专利名称：具有溶解中肋骨条藻能力的库氏盐芽孢杆菌hsqay1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种库氏盐芽孢杆菌株HSQAYl及其应用。
背景技术：
由于水体富营养化等原因导致的赤潮灾害，对水生生态系统、水产养殖产业和人类健康造成严重影响，已经成为全球性的环境问题之一。采用硫酸铜等化学药剂可以有效抑制和杀灭赤潮藻类，但易对环境产生二次污染。利用改性粘土等物理方法可以絮凝沉淀赤潮藻，但是可能对底栖生物造成负面影响。利用溶藻细菌抑制或防治赤潮藻类具有高效快速、安全可靠，对环境负面影响小的优点，已经成为国内外赤潮防治研究的热点问题。采用微生物技术治理赤潮的关键之一便是获得具有高效溶解赤潮藻能力的优良菌株。目前，国内外对赤潮的生物防治开展了大量的研究工作，多集中在铜绿微囊藻、蓝藻和塔玛亚历山大藻等有毒藻类防治研究方面。而中肋骨条藻虽为无毒藻类，但其是广泛分布于世界各个海域的广温广盐性种类，且是我国从渤海至南海沿海的主要赤潮种类，因此，对中肋骨条藻赤潮治理的研究也更为重要。本发明所获得的溶藻细菌分泌物可高效溶解中肋骨条藻，因此，在实际应用中可发挥重要的作用。经检索专利和其它相关文献，尚未发现在好氧条件下应用库氏盐芽孢杆菌
(Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)溶解赤潮藻类-中肋骨条藻的报道；该溶藻菌
的发现对海洋细菌控藻技术的开发及探讨赤潮治理的有效方法具有重要意义
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种库氏盐芽孢杆菌株，该菌株可以高效快速的溶解中肋骨条藻；并且不会带来二次污染以及外种入侵等状况。本发明所要解决的技术问题还在于提供上述库氏盐芽孢杆菌株在降解赤潮暴发海区中的中肋骨条藻中的应用。本发明的第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的:一种库氏盐芽孢杆菌株HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAY1)，于 2012 年 6 月 12 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2012221。本发明的第二个技术问题是通过如下技术方案来实现的:上述库氏盐芽孢杆菌株HSQAYl在降解赤潮暴发海区中的中肋骨条藻中的应用。本发明的有益效果是:(I)本发明提供的库氏盐芽孢杆菌株HSQAY1，该菌株能使条链状排列的中肋骨条藻细胞断裂，而后膨胀成圆球形并最终破裂死亡，经研究发现，实际上，该菌株主要通过其代谢的活性物质来溶解中肋骨条藻；(2)本发明提供的库氏盐芽孢杆菌株HSQAYl为土著细菌，在实际应用中不会造成二次污染或外种入侵等污染情况；能够在赤潮的生物治理的实践中发挥重要作用。
图1为实施例1中正常中肋骨条藻细胞(A)及库氏盐芽孢杆菌HSQAYl(Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)作用下的中肋骨条藻(B)细胞形态显微照片；图2 为实施例 2 中库氏盐芽抱杆菌HSQAYl(Halobacillus kuroshimensisHSQAYl)的系统发育树图；图3 为实施例 3 中库氏盐芽抱杆菌HSQAYl(Halobacillus kuroshimensisHSQAYl)的透射电镜照片；图4 为实施例 5 中库氏盐芽抱杆菌(Halobacillus kuroshimensis HSQAYI)HSQAYl以10%的体积分数与中肋骨条藻混合时的藻菌数量变化图；图5 为实施例 5 中库氏盐芽抱杆菌(Halobacillus kuroshimensis HSQAYI)HSQAYl以5%的体积分数与中肋骨条藻混合时的藻菌数量变化图；图6 为实施例 5 中库氏盐芽抱杆菌(Halobacillus kuroshimensis HSQAYI)HSQAYl以1%的体积分数与中肋骨条藻混合时的藻菌数量变化图；图7为实施例5中中肋骨条藻初始密度及不同处理方式的细菌菌液作用48h的藻细胞密度图(图中相同字母表示无显著差异P>0.05)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例1中肋骨条藻海洋溶藻细菌的筛选方法1.海洋细菌的分离及纯化从深圳大鹏湾南澳赤潮爆发海域采集表层海水样品，0.7 U m玻璃纤维素膜过滤后，梯度稀释后涂布细菌分离培养基平板，28°C恒温培养48h，挑取特征差异明显的菌落划线，28°C恒温培养48h。重复以上操作两次，得到纯培养的细菌。所用的细菌分离培养基为2216E琼脂培养基，成分为:蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高铁0.lg，琼脂粉20g，陈海水1000ml, pH 7.6 8.2。2.中肋骨条藻海洋溶藻细菌的筛选从固体斜面培养基上挑取I环菌落接种于50mL细菌活化液体培养基中，28°C恒温培养48h后，获得的细菌菌液备用，所用细菌活化液体培养基为2216E海水培养基，成分为蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高铁0.lg，陈海水1000mL，pH 7.6 8.2。细菌菌液以10%的体积分数与处于对数生长期的无菌藻液(藻细胞浓度约1.0X104cells/mL)混合加到48孔细胞培养板的板孔中(每个板孔容积约1.2mL),每株菌加2个板孔作为筛选试验组(对照组以无菌海水代替细菌悬液)。用石蜡密封筛选试验的细胞培养板，置于光照培养箱中培养(温度23°C，光暗循环比llh:13h)。连续观察120h，每天用倒置显微镜(Olympus 1X70，日本)观察板孔中的藻细胞形态变化及其存活情况并拍照。所用的藻类液体培养基为 f/2 培养基:75mg NaNO3>5mg NaH2PO4 H20、20mg Na2SiO3 9H20、
4.36mg Na2EDTA、3.15mg FeCl3 6H20、0.0lmg CuSO4 5H20、0.022mg ZnSO4 7H20、
