一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法
【专利摘要】本发明公开了一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，它涉及细胞工程中真菌原生质体制备与再生【技术领域】。它的具体操作步骤如下：(1)制备芦笋茎枯病菌分生孢子悬液；(2)制备新鲜菌丝体；(3)酶解菌丝细胞壁：(4)原生质体分离；(5)原生质体再生。本发明易于操作，对设备要求低，同时酶解时间及再生周期短，有效提高了原生质体制备及再生的效率。
【专利说明】ー种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是细胞工程中真菌原生质体制备与再生【技术领域】，具体涉及ー种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法。
【背景技术】
[0002]芦笑(Asparagus officinalis L.),又名石刁柏，属天门冬科天门冬属宿根性多年生草本植物，是ー种具有很高营养价值的保健型蔬菜，在国际上享有“蔬菜之王”的美誉。芦笑莖枯病是由天门冬拟莖点霉(Phmopsis asparagi)引起的世界性重要真菌病害,在美国、欧洲和澳大利亚等地区均有报道。该病主要危害莖杆或嫩笑(stems or spears),也可侵染枝梗和拟叶，初呈水溃状条斑、后渐变成暗黒色梭条形，病斑中部赤褐色凹陷，大量小黒点状分生孢子器散生其上，最终导致整株枯死并迅速传染至相邻植株。我国作为世界芦笋主产区，茎枯病发生特别严重，近年平均感染率超过50%，常导致成片绝收，已成为制约我国芦笋发展的最主要瓶颈之一，被称作“芦笋癌症”。目前，利用原生质体进行分子转化技术已成为丝状真菌转化、相关分子克隆技术和致病机制研究的重要组成部分，原生质体分子转化技术依赖于制备高效可再生的原生质体，但由于不同种类丝状真菌细胞结构，尤其是细胞壁的结构和组成存在着明显差异，因此制备原生质体的最佳条件和体系也存在着很大差异。国内外尚未见芦笋茎枯病菌的原生质体制备体系相关报道，这不利于对该病原菌进行深入的致病分子机制研究。原生质体的高效再生是后期深入研究其致病分子机制的必需条件，不同的酶解时间及稳渗剂对原生质体再生具有重要影响。为了筛选芦笋茎枯病菌致病力变异菌株，加强对其致病机制的了解，更好地为农业生产上开展抗病分子育种提供基础，需要对其原生质体制备及再生的方法进行研究。
【发明内容】
`[0003]针对现有技术上存在的不足，本发明目的是在于提供ー种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，使其原生质体的制备数最高达到2.8X 107个/ mL,再生率最高达到24.0%。
[0004]为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现:ー种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，具体操作步骤如下:
[0005](1)、制备芦笋茎枯病菌分生孢子悬液:
[0006]挑取芦笑莖枯病菌Phomopsis asparagi菌丝ー环，接种在由50mL燕麦琼脂培养基制成的固体斜面上，在温度25°C、光照12h / d条件下培养10-14d，待出现成熟的芦笋茎枯病菌分生孢子器(可分泌出分生孢子)后，加入30mL无菌蒸馏水洗孢子，得到含有孢子团块的孢子液，用移液器将该孢子液振荡打碎孢子团块，过滤，取滤液进行倍比稀释，显微镜下计数，得到浓度为1 X 106个/ mL的芦笋茎枯病菌分生孢子悬液；
[0007](2)、制备新鲜菌丝体:
[0008]将制备好的分生孢子悬液接种于液体完全培养基中，25°C条件下150r / min摇床培养72h，漏斗过滤，获得新鲜菌丝体；
[0009](3)、酶解菌丝细胞壁:
[0010]取l.0g新鲜菌丝体，加入10mL裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶的混合酶液，33°C水浴酶解 4.5h，采用 1.0mol / L MgS04(10m mol / L ρΗ6.98 的 PBS 配制，体积比为 MgS04:PBS=3:1)做滲透压稳定剂时，原生质体数量达到2.8 X107个/ mL；
[0011](4)、原生质体分离:
