国带来了严重的物力与财力损失。蓝藻水华是由富营养化水体蔓延造成的。蓝藻水华灾害使大量的蓝藻覆盖在水体表面，严重阻碍了水体的流动，水体的自净能力降低，复氧率减小，透明度下降，水质恶臭，水体内的鱼、虾等浮游生物因生活环境发生恶化而死亡。现如今，我国控制水体中的蓝藻生物量依然采用传统的机械打捞，此法虽能够快速遏制小面积的蓝藻生长，但此法耗时耗力且只能去除小部分的蓝藻，大部分的蓝藻在水体内因腐烂而消失，而蓝藻危害并没有随着其消失而减弱，腐烂的蓝藻细胞破碎后就会向水体释放各种藻类毒素。所以，要找到一个可以快速、有效、安全的控制蓝藻的方法去替代传统的机械打捞。而构建具有溶藻功能的高效工程菌来控制蓝藻就成为一个新的研究前景。
[0003]使用原生质体的转化技术进行选育微生物研究中的融合重组原生质体可以同时表达两亲本菌株的优良性状，也可使隐性基因因重组而暴露表达或随机产生新的基因表达出新的性状，从而成为微生物育种的一种途径。原生质体的制备与再生是为了应用原生质体融合技术而做的铺垫，从而以便后续构建高效溶藻菌株用以处理蓝藻滋生的富营养化水体。关于原生质体的制备与再生的研究已经有报道。《西北大学学报》2002年第32卷第4期393-397页报道了郭爱莲等以木质素降解菌LI为目标菌株，通过原生质体制备与再生技术获得高效木质素降解菌。《福建师范大学学报》2011年第27卷第4期122-124页报道了叶涛等利用原生质体制备再生技术获得再生能力高的雨生红球藻菌种，对提高红球藻产量具有较大应用价值。
[0004]使用微生物控制蓝藻生长是一个高效安全的方法。国内外已有大量学者已筛选出多种溶藻菌，但现主要针对溶藻菌的溶藻机理、溶藻方式等进行研究。制备溶藻菌LR5原生质体且得到再生能力高的溶藻菌LR5原生质体，这就要求得到真实有效的溶藻菌LR5原生质体形成环境，从而为后续构建高效溶藻功能菌做好铺垫。利用原生质体育种技术提高溶藻菌处理蓝藻效率以及制备高效溶藻菌剂上的应用，国内外鲜有报道。
[0005]通过分离筛选获得溶藻细菌LR5，其对蓝藻的处理效果一般。为得到高效溶藻功能菌，有效治理蓝藻水华带来的富营养化水体污染问题，可从以下思路出发:得到再生能力高的溶藻细菌LR5原生质体形成条件，从而构建高效溶藻转基因工程菌。本方法以原生质体育种技术构建工程菌为基础，主要研究实验室已分离的溶藻功能菌LR5的原生质体制备与再生，该菌是本实验室从泥鳅中筛选出的I株具有溶藻功能的细菌。鉴于亲本LR5菌株的抗性标记工作量大，天然抗性难以确定，抗性突变亦可能使优良性状发生不定向改变，为确保亲本LR5菌株保持其各自的优良生物学特性，本研究选用灭活原生质体融合法，既减少了工作量，又保证了后续研究中融合子的质量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种溶藻细菌LR5原生质体制备与再生的方法，使得得到较高制备率与再生率的溶藻细菌LR5原生质体。
[0007]本发明所采用的技术方案如下:
一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法，按照下述步骤进行:
(1)溶藻细菌LR5菌种活化培养:
溶藻细菌菌种活化即为挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，其目的是溶藻细菌可以与呈液体的培养基充分碰触，以期望散开溶藻细菌菌落可以生长均匀。在实验中，取4 mL液体培养基，挑取一环菌进入液体培养基中，放于立式恒温振荡器(设置130 r/min, 300C )培养到溶藻细菌LR5的对数期，约为1O8-1O9个/ml ；
(2)酶解去除溶藻细菌LR5细胞壁:
提取4 ml的活化后溶藻细菌LR5置于台式离心机中，设置离心转速4000 r/min，离心时间是10分钟(实际设置时间10.30分钟)，其目的是收集溶藻细菌LR5，使用SMM缓冲液洗涤2至3次，使用1.60至1.95 mlSMM缓冲液将菌液混匀；添加0.05至1.00 mg/mL的溶菌酶0.05至0.40 ml和2 ml的质量浓度为0.4至1.2 g/L的EDTA溶液，设置水浴温度30至50°C条件下酶解15至75 min ;待到酶解结束后，再使用台式离心机(设置离心转速4500r/min，离心时间是15分钟)离心收集刚刚制得的溶藻细菌LR5原生质体，用32.14 g/L的高渗NaCl溶液洗涤菌体2至3次，将溶菌酶酶液去除后再用4 ml的32.14 g/L高渗NaCl溶液重悬。此即为制得的溶藻细菌LR5原生质体；