0.0lmgCoCl2 6H20、0.18mg MnCl2 4H20、0.006mg Na2MoO4 2H20，陈海水 1000ml，经脱脂棉过滤后，121°C灭菌20min后，再添加0.1 y g盐酸硫胺、0.5 u g生物素以及0.5 y gVB12。最终获得能使条链状排列的中肋骨条藻细胞断裂成单个细胞，而后单个细胞膨胀成圆球形并最终破裂死亡的溶藻细菌，图1为中肋骨条藻及该菌作用下的藻细胞形态变化显微照片，其中A图为正常中肋骨条藻细胞；图B为库氏盐芽孢杆菌株HSQAYl作用下的中肋骨条藻(B)细胞形态显微照片。实施例2库氏盐芽孢杆菌HSQAYl的系统发育树1.16S rDNA的基因序列测定采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取库氏盐芽孢杆菌HSQAYl的DNA，对基因组DNA进行电泳分析后，以其为模板进行PCR扩增，扩增的上游引物为27F:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，下游引物为1492R:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反应过程包括:98°C 预变性 5min 后，95°C 变性 35S，55°C 退火35s以及72°C延伸90s共35个循环，最后一个循环在72°C保持8min使产物延伸完整。将 PCR 产物电泳纯化后，测定其全序列。ATGCAAGTCGAGCGCGGGAAGCGAGTGGATCCCTTCGGGGTGAAGCTCGTGGAACGAGCG 60GCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGATCGGAATAACCCCGGGAAAC 120CGGGGCTAATGCCGGGTAATACTTTTCTTCGCATGAAGATAAGTTGAAAGATGGCTTCTC 180GCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCA 240AGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC 300CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGA 360GCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGTTCTGTTGTCAGGGAAGAAC 420AAGTACCGTGCGAATAGAGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGGAAGCCCCGGCTAACT 480ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA 540AAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGG 600TCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGGACAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGT 660GAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTTTCTG 720ACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG 780TAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGGCTTCCACCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATT 840AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCC 900CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT 960TGACATCCTTGGACCTCCCTAG AGATAGGGATTTCCCTTCGGGGACCAAGTGACAGGTGG 1020TGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA 1080CCCCTAATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC 1140CGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT 1200GCTACAATGGATGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGTGTAGCAAATCCCATAAAACC 1260ATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATC1320GCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC 1380ACGAGAGTTGGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAA14152.菌株的系统发育树图将库氏盐芽抱杆菌HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)的 16SrDNA基因序列同GenBank中的基因序列进行同源性比较，建立系统发育树，图2为该菌的系统发育树图。实施例3 库氏盐芽抱杆菌 HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)的菌落形态、生理和生化特征
库氏盐芽抱杆菌HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)菌落呈深黄色，圆形，不透明，边缘整齐，光滑湿润；电镜观察该菌体的形态为稍短粗杆菌，大小为(0.6
1.2) UmX (1.6 2.4) iim，有鞭毛，细胞形态见图3，生理和生化特征见表I。结合细菌的16S rDNA序列分析结果，最终确定HSQAYl为库氏盐芽孢杆菌属细菌。表I 库氏盐芽抱杆菌 HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)的生理生化特征
权利要求
1.一种库氏盐芽抱杆菌株 HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAY1),于 2012 年6月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2012221。
2.权利要求1所述的库氏盐芽孢杆菌株HSQAYl在降解赤潮暴发海区中的中肋骨条藻中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种库氏盐芽孢杆菌株HSQAY1(Halobacillus kuroshimensisHSQAY1)，于2012年6月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM2012221。还公开了该菌株在降解赤潮暴发海区中的中肋骨条藻中的应用；该菌株能使条链状排列的中肋骨条藻细胞断裂，而后膨胀成圆球形并最终破裂死亡。并且该菌株为土著细菌，在实际应用中不会造成二次污染或外种入侵等污染情况，有望在赤潮的生物治理实践中发挥重要作用。
文档编号C12N1/20GK103114050SQ20121043937
公开日2013年5月22日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年10月23日
发明者黄洪辉, 史荣君, 齐占会, 胡维安 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所