斜带石斑鱼orexin-A在调控石斑鱼糖代谢中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了斜带石斑鱼orexin-A在调控石斑鱼糖代谢中的应用。本发明通过研究发现orexin-A基因对石斑鱼糖代谢具有调控功能。在发现糖代谢功能的基础上，本实验室利用大肠杆菌原核表达系统获得了大量粗提级别的重组石斑鱼orexin-A，并将其添加到石斑鱼饲料中进行生理实验研究其对石斑鱼生长的影响；利用本发明可以获得来源稳定、成本低廉的石斑鱼orexin-A重组蛋白，并进一步制备适合海水鱼类使用的鱼类促生长剂或添加剂。
【专利说明】斜带石斑鱼orex i n-A在调控石斑鱼糖代谢中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及斜带石斑鱼orexin-A在调控石斑鱼糖 代谢中的应用。具体应用为将石斑鱼orexin-A用于制备鱼苗苗种促生长剂或饲料添加剂。
【背景技术】
[0002] 斜带石斑鱼orexin-A (又称为食欲肽）是由43个氨基酸组成的蛋白质。Orexin 是1998年在哺乳动物中发现的新型下丘脑神经肽，分为orexin-A和orexin-B两种，是来 源于同一个orexin前体信使RNA经过不同剪接、翻译后的产物。斜带石斑鱼Orexin-A含有 一对二硫键，由第7位与第14位的半胱氨酸构成，蛋白大小约为4. 7Kda，其序列与结构与哺 乳动物orexin-A类似，哺乳动物orexin-A由33个氨基酸及两对链内二硫键构成，蛋白大 小约为3. 6kda。近年来，鱼类的orexin-A相继被克隆出来，其中包括斜带石斑鱼、鳟鱼、鳕 鱼、罗非鱼、青鏘及斑马鱼等，在基因序列与氨基酸序列的同源性上，斜带石斑鱼orexin-A 与其他的鱼类的同源性高于哺乳动物，表现出在鱼类中较高的保守性。
[0003] 目前，对于鱼类orexin-A功能及应用的研究很少，对于哺乳动物及鱼类中的 orexin-A研究主要集中在orexin-A对摄食、体重的调控及睡眠觉醒的调控方面，哺乳 动物中近年来已经陆续有研究表明orexin-A可以调控机体代谢，而在鱼类研究中针对 orexin-A对于糖代谢调控方面的研究则未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏有效促进石斑鱼苗种生长 的饵料添加剂的缺陷，提供斜带石斑鱼orexin-A基因在调控石斑鱼糖代谢中的应用。
[0005] 本发明的另一个目的是提供斜带石斑鱼orexin-A蛋白在制备石斑鱼鱼苗苗种促 生长剂或饲料添加剂中的应用。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 斜带石斑鱼orexin-A基因在调控石斑鱼糖代谢中的应用。本发明通过研究发现，用人 工合成超纯级别重组斜带石斑鱼orexin-A进行腹腔注射斜带石斑鱼，结果展示，重组斜带 石斑鱼orexin-A以葡萄糖依赖性刺激石斑鱼的糖代谢。
[0007] 本发明用于表达斜带石斑鱼orexin-A的基因片段是以斜带石斑鱼下丘脑总RNA 反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，它来源于斜带石斑鱼下丘脑cDNA上 的前体orexin-A片段。按照上述的斜带石斑鱼orexin-A重组蛋白基因序列，它正好是斜 带石斑鱼orexin-A前体基因 139bp至267bp (相当于1位至43位氨基酸）的片段，其核苷 酸序列及其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO :1?2所示。
[0008] 本发明通过研究发现：斜带石斑鱼orexin-A基因可以以葡萄糖依赖的特性刺激 上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白glut-Ι或glut-4的表达量。所以，本发明还保护斜带 石斑鱼orexin-A基因在上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白glut-Ι或glut-4表达量中的 应用。
[0009] 本发明提供斜带石斑鱼orexin-A蛋白在制备石斑鱼鱼苗苗种促生长剂或饲料添 加剂中的应用。本发明将高效表达并进行粗提纯的重组斜带石斑鱼orexin-A蛋白作为饲 料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗，实验结果展示：饲料中添加重组斜带石斑鱼orexin-A蛋白 能够显著性的促进石斑鱼鱼苗的生长。