[0012]过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于温度4°C、转速5000r / min、离心分离5min ;弃上清液，用l_2mL浓度1.0mol / L的山梨醇溶液洗涤2_3次，收集原生质体重悬于lmL浓度1.0mol / L预冷的山梨醇溶液中保存，得到原生质体悬液；
[0013](5)、原生质体再生:
[0014]将原生质体悬液 用浓度0.6mol / L的蔗糖溶液稀释100倍，取稀释液0.lmL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂平板；温度25°C、保持相対湿度60%-75%、光照培养12h / d，培养3-5d直至长出直径约1mm再生菌落；调查再生情況，对形成的菌落记数㈧；以不含稳渗剂的PDA培养基作对照(B)。计算再生率，再生率(% ) = (A-B) X100 /总原生质体数；
[0015]所述的步骤(3)混合酶液由下列重量配比的物质组成:裂解酶15g / L、崩溃酶10g / L、蜗牛酶 15g / L、溶剂为 1.0mol / L MgS04(10m mol / LpH6.98 的 PBS 配制，体积比为MgS04:PBS=3:1)，配置好后用直径为0.45 μ m的超微微孔滤膜过滤除菌；
[0016]所述的步骤(5)中的高渗马铃薯葡萄糖琼脂培养基由下列重量配比的物质组成:马铃薯200g / L，葡萄糖20g / L，琼脂20g / L，蔗糖205g /し
[0017]本发明的有益效果是:
[0018]1.制备エ艺简单，易操作；
[0019]2.原生质体制备数最高达到1.5-2.8X107个/ mL，再生率最高达到24.0%。【具体实施方式】
[0020]为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合【具体实施方式】，进ー步阐述本发明。
[0021]本【具体实施方式】采用以下技术方案:ー种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，具体操作步骤如下:
[0022](1)、制备芦笋茎枯病菌分生孢子悬液:
[0023]挑取芦笑莖枯病菌Phomopsis asparagi菌丝ー环，接种在由50mL燕麦琼脂培养基制成的固体斜面上，在温度25°C、光照12h / d条件下培养10-14d，待出现成熟的芦笋茎枯病菌分生孢子器(可分泌出分生孢子)后，加入30mL无菌蒸馏水洗孢子，得到含有孢子团块的孢子液，用移液器将该孢子液振荡打碎孢子团块，过滤，取滤液进行倍比稀释，显微镜下计数，得到浓度为1 X 106个/ mL的芦笋茎枯病菌分生孢子悬液；
[0024](2)、制备新鲜菌丝体:
[0025]将制备好的分生孢子悬液接种于液体完全培养基中，25°C条件下150r / min摇床培养72h，漏斗过滤，获得新鲜菌丝体；
[0026](3)、酶解菌丝细胞壁:[0027]取l.0g新鲜菌丝体，加入10mL裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶的混合酶液，33°C水浴酶解 4.5h，采用 1.0mol / L MgS04(10m mol / L ρΗ6.98 的 PBS 配制，体积比为 MgS04:PBS=3: 1)做渗透压稳定剂时，原生质体数量达到2.8X 107个/ mL ；
[0028](4)、原生质体分离:
[0029]过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于温度4°C、转速5000r / min、离心分离5min ;弃上清液，用l_2mL浓度1.0mol / L的山梨醇溶液洗涤2_3次，收集原生质体重悬于lmL浓度1.0mol / L预冷的山梨醇溶液中保存，得到原生质体悬液；
[0030](5)、原生质体再生:
[0031]将原生质体悬液用浓度0.6mol / L的蔗糖溶液稀释100倍，取稀释液0.lmL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂平板；温度25°C、保持相対湿度60%-75%、光照培养12h / d，培养3-5d直至长出直径约1mm再生菌落；调查再生情況，对形成的菌落记数㈧；以不含稳渗剂的PDA培养基作对照(B)。计算再生率，再生率(% ) = (A-B) X100 /总原生质体数；