(3)溶藻细菌LR5原生质体再生:
提取高渗NaCl溶液重悬的溶藻细菌LR5原生质体悬浮液，用32.14 g/L质量浓度的NaCl溶液稀释到合适的两个梯度，分别吸取200 μ I菌体稀释液涂布于高渗固体培养基，其中每个梯度做两个平行样，放置于30°C恒温培养箱培养24至48 h，使得溶藻细菌LR5原生质体恢复其细胞壁，此即为溶藻细菌LR5原生质体再生。
[0008]本实验所研究的菌种即溶藻菌LR5 {Pseudomonas aerwgifliosa)是从太湖水中的泥鳅体内筛选出的I株溶解蓝藻的细菌，由鉴定得出类别是铜绿假单胞菌。此菌种已经于2013年4月26日由位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏号为CGMCC N0.7517。
[0009]上述的步骤(1)中所述的溶藻细菌LR5菌种活化操作中培养用的培养基成分展示如下:(I)普通细菌培养液:IL蒸馏水中添加牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g;其中要求调节PH为7.0至7.2 ; (2)普通细菌培养基:IL蒸馏水中添加牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、琼脂20至24 g、氯化钠5 g ;其中要求调节pH为7.0至7.2 ;此上所述的培养基据实验灭菌要求在高压灭菌锅中在121°C灭菌温度下持续灭菌20 min。
[0010]上述的步骤(3)中所述的溶藻细菌LR5原生质体恢复细胞壁，即为原生质体再生使用用的高渗固体培养基成分展示如下:800 mL蒸馏水中添加蛋白胨10 g、酵母浸出汁5g，、牛肉膏5 g、琼脂20至24 g、蔗糖170 g(0.5 mol/L);其中要求调节pH为7.0至7.2 ;此上所述的培养基根据要求在高压灭菌锅中在121°C灭菌温度下持续灭菌20 min。
[0011]上述的配制溶液成分如下:(1)高渗氯化钠溶液:1 L蒸馏水中添加氯化钠32.14go (2) SMM缓冲液:800 mL蒸馏水中添加蔗糖188.26 g、顺丁烯二酸2.3214 g、六水合氯化镁4.066 g;其中要求调节pH 6.8。(3) EDTA溶液:1 L SMM缓冲液中添加EDTA 0.6至1.2 g。(4)溶菌酶:1 mL SMM缓冲液中添加0.1 mg。上述配制的溶液根据实验要求要在高压灭菌锅中在121°C灭菌温度下持续灭菌20 min。
[0012]制备与再生溶藻细菌LR5原生质体方法优化条件:溶藻菌株培养28小时，将氯化钠作为渗透压稳定剂，采用0.75 mg/mL溶菌酶、2 mL的1.0 g/L EDTA和1.6 mL的SMM在40°C酶解30 min,就可得到最优的溶藻细菌LR5原生质体制备率与再生率，有利于后续操作中制备与再生融合子以及构建高效溶藻功能菌。 [0013]本发明的有益效果:
采用此次发明的制备与再生原生质体技术，操作简便，实验环境要求不高，可进行重复实验；在本次实验中所得到的最佳实验条件下的溶藻细菌LR5原生质体形成率是72.41%，并且再生率达到了最大值51.19%，溶藻细菌LR5原生质体形成效果一般但溶藻细菌LR5原生质体恢复细胞壁能力即再生能力较强，这为后续的溶藻细菌原生质体融合以及转化溶藻细菌构成高效溶藻功能菌做了很好的铺垫。
【具体实施方式】
[0014]一株溶解蓝藻的溶藻细菌LR5原生质体制备和再生方法创造了有利于制备溶藻细菌LR5原生质体以及提高溶藻细菌LR5原生质体能力的环境条件的方法。
[0015]以下提供本发明利用上述方法的5个实施例:
在本次发明的5个实例中都会涉及溶藻细菌LR5原生质体制备率和溶藻细菌LR5原生质体再生率的计算，现展示如下:
(I)藻细细菌LR5原生质体的制备率的计算方法