[0010] 石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属飽科（Serranidae)，石斑鱼属（Epinephelus)，有30 多种。石斑鱼是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值和营养价值。石斑鱼的苗种培 育是养殖生产持续发展的关键，但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其苗种 生长的饵料添加剂。
[0011] 一种石斑鱼种苗促生长剂或饲料添加剂，所述促生长剂或饲料添加剂中含有有效 剂量的重组斜带石斑鱼orexin-A蛋白。 本发明的有益效果是： 本发明通过研究发现orexin-A基因对石斑鱼糖代谢具有调控功能，具体为斜带石斑 鱼orexin-A基因可以以葡萄糖依赖的特性刺激上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白glut-1 或glut-4的表达量。所以，将orexin-A蛋白作为良好的添加剂加入饲料中，显著性的促进 石斑鱼鱼苗的生长。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1.以斜带石斑鱼下丘脑总RNA反转录得到的cDNA为模板的orexin-A基因中 间片段PCR扩增产物的凝胶电泳分析图，其中：M.分子量标准；I. PCR扩增产物。
[0013] 图2.重组质粒PCR和酶切鉴定凝胶电泳分析图，其中：M1、M2.分子量标准；1. PCR鉴定；2. J与班JJJ双酶切鉴定。
[0014] 图3.重组斜带石斑鱼orexin-A基因表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳图谱，其中M 是蛋白分子量，泳道广4是不同批次的诱导后表达产物，泳道5飞是未诱表达产物。
[0015] 图4.重组斜带石斑鱼orexin-A基因表达产物的Western Blot图谱，其中泳道 1飞是不同批次诱导后表达产物。
[0016] 图5.重组斜带石斑鱼orexin-A飞行时间质谱MS/MS检测一级质谱结果。
[0017] 图6.重组斜带石斑鱼orexin-A飞行时间质谱MS/MS检测二级质谱结果。
[0018] 图7.对斜带石斑鱼腹腔注射orexin-A对肝脏组织glut-Ι表达量的影响。
[0019] 图8.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A与葡萄糖对肝脏组织glut-Ι表达量的 影响。
[0020] 图9.对斜带石斑鱼腹腔注射orexin-A对肝脏组织glut-4表达量的影响。
[0021] 图10.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A与葡萄糖对肝脏组织glut-4表达量的 影响。
[0022] 图11.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A对肌肉组织glut-Ι表达量的影响。
[0023] 图12.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A与葡萄糖对肌肉组织glut-Ι表达量的 影响。
[0024] 图13.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A对肌肉组织glut-4表达量的影响。
[0025] 图14.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A与葡萄糖对肌肉组织glut-4表达量的 影响。
[0026] 图15. orexin-A蛋白作为饲料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗对石斑鱼体重的影响。
[0027] 图16. orexin-A蛋白作为饲料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗对石斑鱼肝、肌糖原的 影响。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发 明采用的试剂、设备为本【技术领域】常规试剂和设备。