[0032]所述的步骤(3)混合酶液由下列重量配比的物质组成:裂解酶15g / L、崩溃酶10g / L、蜗牛酶 15g / L、溶剂为 1.0mol / L MgS04(10m mol / LpH6.98 的 PBS 配制，体积比为MgS04:PBS=3: 1)，配置好后用直径为0.45 μ m的超微微孔滤膜过滤除菌；
[0033]所述的步骤(5)中的高渗马铃薯葡萄糖琼脂培养基由下列重量配比的物质组成:马铃薯200g / L，葡萄糖20g / L，琼脂20g / L，蔗糖205g /し
[0034]本【具体实施方式】所述方法制备的芦笋茎枯病菌原生质体大小均一，形态近似圆形，原生质体制备数较高。丝状真菌由于其结构的特点，原生质体的分离有其独特之处，早期形成的原生质体来自菌丝尖端，`这些原生质体往往缺少细胞核，再生较困难；后期形成的原生质体来自远区细胞，形成的原生质体不均一。因此本发明采用分生孢子接种，在分生孢子充分生长为新鮮幼嫩时期的菌丝(72h)制备原生质体，为获得较高的原生质体产量提供了基础。
[0035]本【具体实施方式】所述方法菌丝细胞的原生质体产量较高，获得的原生质体活力也较高。不同的水解酶、滲透压稳定剂等对菌丝细胞壁的酶解及原生质体的形成及再生非常重要。本发明选用1.0mol / L的MgS04(10m mol / L pH6.98的PBS配制，体积比为MgS04:PBS=3:1)作为渗透压稳定剂，水解酶由裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶按一定比例混合而成，为高效制备原生质体提供了重要基础。本发明所述方法采用0.6mol / L的蔗糖高渗马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基作为再生平板，提高了原生质体的再生率。本发明所述方法制备的芦笋茎枯病菌原生质体制备数最高能达到2.8X107f/ mL，再生率最高为24.0%。
[0036]本【具体实施方式】与超声波法等原生质体制备方法相比较，本发明所述方法易于操作，对设备要求低，同时酶解时间及再生周期短，有效提高了原生质体制备及再生的效率。
[0037]本发明所述芦笋茎枯病菌原生质体制备及再生方法原生质体制备数高，再生率较高，是芦笋茎枯病菌原生质体制备及再生的可靠方法，并为拟茎点霉菌原生质体制备及再生提供技术參考。本发明为原生质体的制备与再生提供了ー种具有实际意义操作方法，为进ー步的采用原生质体转化技术研究芦笋茎枯病菌致病分子机制提供了基础。
[0038]实例ー:收集燕麦固体培养基上(0A)的分生孢子器产生的分生孢子，并接种于完全液体培养基中(CM)，25°C条件下150r / min摇床培养36h，获得新鲜菌丝体，采用1.5%裂解酶、1.0%崩溃酶1.5%蜗牛酶的混合酶:pH6.00，在30°C水浴酶解3.0h，用1.0mol / LMgS04(10m mol / LPBS配制，体积比为MgS04:PBS=3:1)做渗透压稳定剂；将原生质体悬液用浓度0.6mol / L的蔗糖溶液稀释100倍，取稀释液0.lmL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂平板于25°C下培养3-5d，原生质体数量达到1.7 X 107个/ mL,再生率为22.0%。
[0039]实例ニ:收集燕麦固体培养基上(0A)的分生孢子器产生的分生孢子，并接种于完全液体培养基中(CM)，25°C条件下150r / min摇床培养48h，获得新鲜菌丝体，采用1.5%裂解酶、1.0%崩溃酶1.5%蜗牛酶的混合酶:pH7.60，在35°C水浴酶解4.0h，用1.0mol / LMgS04(10m mol / LPBS配制，体积比为MgS04:PBS=3:1)做渗透压稳定剂；将原生质体悬液用浓度0.6mol / L的蔗糖溶液稀释100倍，取稀释液0.lmL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂平板于25°C下培养3-5d，原生质体数量达到2.2 X 107个/ mL,再生率为22.5%。