将溶菌酶酶液溶壁处理前的细胞和与溶菌酶酶液溶壁后的溶藻细菌LR5原生质体悬液均用蒸馏水稀释，放置约10 min，使刚刚制得的溶藻细菌LR5原生质体吸水胀破，再分别吸取100 μ I菌体稀释液涂布在普通细菌固体培养基平板上，每个稀释梯度做两个平行，置于30°C恒温培养箱里倒置培养24至48 h，分别计录普通细菌固体培养基平板上生长的菌落数A和B，根据下述公式计算溶藻细菌LR5原生质体制备率，从而测定溶藻细菌LR5原生质体的制备效果。
[0016]即:溶藻细菌LR5原生质体制备率(%) = (A_B)/AX 100%
A—酶解前溶藻细菌菌体个数
B—酶解后，溶藻细菌原生质体经蒸馏水涨破后的溶藻细菌个数上面公式表明:A是实验前液体细菌培养基中生长的溶藻细菌个数，B是未被原生质体化的溶藻细菌的个数，所以(A-B)就是制备出的溶藻细菌原生质体的个数。所以，溶藻细菌原生质体制备率就可以轻易得出。
[0017](2)溶藻细菌LR5原生质体的再生率的计算方法
提取制备出的溶藻细菌LR5原生质体重悬液，使用高渗氯化钠溶液稀释到适宜的两个梯度浓度，分别吸取200 μ I的溶藻细菌LR5原生质体高渗液涂布在固体高渗培养基平板上，其中每个梯度做两个平行，放置于30°C恒温培养箱培养24至48 h，计录固体高渗培养基平板上的溶藻细菌LR5原生质体再生菌落数C，根据下述公式计算溶藻细菌LR5原生质体原生质体再生率，从而测定溶藻细菌LR5原生质体的恢复细胞壁效果即再生效果。
[0018]溶藻细菌LR5原生质体再生率(%) = (C-B)/(A-B) X 100%
式中:A——总菌数，即没有经过酶解处理溶藻细菌悬浮液涂布于平板生长的菌体数量。
[0019]B—酶解后，溶藻细菌原生质体经蒸馏水涨破后的溶藻细菌个数。
[0020]C—涂布在高渗培养基上生长出的溶藻细菌个数。即为稳定剂内(含溶藻细菌原生质体)涂布在高渗培养基生长出的溶藻细菌个数。
[0021]上面公式表明:A代表是细菌培养基(液体)中生长的溶藻细菌个数。B代表是未原生质体化的溶藻细菌的个数。C代表是所有在高渗培养基上生长的溶藻细菌个数，其中高渗培养基上不但有恢复细胞壁的溶藻细菌，而且还有酶解反应不完全而未原生质体化的溶藻细菌。所以，(A-B)指的是制备出的溶藻细菌原生质体的个数，(C-B)指的是新生的溶藻细菌个数，如此以来溶藻细菌原生质体再生率就可以得出。
[0022]实施例1
将置于冰箱中保藏的溶藻细菌菌株LR5在斜面上“S，，形划线重新转接，挑取斜面上的单一溶藻细菌LR5菌落接到灭菌后的的普通细菌培养液里，放置于振荡培养箱(设置培养温度为30°C，设置培养转速130 r/min)中进行培养到对数前期(约持续培养16 h)，其中菌液密度约为IO8-1O9个/ml。使用移液枪取4 ml活化后溶藻细菌LR5菌液，使用台式离心机(设置离心转速3000 r/mi n、离心时间10 min)来收集溶藻细菌LR5菌体，用SMM缓冲溶液洗涤2次，用1.2ml的SMM缓冲液重悬；加入0.75 mg/mL的溶菌酶酶液(即加入10.00 mg/mL的溶菌酶酶液0.3 ml)和2 ml加热至酶解温度且质量浓度为0.8 g/L的EDTA溶液，在水浴锅(设置锅内温度40°C)条件下酶解30 min ;等到酶解结束后，再使用台式离心机(设置离心转速4000 r/min、离心时间15 min)来离心收集刚刚制得的溶藻细菌LR5原生质体，使用32.14 g/L的NaCl溶液洗涤2次，最后用4 ml 32.14 g/L高渗氯化钠溶液悬浮利用，此上过程所获得的溶藻细菌LR5原生质体形成率为98.00%，再生率为11.99%。
[0023]实施例2
将置于冰箱中保藏的溶藻细菌菌株LR5在斜面上“S，，形划线重新转接，挑取斜面上的单一溶藻细菌LR5菌落接到灭菌后的的普通细菌培养液里，放置于振荡培养箱(设置培养温度为30°C，设置培养转速130 r/min)中进行培养到对数后期(约持续培养28 h)，其中菌液密度约为IO8-1O9个/ml。使用移液枪取4 ml活化后溶藻细菌LR5菌液，使用台式离心机(设置离心转速4000 r/min、离心时间15 min)来收集溶藻细菌LR5菌体，用SMM缓冲溶液洗涤2次，用1.2ml的SMM缓冲液重悬；加入0.75 mg/mL的溶菌酶酶液(即加入10.00 mg/mL的溶菌酶酶液0.3 ml)和2 ml加热至酶解温度且质量浓度为0.8 g/L的EDTA溶液，在水浴锅(设置锅内温度40°C)条件下酶解30 min ;等到酶解结束后，再使用台式离心机(设置离心转速4500 r/min、离心时间15 min)来离心收集刚刚制得的溶藻细菌LR5原生质体，使用32.14 g/L的NaCl溶液洗涤2次，最后用4 ml 32.14 g/L高渗氯化钠溶液悬浮利用，此上过程所获得的溶藻细菌LR5原生质体形成率为78.33%，再生率为33.51%。