[0029] 实施例1 :斜带石斑鱼orexin-A基因的合成与表达载体的构建 根据已发表的石斑鱼前体orexin的cDNA序列，以与斜带石斑鱼下丘脑的cDNA 全序列为引物设计模板，设计合成一对特异性引物并且加入了保护碱基，上游引 物 F 的序列为：5' - CGGGATCCGCACAGCGTGTCTGAGTGC-3'，下游引物 R 的序列为：5' -CCCAAGCTTCAGGGTGAGAATGCCAGC-3'。PCR反应是以斜带石斑鱼下丘脑总RNA反转录得到的 cDNA为模板，经PCR方法扩增orexin-A序列，反应条件为：95°C预变性5分钟；下边为38 个循环，分为95°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸15秒，共40个循环；PCR扩增产 物的电泳鉴定图见图1。从图1可见第一次PCR扩增了一段长约150bp的序列。将目的条 带用 E. Z. N. A. ? Gel Extraction Kit 回收。
[0030] 质粒pET22b+与orexin-A PCR胶回收产物经限制酶及丽7 J与班JJJ双酶切 后，酶切产物用E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit回收。胶回收后的orexin-A基因片段与 载体片段按3:1混合，用MBI T4连接酶22°C连接16小时后用标准氯化钙转化法转入大肠 杆菌DH5 α中，筛选具氨苄青霉素抗性的转化子，以标准方法提取质粒，筛选大小约5. 4kb 的重组质粒，用限制酶及_7 /与///双酶切重组质粒，得到150bp和5. 4kb的两个 片段，大小分别与斜带石斑鱼orexin-A基因和表达载体pET22b+大小相同，证明斜带石斑 鱼orexin-A基因已克隆入大肠杆菌表达载体pET22b+中，将重组质粒pET22b-〇rexin_A用 pET22b的一对通用引物进行序列测定，测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克 隆的PCR产物是斜带石斑鱼orexin-A基因，重组质粒命名为pET22b-〇rexin_A。质粒构建 与酶切分析图见图2。
[0031] 实施例2 高效表达斜带石斑鱼orexin-A的大肠杆菌重组株pET22b-〇rexin-A-0rigami的构建 CaCl2法将pET22b-〇rexin-A转化Origami 2 (DE3)，在含氨苄青霉素、链霉素及四环素 的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含pET22b-〇rexin-A的重组转化子 pET22b-〇rexin_A-〇rigami 〇
[0032] 实施例3 : 利用大肠杆菌基因工程菌pET22b-〇rexin-A_0rigami生产重组斜带石斑鱼orexin-A : 挑取大肠杆菌基因工程菌pET22b-〇rexin-A-0rigami单菌落接种在含有100ug/ml氨节青 霉素、50ug/ml链霉素、25ug/ml四环素的LB液体培养基中，37°C，200转/分培养过夜，次日 按1:50接种量接种于适当体积的相同培养基中，37°C培养至八_为0. 5?0. 6,加入IPTG (终浓度为〇. 8mmol/l)和20%葡萄糖(终浓度为0. 2%)，于37°C诱导培养6小时后收菌。 合成的斜带石斑鱼胚胎期orexin-A在大肠杆菌基因工程菌pET22b-〇rexin-A-0rigami中 已获得商效表达。
[0033] 取少量细胞加2X电泳上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶 电泳。结果见图9,显示经诱导的pET22b-〇rexin-A_0rigami在约7kD的位置上出现一 条新的蛋白带，未诱导的pET22b-〇rexin-A-0rigami不出现此带，证明斜带石斑鱼胚胎期 orexin-A 已在 pET22b-〇rexin_A-〇rigami 中诱导表达，见图 3。
[0034] 将重组斜带石斑鱼胚胎期orexin-A采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫 活性鉴定。一抗为兔抗His标签单克隆抗体，二抗为羊抗兔IgG-AP。结果见图4,显示兔抗 His标签单克隆抗体能识别我们用大肠杆菌表达的融合orexin-A蛋白。
[0035] 将SDS-PAGE上的蛋白进行点靶后进行时间飞行质谱MS/MS检测，检测结果表明目 标蛋白与预期蛋白完全匹配，见图5、6。结合pET22b-〇rexin_A重组子的DNA测序结果，证 明得到的蛋白是重组斜带石斑鱼orexin-A。