[0040]实例三:收集燕麦固体培养基上(0A)的分生孢子器产生的分生孢子，并接种于完全液体培养基中(CM)，2 5°C条件下150r / min摇床培养72h，获得新鲜菌丝体，采用1.5%裂解酶、1.0%崩溃酶1.5%蜗牛酶的混合酶:pH6.98，在33°C水浴酶解4.5h，用1.0mol / LMgS04(10m mol / LPBS配制，体积比为MgS04:PBS=3:1)做渗透压稳定剂；将原生质体悬液用浓度0.6mol / L的蔗糖溶液稀释100倍，取稀释液0.lmL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂平板于25°C下培养3-5d，原生质体数量达到2.8 X 107个/ mL,再生率为24.0%o
[0041]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【权利要求】
1.ー种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，其特征在于，具体操作步骤如下: (1)、制备芦笋茎枯病菌分生孢子悬液: 挑取芦笑莖枯病菌Phomopsis asparagi菌丝ー环，接种在由50mL燕麦琼脂培养基制成的固体斜面上，在温度25°C、光照12h / d条件下培养10-14d，待出现成熟的芦笋茎枯病菌分生孢子器(可分泌出分生孢子)后，加入30mL无菌蒸馏水洗孢子，得到含有孢子团块的孢子液，用移液器将该孢子液振荡打碎孢子团块，过滤，取滤液进行倍比稀释，显微镜下计数，得到浓度为1 X 106个/ mL的芦笋茎枯病菌分生孢子悬液； (2)、制备新鲜菌丝体: 将制备好的分生孢子悬液接种于液体完全培养基中，25°C条件下150r / min摇床培养72h，漏斗过滤，获得新鲜菌丝体； (3)、酶解菌丝细胞壁: 取l.0g新鲜菌丝体，加入10mL裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶的混合酶液，33°C水浴酶解4.5h，采用 1.0mol / L MgS04(10m mol / L ρΗ6.98 的 PBS 配制，体积比为 MgS04:PBS=3: 1)做滲透压稳定剂时，原生质体数量达到2.8X 107个/ mL ; (4)、原生质体分 离: 过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于温度4°C、转速5000r / min、离心分离5min ;弃上清液，用l_2mL浓度1.0mol / L的山梨醇溶液洗涤2_3次，收集原生质体重悬于lmL浓度1.0mol / L预冷的山梨醇溶液中保存，得到原生质体悬液； (5)、原生质体再生: 将原生质体悬液用浓度0.6mol / L的蔗糖溶液稀释100倍，取稀释液0.lmL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂平板；温度25°C、保持相対湿度60%-75%、光照培养12h / d，培养3-5d直至长出直径约1mm再生菌落；调查再生情況，对形成的菌落记数(A);以不含稳渗剂的PDA培养基作对照(B)。计算再生率，再生率(% ) = (A-B) X100 /总原生质体数。
2.根据权利要求1所述的ー种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，其特征在干，所述的步骤(3)混合酶液由下列重量配比的物质组成:裂解酶15g / L、崩溃酶10g / L、蜗牛酶 15g / L、溶剂为 1.0mol / L MgS04(10m mol / L ρΗ6.98 的 PBS 配制，体积比为 MgS04:PBS=3:1)，配置好后用直径为0.45 μ m的超微微孔滤膜过滤除菌。
3.根据权利要求1所述的ー种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，其特征在干，所述的步骤(5)中的高渗马铃薯葡萄糖琼脂培养基由下列重量配比的物质组成:马铃薯200g / L,葡萄糖20g / L,琼脂20g / L,鹿糖205g /し
【文档编号】C12N1/14GK103451110SQ201310382669
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月21日 优先权日:2013年8月21日
【发明者】张岳平, 陈光宇, 罗绍春, 周劲松, 汤泳萍, 黄燕萍 申请人:江西省农业科学院蔬菜花卉研究所