专利名称：一种大白菜真叶离体再生培养方法
技术领域：
本发明属于农业技术领域的培养方法，特别是一种以大白菜真叶为外植体的不定 芽诱导和植株再生的培养方法。
背景技术：
大白菜起源于我国，南北都有种植，具有悠久的栽培历史，是人们生活中不可缺少 的一种重要蔬菜，味道鲜美，营养丰富，素有“菜中之王”的美称，为广大群众所喜爱。通过基因工程技术创新大白菜种质和新品种具有直接、快速和针对性强的优点。 建立高效稳定的再生体系是大白菜遗传转化的前提，同芸薹属其它作物相比，大白菜属十 字花科AA基因组型作物，而A基因组型对再生芽的抑制效应较大，主要存在材料特异性 强、重复性差、周期长和再生频率低等问题，制约转基因技术在大白菜种质和品种改良上的 应用。前人报道了大白菜子叶(杜红等，2000 ；邢德峰等，2003 ；张艳萍等，2005 ；屈会玲等， 2007)、子叶-子叶柄(曹家树等，2000 ；赵军良等，2004 ；张艳萍等，2005 ；于占东等，2005 ； 邓永玲等，2008 ；范爱丽等，2009 ；马茜等，2009)、下胚轴(邢德峰等，2003 ；卢永恩等，2003 ； 朱丽华等，2005 ；张晓东等，2010)、花相关组织(孙保娟等，2005 ；王小霞等，2007 ；李丹等， 2009)、小孢子(蒋武生等，2005 ；耿建峰等，2007 ；张亚丽等，2009 ；潘洪艳等，2009 ；付文婷 等，2010)和原生质体(侯喜林等，2000;赵军良等，2005)等直接分化再生、愈伤组织再生、胚 状体再生和原生质体再生等多种途径。其中以子叶段离体繁殖为最常用途径，然而报道中 芽诱导培养基添加物种类繁多，甚至为提高芽分化率还添加了 AgNO3、Co (NO3) 2、CoCl2, GA3 、ABA等物质；而且采用的外植体苗龄大小差异很大，3 15d不等；外植体切割方式报道也 很不一致。在真叶再生方面研究较少，成细华等2001年采用北京80号和No. 10为试材， 取3周苗龄无菌苗顶端2-3片真叶，切割成0. 2-0. 4cm见方，平铺于培养基上进行培养，通 过愈伤组织获得了再生植株；Saba Ambreen Memon等2009年采用生育期2个月的成株不 结球白菜顶部第二片真叶，切割成1. 25X 1. 25cm的小块培养获得了再生植株。但利用带柄 真叶培养直接再生植株的方式尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以真叶为外植体的大白菜离体再生培养方法，丰富大 白菜离体再生途径。该方法有效的解决了大白菜离体再生培养程序复杂、培养周期长等问 题，填补了白菜带柄真叶直接再生植株的空白。为了实现上述任务，本发明采取的技术方案是
一种大白菜真叶离体再生培养方法，其特征在于，按下列步骤进行 1)挑选籽粒饱满的大白菜种子，在无菌条件下，先用体积百分比为70%的酒精表面杀 菌0. 5min lmin，再用质量浓度为3%的NaClO溶液灭菌13 15min，然后用无菌水反复 冲洗4 5次，每次5 min ；最后将种子播种于常规的1/2MS基本培养基的表面，在温度为 25士 1°C，光照时间16h/d，光照强度20001x的条件下培养；2)当培养9 10d，幼苗生长直立后，选择生长健壮且第一片真叶完全展开，第二片真 叶刚露出的植株，在其真叶柄基部和下胚轴交接处即生长点处横切，使切口处靠近生长点， 但不保留生长点，并保持切口平滑，选择第一片真叶为外植体；
3)将该真叶以真叶柄的下端竖直向下插入装有1号培养基的培养瓶中，并使真叶柄的 下端与瓶底保持0. 15cm的距离，且勿使外植体与1号培养基相接触，以免外植体玻璃化，在 温度25°C 士 1°C，光照时间16h/d，光照强度20001x的条件下培养9d 10d，当外植体的不 定芽生长至0. 8cm时，将外植体取出，在距原切口处0. 8cm处切下，保留再生芽和部分外植 体，随后将其再生芽朝上，外植体切开部分向下再竖直插入装有1号培养基的培养瓶中，在 温度25°C 士 1°C，光照时间16h/d，光照强度20001x的条件下复壮培养IOd 12d，再生芽 生出丛生芽；