[0024]实施例3
将置于冰箱中保藏的溶藻细菌菌株LR5在斜面上“S，，形划线重新转接，挑取斜面上的单一溶藻细菌LR5菌落接到灭菌后的的普通细菌培养液里，放置于振荡培养箱(设置培养温度为30°C，设置培养转速130 r/min)中进行培养到对数后期(约持续培养28 h)，其中菌液密度约为IO8-1O9个/ml。使用移液枪取4 ml活化后溶藻细菌LR5菌液，使用台式离心机(设置离心转速4000 r/min、离心时间15 min)来收集溶藻细菌LR5菌体，用SMM缓冲溶液洗涤2次，用1.2ml的SMM缓冲液重悬；加入0.75 mg/mL的溶菌酶酶液(即加入10.00 mg/mL的溶菌酶酶液0.3 ml)和2 ml加热至酶解温度且质量浓度为0.8 g/L的EDTA溶液，在水浴锅(设置锅内温度40°C)条件下酶解30 min ;等到酶解结束后，再使用台式离心机(设置离心转速4000 r/min、离心时间15 min)来离心收集刚刚制得的溶藻细菌LR5原生质体，使用32.14 g/L的NaCl溶液洗涤2次，最后用4 ml 32.14 g/L高渗氯化钠溶液悬浮利用，此上过程所获得的溶藻细菌LR5原生质体形成率为80.00%，再生率为26.41%。
[0025]实施例4
将置于冰箱中保藏的溶藻细菌菌株LR5在斜面上“S，，形划线重新转接，挑取斜面上的单一溶藻细菌LR5菌落接到灭菌后的的普通细菌培养液里，放置于振荡培养箱(设置培养温度为30°C，设置培养转速130 r/min)中进行培养到对数后期(约持续培养28 h)，其中菌液密度约为IO8-1O9个/ml。使用移液枪取4 ml活化后溶藻细菌LR5菌液，使用台式离心机(设置离心转速4000 r/min、离心时间15 min)来收集溶藻细菌LR5菌体，用SMM缓冲溶液洗涤2次，用1.2ml的SMM缓冲液重悬；加入0.75 mg/mL的溶菌酶酶液(即加入10.00 mg/mL的溶菌酶酶液0.3 ml)和2 ml加热至酶解温度且质量浓度为0.8 g/L的EDTA溶液，在水浴锅(设置锅内温度40°C)条件下酶解30 min ;等到酶解结束后，再使用台式离心机(设置离心转速4000 r/min、离心时间15 min)来离心收集刚刚制得的溶藻细菌LR5原生质体，使用32.14 g/L的NaCl溶液洗涤2次，最后用4 ml 32.14 g/L高渗氯化钠溶液悬浮利用，此上过程所获得的溶藻细菌LR5原生质体形成率为77.92%，再生率`为35.83%。
[0026]实施例5
将置于冰箱中保藏的溶藻细菌菌株LR5在斜面上“S，，形划线重新转接，挑取斜面上的单一溶藻细菌LR5菌落接到灭菌后的的普通细菌培养液里，放置于振荡培养箱(设置培养温度为30°C，设置培养转速130 r/min)中进行培养到对数后期(约持续培养28 h)，其中菌液密度约为IO8-1O9个/ml。使用移液枪取4 ml活化后溶藻细菌LR5菌液，使用台式离心机(设置离心转速4000 r/min、离心时间15 min)来收集溶藻细菌LR5菌体，用SMM缓冲溶液洗涤2次，用1.2ml的SMM缓冲液重悬；加入0.75 mg/mL的溶菌酶酶液(即加入10.00 mg/mL的溶菌酶酶液0.3 ml)和2 ml加热至酶解温度且质量浓度为1.0 g/L的EDTA溶液，在水浴锅(设置锅内温度40°C)条件下酶解30 min ;等到酶解结束后，再使用台式离心机(设置离心转速4000 r/min、离心时间15 min)来离心收集刚刚制得的溶藻细菌LR5原生质体，使用32.14 g/L的NaCl溶液洗涤2次，最后用4 ml 32.14 g/L高渗氯化钠溶液悬浮利用，此上过程所获得的溶藻细菌LR5原生质体形成率为72.41%，再生率为51.19%。
【权利要求】