[0036] 实施例4 用人工合成超纯级别重组斜带石斑鱼orexin-A进行腹腔注射斜带石斑鱼并测定 orexin-A对石斑鱼糖代谢调控功能的检测。
[0037] 实验用石斑鱼驯养于循环海水养殖池中，自然光照，每天早7:00和晚6:00分别进 行饱食投喂，驯养两周，在注射实验进行前，对实验用鱼进行饥饿3天处理。对于orexin-A 注射组，实验鱼随机分成4组，每组44条，分别注射0ng/g B.W.、10ng/g B.W.、100ng/g B.W.、1000ng/g B.W.的0ΧΑ，0ΧΑ用PBS稀释，对照组0ng/g B.W.注射PBS。每组注射后 0h、2h、4h、6h取肝脏、肌肉（白肌)，液氮速冻，保存于-80°C备用。对于orexin-A+葡萄糖注 射组，实验鱼随机分成4组，每组44条，分别注射0ng/g B.W.、10ng/g B.W.、100ng/g B.W.、 1000ng/g B. W.的0ΧΑ，OXA用0. 002 g/g的葡萄糖（PBS溶解）溶液稀释，对照组0ng/g B.W.注射0.002 g/g B.W.的葡萄糖。每组注射后011、211、411、611取肝脏、肌肉（白肌)，液氮 速冻，保存于-80 °C备用。
[0038] 所取样本参照Trizol Reagent (Invitrogen, Inc.)说明书进行RNA提取，参照 Toyobo FSK-100试剂盒说明书进行反转录，参照Toyobo SYBR-Green说明书进行实时突光 定量PCR检测相关基因的表达量变化。试验结果如图7、8、9、10、11、12、13、14。Orexin-A在 肝脏、肌肉中均以葡萄糖依赖的特性刺激葡萄糖转运蛋白glut-1，glut-4的表达量上调。
[0039] 实施例5 orexin-A蛋白作为饲料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗对石斑鱼生长特性的影响 实验用斜带石斑鱼购自广东省大亚湾养殖示范基地，共480尾，体重平均为50g，体长 平均15cm。驯养于循环海水养殖池中，自然光照，每天早7:00和晚6:00分别进行饱食投 喂，驯养两周。驯化完成后，条件与驯化时期相同，在投喂前进行蛋白喷洒，使蛋白均匀喷洒 到饲料表面，投喂前后进行饲料称重记录。长期投喂添加重组Orexin-A的饲料对斜带石斑 鱼体重的影响见图15,对照组投喂喷洒灭菌超纯水的常规含糖饲料，实验组在常规含糖饲 料的基础上添加不同剂量的重组Orexin-A，实验连续投喂6周，所得数据用标准差土标准 误来表示（n=40)，标记星号表示实验组与对照组相比产生的显著性差异水平，显著性结果 通过单因素方差分析得到，采用Duncan分析方法f P〈0. 05)。统计结果通过SPSS19. 0软件 分析得到。
[0040] 长期投喂添加重组Orexin-A的饲料对斜带石斑鱼血糖和肝肌糖原的影响见图 16,对照组投喂喷洒灭菌超纯水的常规含糖饲料，实验组在常规含糖饲料的基础上添加不 同剂量的重组Orexin-A，实验连续投喂6周后取血清、肝脏、肌肉样本分析血糖和肝肌糖 原含量。所得数据用标准差土标准误来表示（n=40)，标记星号表示实验组与对照组相比 产生的显著性差异水平，显著性结果通过单因素方差分析得到，采用Duncan分析方法C P〈0. 05)。统计结果通过SPSS19. 0软件分析得到。
【权利要求】
1. 斜带石斑鱼orexin-Α基因在调控石斑鱼糖代谢中的应用。
2. 斜带石斑鱼orexin-A蛋白在制备石斑鱼苗种促生长剂或饲料添加剂中的应用。
3. -种石斑鱼种苗促生长剂或饲料添加剂，其特征在于，所述促生长剂或饲料添加剂 中含有有效剂量的重组斜带石斑鱼orexin-A蛋白。
4. 斜带石斑鱼orexin-A基因在上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白glut-Ι或glut-4 表达量中的应用。
5. 根据权利要求4所述应用，其特征在于，orexin-A基因是以葡萄糖依赖的特性刺激 上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白glut-Ι或glut-4的表达量。
【文档编号】A23K1/16GK104212807SQ201410357846
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】李文笙, 张聪 申请人:中山大学