4)将丛生芽的各个芽点切开，转入装有2号培养基的培养瓶中生根，待幼苗基部形成 大量的毛根后，炼苗5d 6d，取出幼苗植株，洗净根部的2号培养基，移栽到装有体积比 为珍珠岩草炭为1 3混合基质营养钵中，用塑料薄膜保湿7d，然后逐渐揭去塑料薄膜， IOd 15d即可入土栽培。本发明以大白菜真叶为外植体，从适宜苗态、切割方式和接种方式及添加6-BA与 NAA两个激素浓度几个方面，优化了大白菜离体植株再生体系，为大白菜转基因研究奠定基 石出。本发明的大白菜再生培养方法是在传统大白菜组织培养的基础上，首次对真叶末 端切割方式和插入方式以及对再生芽在培养基上进行复壮培养的方法等进行研究，优化了 大白菜真叶离体再生体系，使培养方法简单、易操作、成本低；同时，培养出来的不定芽数 量多、质量好、健壮、没有畸形，再生率高，再生周期短，为获得大白菜转基因的受体新材料 提供了新的途径，对利用现代基因工程技术创新大白菜种质和新品种将具有重要的现实意 义。
图1是橙色大白菜06E8种子于1/2MS基本培养基表面萌发图片；
图2是橙色大白菜06E8幼苗直立生长，第一片真叶完全展开，第二片真叶刚露出时 植株(播种8 IOd左右)图片；
图3是橙色大白菜06^8第一片真叶为外植体，接种在培养基中图片； 图4是橙色大白菜06E8第一片真叶为外植体，接种在培养基中(底部)图片； 图5是橙色大白菜06E8真叶经1号培养基培养IOd后的结果图片； 图6是橙色大白菜06E8真叶再生芽经1号培养基培养9d后的结果图片； 图7是橙色大白菜06E8真叶再生芽复壮培养后，经切割后转入生根培养基后的结果 图片；
图8是橙色大白菜06E8再生植株移栽到装有混合基质的营养钵中后的结果图片。图9是橙色大白菜06E8真叶再生芽经1号培养基复壮培养后的结果图片； 图10是橙色大白菜06E8真叶再生芽未经1号培养基复壮培养后的结果图片； 图11是普通大白菜92S105真叶在1号培养基上培养15d后的结果图片；
图12是普通大白菜92S105真叶再生芽在2号培养基上培养15d后结果图片；图13是普通大白菜01S10M真叶在1号培养基上培养15d后结果图片； 图14是普通大白菜06J31真叶在1号培养基培养5d后结果图片。以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式按照本发明的技术方案，本发明的大白菜真叶离体再生培养方法，按照下列步骤 进行
1)挑选籽粒饱满的大白菜种子，无菌条件下，先用体积百分比为70%的酒精表面杀菌 约0. 5 lmin，再用质量浓度3%的NaClO溶液灭菌13 15min，然后用无菌水反复冲洗 4 5次，每次5min。最后将种子播种于常规的1/2MS基本培养基表面，在温度为25士 1°C， 光照时间16h/d，光照强度20001x的条件下培养(图1)；
2)当播种9 IOd左右，幼苗生长直立后，选择生长健壮且第一片真叶完全展开，第二 片真叶刚露出的植株(图2)，在其真叶柄基部和下胚轴交接处(即生长点处)横切，使切口处 尽量靠近生长点(但不能保留其生长点)并保持切口平滑，选择第一片真叶为外植体(图3、 图4)；