1.一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于按照下述步骤进行: (1)溶藻细菌LR5菌种活化培养: 溶藻细菌菌种活化即为挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，取4 mL液体培养基，挑取一环菌进入液体培养基中，放于立式恒温振荡器，130 r/min, 30°C培养到溶藻细菌LR5的对数期，IO8-1O9个/ml ； (2)酶解去除溶藻细菌LR5细胞壁: 提取4 ml的活化后溶藻细菌LR5置于台式离心机中，设置离心转速4000 r/min，离心时间是10分钟，使用SMM缓冲液洗涤2至3次，使用1.60至1.95 mlSMM缓冲液将菌液混匀；添加0.05至1.00 mg/mL的溶菌酶0.05至0.40 ml和2 ml的质量浓度为0.4至1.2g/L的EDTA溶液，设置水浴温度30至50°C条件下酶解15至75 min ;待到酶解结束后，再使用台式离心机；离心转速4500 r/min，离心时间是15分钟；离心收集刚刚制得的溶藻细菌LR5原生质体，用32.14 g/L的高渗NaCl溶液洗涤菌体2至3次，将溶菌酶酶液去除后再用4 ml的32.14 g/L高渗NaCl溶液重悬；此即为制得的溶藻细菌LR5原生质体； (3)溶藻细菌LR5原生质体再生: 提取高渗NaCl溶液重悬的溶藻细菌LR5原生质体悬浮液，用32.14 g/L质量浓度的NaCl溶液稀释到合适的两个梯度，分别吸取200 μ I菌体稀释液涂布于高渗固体培养基，其中每个梯度做两个平行样，放置于30°C恒温培养箱培养24至48 h，使得溶藻细菌LR5原生质体恢复其细胞壁，此即为溶藻细菌LR5原生质体再生。
2.根据权利要求1`所述的一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于所述的溶藻菌aerwgifliosa,其保藏号为CGMCC N0.7517。
3.根据权利要求1所述的一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于上述的步骤(1)中所述的溶藻细菌LR5菌种活化操作中培养用的培养基成分展示如下:(I)普通细菌培养液:IL蒸馏水中添加牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g;其中要求调节pH为7.0至7.2 ; (2)普通细菌培养基:1L蒸馏水中添加牛肉膏3 g、蛋白胨10g、琼脂20至24 g、氯化钠5 g ;其中要求调节pH为7.0至7.2 ;此上所述的培养基据实验灭菌要求在高压灭菌锅中在121°C灭菌温度下持续灭菌20 min。
4.根据权利要求1所述的一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于所述的步骤(3)中所述的溶藻细菌LR5原生质体恢复细胞壁，即为原生质体再生使用用的高渗固体培养基成分展示如下:800 mL蒸馏水中添加蛋白胨10 g、酵母浸出汁5 g，、牛肉膏5 g、琼脂20至24 g、蔗糖170 g (0.5 mol/L);其中要求调节pH为7.0至7.2 ;此上所述的培养基根据要求在高压灭菌锅中在121°C灭菌温度下持续灭菌20 min。
5.根据权利要求1所述的一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于所述的配制溶液成分如下:(1)高渗氯化钠溶液:1 L蒸馏水中添加氯化钠`3`2.14 g ;(2)SMM缓冲液:800 mL蒸馏水中添加蔗糖188.26 g、顺丁烯二酸2.3214 g、六水合氯化镁4.066 g ;其中要求调节pH 6.8 ；(3)EDTA溶液:1 L SMM缓冲液中添加EDTA 0.6至1.2 g ;(4)溶菌酶:1 mL SMM缓冲液中添加0.1 mg ;上述配制的溶液根据实验要求要在高压灭菌锅中在121°C灭菌温度下持续灭菌20 min。
【文档编号】C12R1/385GK103555621SQ201310505662
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】张文艺, 陈晶, 李仁霞, 陈雪珍, 冯国勇 申请人:常州大学