3)将该真叶以真叶柄的下端竖直向下插入装有1号培养基的培养瓶中，并保持真叶 柄的下端与瓶底0. 15cm左右的距离(注意勿使真叶片与1号培养基接触，以免外植体玻 璃化)(图3、图4)，在温度25°C 士 1°C，光照时间16h/d，光照强度20001x的条件下培养培 养9 17d (图7)，当不定芽长到0.8cm 1 .5mm时(图5)，将外植体取出，在距原切口处 0. 8cm左右处切下，保留再生芽和部分外植体，随后将其再生芽向上，外植体切口部分向下， 再竖直插入装有1号培养基的培养瓶中培养，在温度25°C 士 1 °C，光照时间16h/d，光照强度 20001x的条件下培养培养10 12d后(图6、图7)，再生芽生出丛生芽。4)将丛生芽的各个芽点切开，然后转入装有2号培养基的培养瓶中生根。待幼 苗基部形成大量的毛根后，炼苗5 6d，取出幼苗植株，洗净根部培养基，移栽到装有珍珠 岩草炭体积比为1 3混合基质的营养钵中，用塑料薄膜保湿7d，然后逐渐揭去塑料薄 膜，10 15d即可将幼苗植株取出入土栽培(图8)。表1 常规的MS基本培养基由组成如下
权利要求
1.一种大白菜真叶离体再生培养方法，其特征在于，按照下列步骤进行1)挑选籽粒饱满的大白菜种子，在无菌条件下，先用体积百分比为70%的酒精表面杀 菌0. 5min lmin，再用质量浓度为3%的NaCHO溶液灭菌13 15min，然后用无菌水反复 冲洗4 5次，每次5 min ；最后将种子播种于常规的1/2MS基本培养基的表面，在温度为 25士 1°C，光照时间16h/d，光照强度20001x的条件下培养；2)当培养9 10d，幼苗生长直立后，选择生长健壮且第一片真叶完全展开，第二片真 叶刚露出的植株，在其真叶柄基部和下胚轴交接处即生长点处横切，使切口处靠近生长点， 但不保留生长点，并保持切口平滑，选择第一片真叶为外植体；3)将该真叶以真叶柄的下端竖直向下插入装有1号培养基的培养瓶中，并使真叶柄的 下端与瓶底保持0. 15cm的距离，且勿使外植体与1号培养基相接触，以免外植体玻璃化，在 温度25°C 士 1°C，光照时间16h/d，光照强度20001x的条件下培养9d 17d，当外植体的不 定芽长在0. 8cm 1 . 5mm时，将外植体取出，在距原切口处0. 8cm处切下，保留再生芽和部 分外植体，随后将其再生芽朝上，外植体切开部分向下再竖直插入装有1号培养基的培养 瓶中，在温度25°C 士 1°C，光照时间16h/d，光照强度20001x的条件下复壮培养IOd 12d， 再生芽生出丛生芽；4)将丛生芽的各个芽点切开，转入装有2号培养基培养瓶中生根，待幼苗基部形成大 量的毛根后，炼苗5d 6d，取出幼苗植株，洗净根部的2号培养基，移栽到装有体积比为 珍珠岩草炭为1 3混合基质营养钵中，用塑料薄膜保湿7d，然后逐渐揭去塑料薄膜， IOd 15d即可入土栽培。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的1号培养基是在常规的MS基本培养 基中加入 4. OOmg. L_16-BA 和 0. 14mg. L^1NAA 组成。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的2号培养基是在常规的1/2MS基本培 养基中加入1. Omg. L-1IBA组成。
全文摘要
本发明公开了一种大白菜真叶离体再生培养方法，该方法在传统大白菜组织培养的基础上首次采用了以真叶为外植体，从适宜苗态、切割方式和接种方式及激素浓度几个方面，优化了大白菜真叶离体再生体系。该培养方法仅需在常规的MS基本培养中添加6-BA和NAA，方法简单、易操作；同时，培养出来的不定芽数目多、质量好、健壮、没有畸形，再生率高，再生周期短。为获得大白菜转基因的受体新材料提供了新的途径，对利用现代基因工程技术创新大白菜种质和新品种将具有重要的现实意义。
文档编号A01H4/00GK102144561SQ20111004559
公开日2011年8月10日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者刘学成, 张明科, 张鲁刚, 惠麦侠, 李海萍, 茹磊 申请人:西北农林科技大学